Summary
De huidige methoden voor het analyseren van de intracellulaire dynamiek van gepolariseerde eencellige cellen zijn vaak handmatig en missen standaardisatie. Dit manuscript introduceert een nieuwe beeldanalysepijplijn voor het automatiseren van middellijnextractie van enkele gepolariseerde cellen en het kwantificeren van spatiotemporeel gedrag van time-lapses in een gebruiksvriendelijke online interface.
Abstract
Celpolariteit is een macroscopisch fenomeen dat wordt vastgesteld door een verzameling ruimtelijk geconcentreerde moleculen en structuren die culmineren in het ontstaan van gespecialiseerde domeinen op subcellulair niveau. Het wordt geassocieerd met het ontwikkelen van asymmetrische morfologische structuren die ten grondslag liggen aan belangrijke biologische functies zoals celdeling, groei en migratie. Bovendien is de verstoring van de celpolariteit in verband gebracht met weefselgerelateerde aandoeningen zoals kanker en maagdysplasie.
De huidige methoden om de spatiotemporele dynamiek van fluorescerende reporters in individuele gepolariseerde cellen te evalueren, omvatten vaak handmatige stappen om een middellijn langs de hoofdas van de cellen te traceren, wat tijdrovend is en vatbaar voor sterke vooroordelen. Bovendien, hoewel ratiometrische analyse de ongelijke verdeling van reportermoleculen kan corrigeren met behulp van twee fluorescentiekanalen, zijn achtergrondaftrektechnieken vaak willekeurig en missen ze statistische ondersteuning.
Dit manuscript introduceert een nieuwe computationele pijplijn om het spatiotemporele gedrag van afzonderlijke cellen te automatiseren en te kwantificeren met behulp van een model van celpolariteit: pollenbuis/wortelhaargroei en cytosolische ionendynamiek. Er werd een algoritme in drie stappen ontwikkeld om ratiometrische beelden te verwerken en een kwantitatieve weergave van intracellulaire dynamiek en groei te extraheren. De eerste stap segmenteert de cel vanaf de achtergrond en produceert een binair masker door middel van een drempeltechniek in de pixelintensiteitsruimte. De tweede stap volgt een pad door de middellijn van de cel door middel van een skeletvormingsoperatie. Ten slotte levert de derde stap de verwerkte gegevens als een ratiometrische timelapse en levert een ratiometrische kymograaf op (d.w.z. een 1D-ruimtelijk profiel door de tijd heen). Gegevens van ratiometrische beelden verkregen met genetisch gecodeerde fluorescerende reporters van groeiende stuifmeelbuizen werden gebruikt om de methode te benchmarken. Deze pijplijn zorgt voor een snellere, minder bevooroordeelde en nauwkeurigere weergave van de spatiotemporele dynamiek langs de middellijn van gepolariseerde cellen, waardoor de kwantitatieve toolkit die beschikbaar is om celpolariteit te onderzoeken, wordt bevorderd. De AMEBaS Python-broncode is beschikbaar op: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Celpolariteit is een fundamenteel biologisch proces waarbij de gecoördineerde actie van een verzameling ruimtelijk geconcentreerde moleculen en structuren culmineert in de oprichting van gespecialiseerde morfologische subcellulaire domeinen1. Celdeling, groei en migratie zijn afhankelijk van dergelijke polariteitsplaatsen, terwijl het verlies ervan in verband is gebracht met kanker bij epitheelweefselgerelateerde aandoeningen2.
Apicaal groeiende cellen zijn een dramatisch voorbeeld van polariteit, waarbij de polariteitsplaats aan het uiteinde zich typisch heroriënteert op extracellulaire signalen3. Deze omvatten het ontwikkelen van neurieten, schimmeldraden, wortelharen en stuifmeelbuizen, waar meerdere cellulaire processen uitgesproken verschillen vertonen van de punt van de cel naar de schacht. Met name in stuifmeelbuizen zijn actinepolymerisatie, blaasjesverkeer en ionische concentraties duidelijk gepolariseerd, met tipgerichte gradiënten4. Stuifmeelbuizen zijn de mannelijke gametofyten van bloeiende planten en zijn verantwoordelijk voor het afleveren van de zaadcellen aan de zaadknop door uitsluitend aan de top van de cel te groeien met een van de snelste groeisnelheden die bekend zijn voor een enkele cel. De tipgerichte gradiënten van ionen zoals calcium 5 (Ca2+) en protonen 6 (H+) spelen een belangrijke rol bij het in stand houden van de groei van stuifmeelbuizen, wat essentieel is om de belangrijkste biologische functie te vervullen die culmineert in een dubbele bevruchting 5,6. Kwantitatieve methoden om de spatiotemporele dynamiek langs de middellijn van apicaal groeiende cellen te analyseren, zijn dus essentieel om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan gepolariseerde groei 7,8,9. Onderzoekers gebruiken vaak kymografen, d.w.z. een matrix die de pixelintensiteiten van de middellijn van de cel (bijv. kolommen) door de tijd heen weergeeft (bijv. rijen), waardoor celgroei en -migratie diagonaal kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1). Ondanks hun nut worden kymografen vaak geëxtraheerd door de middellijn handmatig te traceren, omdat ze vatbaar zijn voor vooroordelen en menselijke fouten, terwijl ze ook nogal omslachtig zijn. Dit vraagt om een geautomatiseerde methode van middellijnextractie die het eerste kenmerk is van de pijplijn die hierin wordt geïntroduceerd, AMEBaS genaamd: eenutomatische M-idline E-xtractieen Background S-ubtractievan ratiometrische fluorescentie-time-lapses van gepolariseerde afzonderlijke cellen.
In termen van experimentele procedures kan kwantitatieve beeldvorming van ionen/moleculen/soorten van belang in afzonderlijke cellen worden bereikt met genetisch gecodeerde fluorescerende sondes10. Van de steeds groter wordende keuzes zijn ratiometrische sondes een van de meest nauwkeurige, omdat ze verschillende fluorescentiegolflengten uitzenden wanneer ze gebonden/ongebonden zijn aan de moleculen van belang11. Dit maakt het mogelijk om de ruimtelijke heterogeniteit in de intracellulaire concentratie van de sonde te corrigeren door gebruik te maken van de verhouding van twee kanalen met hun kanaalspecifieke achtergrond afgetrokken. Het schatten van de achtergronddrempel voor elk kanaal en tijdstip kan echter een complexe taak zijn, omdat deze vaak varieert in de ruimte als gevolg van effecten zoals schaduwen, waarbij de hoeken van het beeld helderheidsvariatie vertonen ten opzichte van het midden, en in de tijd als gevolg van vervaging van de fluorofoor (fotobleken)12. Hoewel er meerdere mogelijke methoden zijn, stelt dit manuscript voor om de achtergrondintensiteit automatisch te bepalen met behulp van de segmentatiedrempel die is verkregen met het Isodata-algoritme13, die vervolgens standaard over frames wordt gladgestreken door middel van polynomiale regressie. Ruimtelijke componenten die voortkomen uit fluorescentieheterogeniteit die geen verband houden met de doelcel die in12 werd verwijderd, werden echter door deze methode genegeerd. Automatische drempelwaarden kunnen op verschillende manieren worden uitgevoerd, maar het Isodata-algoritme leverde empirisch de beste resultaten op. Het automatisch aftrekken van de achtergrondwaarde en de berekening van de ratiometrie zijn dus het tweede hoofdkenmerk van AMEBaS (Figuur 1), dat samen een stapel tweekanaals fluorescentiemicroscopiebeelden als invoer ontvangt, de middellijn van de cel en de kanaalspecifieke achtergrond schat, en kymografen van beide kanalen en hun verhouding (hoofduitgang #1) uitvoert na achtergrondaftrekking, afvlakking en verwijdering van uitschieters, samen met een stapel ratiometrische afbeeldingen (hoofduitgang #2).
AMEBaS werd getest met fluorescentie-time-lapses van groeiende Arabidopsis-pollenbuizen verkregen onder een microscoop, hetzij met Ca2+ (CaMeleon)8 of pH (pHluorin)6 ratiometrische sensoren uitgedrukt onder de pollenspecifieke LAT52-promotor. Beelden van elk kanaal werden elke 4 s gemaakt in combinatie met een omgekeerde microscoop, een camera met verlichting aan de voorkant (2560 pixels × 2160 pixels, pixelgrootte 6,45 μm), een fluorescentieverlichting en een objectieflens voor wateronderdompeling 63x, 1,2NA. Filterinstellingen die voor CaMeleon werden gebruikt, waren: excitatie 426-450 nm (CFP) en 505-515 nm (YFP), emissie 458-487 nm (CFP) en 520-550 nm (YFP), terwijl voor pHluorin, excitatie 318-390 nm (DAPI) en 428-475 nm (FITC), emissie 435-448 nm (DAPI) en 523-536 nm (FITC). Er is een volledige dataset toegevoegd voor testen bij Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Daarnaast werd de pijplijn getest met wortelhaargegevens, waarbij beeldvorming werd uitgevoerd met een lichtbladmicroscoop (SPIM) zoals eerder beschreven 15,16 met Arabidopsis-wortelharen die de genetisch gecodeerde Ca2+ reporter NES-YC3.6 tot expressie brachten onder controle van de UBQ10-promotor17. De zelfgemaakte LabView-software die de camera-acquisitie, monstervertaling en sluiter van de lichtbladmicroscoop regelde, maakte de observatie van de twee cpVenus- en CFP-kanalen mogelijk, maar ook de visualisatie van hun verhouding in realtime. Elk verhoudingsbeeld van de time-lapse vertegenwoordigde een projectie met maximale intensiteit (MIP) tussen de fluorescentiekanalen cpVenus en CFP, beelden verkregen uit 15 plakjes van het monster met een tussenruimte van 3 μm. De time-lapse cpVenus/CFP-ratio van MIP's werd opgeslagen en direct gebruikt voor de AMEBaS-analyse.
Hoewel deze pijplijn kan werken met meerdere soorten groeiende en migrerende cellen, is deze speciaal ontworpen om groeiende cellen te analyseren die uitsluitend aan het uiteinde groeien, zoals pollenbuizen, wortelharen en schimmeldraden, waar er een overeenkomst is van de niet-groeiende cytoplasmatische regio's tussen frames. Als een dergelijke correspondentie niet aanwezig is, moet de gebruiker de optie complete_skeletonization kiezen in stap 1.3.1.1 (zie de sectie Discussie voor meer details).
Figuur 1: Een overzicht van de pipeline workflow. De AMEBaS-pijplijn analyseert en verwerkt microscopisch kleine time-lapses in drie hoofdstappen: Single-Cell Segmentation, Midline Tracing en Kymograph Generation. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Interactief notebookprotocol
Het Jupyter-notebook kan rechtstreeks op internet worden gebruikt met behulp van Google Colab op https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, waar de onderstaande instructies zijn gebaseerd. Als alternatief is het Jupyter-notebook beschikbaar op https://github.com/badain/amebas, waar het kan worden gedownload en geconfigureerd om lokaal in Jupyter te worden uitgevoerd (Anaconda kan een eenvoudig en platformonafhankelijk installatieproces bieden). Volledige testgegevens zijn te vinden op Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), met enkel- en tweekanaalsgegevens van Arabidopsis-pollenbuisjes die ofwel pH ofwel Ca2+ reporters tot expressie brengen14. De pipeline is opgedeeld in delen, waarbij elke stap kan worden uitgevoerd door op de afspeelknop te klikken na het instellen van de gebruikersspecifieke opties. De benodigde bestanden voor dit onderzoek zijn beschikbaar in de AMEBaS-hoofdmap (Supplementary Coding File 1).
- Open Jupyter notebook en lees de time-lapse-bestanden.
- Navigeer naar de startpagina van het interactieve notitieblok in Google Colab waarnaar hierboven wordt verwezen of download en open het AMEBaS_Local.ipynb-notitieblok van GitHub.
- Bereid de directory-instellingen voor de invoer- en uitvoergegevens voor:
- Als u de lokale versie gebruikt, plaatst u de fluorescentie-time-lapse als een TIFF-bestand of DV-bestand in een map met de naam gegevens die zich in de hoofdmap van het programma moeten bevinden. Er moet een map met de naam worden gemaakt om de gegenereerde gegevens te ontvangen. Voer vervolgens het codeblok Setup uit.
- Als u het notitieblok op Google Colab gebruikt, voert u het codeblok Setup uit om de gegevens en mappen automatisch te genereren.
- Voer het codeblok Bestandsinvoer uit om de time-lapse-gegevens te lezen door op de afspeelknop te klikken. Als u de Google Colab-versie van het notitieblok gebruikt, klikt u op de knop Bestand kiezen om het time-lapse-bestand rechtstreeks naar de gegevensmap te uploaden.
NOTITIE: Het aantal kanalen wordt automatisch gedetecteerd op basis van de afmeting van het beeld. - Kies of er extra uitvoer van elke stap wordt gegenereerd door de parameter 'uitgebreid' in te stellen op Waar of Onwaar.
- Detecteer de hoofdcel en het segment vanaf de achtergrond (Figuur 2).
- Voer het codeblok voor segmentatie van één cel uit om de cel van interesse automatisch van de achtergrond te scheiden door op de afspeelknop te klikken.
OPMERKING: Mediaan- en Gaussiaanse filters worden toegepast als een voorbewerkingsstap om ongewenste ruis te verwijderen voordat de voorgrond van de achtergrond wordt gesegmenteerd door Isodata-drempels en het gebied van het grootste gebied te isoleren om ongewenste artefacten te verwijderen.- Pas de sigma-waarde aan die door de Gaussiaans wordt gebruikt in de variabele 'sigma' om de vloeiendheid van het segmentatiemasker te verfijnen. De standaardwaarde is 2.0.
- Stel de schatting van de variabele in op False om de geschatte drempelwaarde rechtstreeks op basis van Isodata op te slaan of op True om deze over aangrenzende frames te verdelen met behulp van lokale polynomiale regressie (LOESS). Verfijn de functie door de n_points variabele te wijzigen. De standaardwaarde is 40.
- Voer het codeblok voor segmentatie van één cel uit om de cel van interesse automatisch van de achtergrond te scheiden door op de afspeelknop te klikken.
- Trek de middellijn langs de celverlenging (Figuur 3).
- Voer het codeblok Cell Midline Tracing uit door op de afspeelknop te klikken om de cel automatisch te skeletteren met behulp van Lee's methode18 en de punt van het laatste skelet uit te breiden door middel van lineaire extrapolatie.
- Kies ervoor om de middellijn alleen op het laatste frame te traceren of één keer per frame door het argument complete_skeletonization aan te passen.
OPMERKING: Wanneer alle frames geskeletteerd zijn, wordt extrapolatie overgeslagen. - Stel de fractie van punten in het skelet in die tijdens de extrapolatie moet worden geïnterpoleerd door de interpolation_fraction variabele aan te passen. De standaardwaarde is 0,25.
- Kies de lengte van de middellijn extrapolatie door de variabele extrapolation_length te wijzigen. De standaardwaarde is -1, waardoor het skelet zich uitstrekt tot aan de dichtstbijzijnde rand.
- Kies ervoor om de middellijn alleen op het laatste frame te traceren of één keer per frame door het argument complete_skeletonization aan te passen.
- Voer het codeblok Cell Midline Tracing uit door op de afspeelknop te klikken om de cel automatisch te skeletteren met behulp van Lee's methode18 en de punt van het laatste skelet uit te breiden door middel van lineaire extrapolatie.
- Genereer kymografen voor elk kanaal ( Figuur 4).
- Voer het eerste codeblok voor gegevensvisualisatie uit door op de afspeelknop te klikken om automatisch kymografen voor beide kanalen te genereren.
- Kies de grootte van de Gauss-kern die wordt gebruikt voor het afvlakken door de variabele kymograph_kernel aan te passen.
OPMERKING: Het komt overeen met de grootte van de buurt (in pixels) waarover de pixelintensiteiten worden gemiddeld. De standaardwaarde is 3 pixels x 3 pixels. - Niet-verlengde skeletten genereren afgedekte kymografen die een aangepaste kleurenkaart moeten gebruiken om hun intensiteiten correct weer te geven. Kies het fractiepercentage van de intensiteiten dat wordt toegewezen aan de achtergrondkleur, zwart, en pas de shift_fraction variabele aan. De standaardwaarde is 0,7.
- Kies de grootte van de Gauss-kern die wordt gebruikt voor het afvlakken door de variabele kymograph_kernel aan te passen.
- Voer het eerste codeblok voor gegevensvisualisatie uit door op de afspeelknop te klikken om automatisch kymografen voor beide kanalen te genereren.
- Bereken de verhouding tussen kanalen (Figuur 5).
- Voer het tweede codeblok voor gegevensvisualisatie uit door op de afspeelknop te klikken om automatisch een ratiometrische kymograaf en een ratiometrische timelapse te genereren (Afbeelding 6).
OPMERKING: Deze stap is alleen beschikbaar bij gebruik van dual-channel time-lapses. De in stap 1.2.1.2 opgeslagen drempelwaarde voor achtergrondintensiteit wordt van elk kanaal afgetrokken.- Pas de variabele switch_ratio aan om de volgorde van de kanalen die als teller en noemer worden gebruikt tijdens verhoudingsberekeningen te wijzigen. De standaardwaarde is False.
- Kies of de timelapse van de verhouding verder moet worden afgevlakt met een mediane filterdoorgang door de smooth_ratio variabele aan te passen. De standaardwaarde is False.
- Kies of u uitschieters wilt verwijderen die worden geproduceerd door het lage signaal van het noemerkanaal door de reject_outliers variabele te manipuleren. Is standaard ingesteld op Waar en definieert uitschieters als waarden die 1,5 keer zo groot zijn als de interkwartielafstand boven het derde kwartiel (waar 75% van de waarden liggen).
- Kies of de achtergrond in de ratiometrische uitvoer moet worden geëxporteerd door de variabele background_ratio aan te passen. De standaardinstelling is False, waardoor deze wordt vervangen door nullen.
- Voer het tweede codeblok voor gegevensvisualisatie uit door op de afspeelknop te klikken om automatisch een ratiometrische kymograaf en een ratiometrische timelapse te genereren (Afbeelding 6).
Figuur 2: Segmentatiestap van één cel. Beeldverwerkingstechnieken zoals filtering, drempelwaarden en gebiedslabeling worden gebruikt om het signaal van interesse te isoleren (stap 1.2). Deze specifieke gegevens hadden de volgende waarden voor de laagste intensiteit: 2556, de mediaan: 3441 en de hoogste intensiteit: 32125. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Overzicht middellijntracering- De middellijn van de enkele cel wordt verkregen door het skelet (wit) te berekenen. De punt (magenta) wordt lineair geëxtrapoleerd vanaf de laatste punten aan het einde van het skelet (stap 1.3). In deze compositie worden zowel de middellijn als de punt over de oorspronkelijke cel heen gelegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Timelapse's kymografen - Vergelijking van de kymografen voor elk kanaal gegenereerd met 'complete_skeletonization' uitgeschakeld (stap 1.4). De verticale as beschrijft het verloop van de tijd en de horizontale as toont de gemiddelde intensiteit van het geëxtrapoleerde middellijnpad gevolgd door een enkele cel. Voor deze specifieke gegevens vertegenwoordigt de kleurenkaart de volgende waarden voor kanaal 1 Laagste intensiteit: 2886, Mediaan: 3167, Hoogste intensiteit: 21021. Kanaal 2 Laagste intensiteit: 3030, Mediaan: 3400, Hoogste intensiteit: 29688. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Achtergronddrempel afvlakking - De achtergrondsegmentatiedrempel wordt geschat via het isodata-algoritme en vervolgens afgevlakt via lokale polynomiale regressie (stap 1.5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Ratiometrische resultaten- (A) Vergelijking tussen het laatste frame van de ratiometrische timelapse en het gesegmenteerde oorspronkelijke eerste kanaal. (B) Kymograaf gegenereerd op basis van de ratiometrische timelapse (stap 1.5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Het protocol van de batchwijze
- Download en plaats het bestand pipeline.py uit de AMEBaS GitHub-opslagplaats in dezelfde map als de gegevens.
- Typ de bestandslocatie op de opdrachtregel na het programmabestand.
- Voeg - -v toe als een positioneel argument om de interne stappen van de pijplijn weer te geven, indien gewenst.
- Neem --s op om te kiezen in de sigma-waarde die wordt gebruikt in de voorbewerkingsstap van het Gaussiaanse filter ter voorbereiding op celsegmentatie. De standaardwaarde is 2.
- Voeg - -a toe om de middellijn voor elk frame van het tijdsverloop te traceren. Standaard gebruikt de pijplijn alleen het laatste frame.
- Voeg - -f toe om de breuk [0,1] van het skelet te kiezen die in de interpolatie moet worden gebruikt. De standaardwaarde is 0,25.
- Voeg -e toe om de lengte in pixels van het geëxtrapoleerde skelet te kiezen. De standaardwaarde is -1, waardoor het skelet zich uitstrekt tot aan de dichtstbijzijnde rand.
- Voeg -- sf toe om het deel van het kleurbereik te kiezen dat naar de achtergrond wordt verschoven in niet-geëxtrapoleerde kymografen. De standaardwaarde is 0,7.
- Voeg - -k toe om de grootte van de kernel te bepalen die wordt gebruikt in de kymograaf Gaussiaanse filtering. De standaardwaarde is 3.
- Voeg -- eb toe om de globale achtergronddrempelintensiteit te schatten via LOESS-polynoomregressie van de framespecifieke achtergronddrempelintensiteiten.
- Pas het aantal punten aan dat wordt gebruikt bij het afvlakken van de achtergronddrempelwaarden door de parameter - -n te wijzigen. De standaardwaarde is 40.
- Wissel de kanalen die worden gebruikt als teller en noemer tijdens verhoudingsberekeningen, inclusief - r of - -switch_ratio, als de timelapse twee kanalen heeft. Standaard is het tweede kanaal de teller en het eerste de noemer.
- Kies of de timelapse van de verhouding verder moet worden gladgestreken met een mediaanfilterdoorgang met het argument - -sm . De standaardwaarde is False.
- Voeg -o toe om pixels met abnormale intensiteiten te weigeren tijdens het genereren van ratiometrische time-lapses.
- Kies of de achtergrond in de ratiometrische uitvoer moet worden geëxporteerd met behulp van het argument - -b. De standaardinstelling is False, waardoor deze wordt vervangen door nullen.
- Druk op enter om uit te voeren. De uitvoer wordt gegenereerd in dezelfde map als het programmabestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De AMEBaS-pijplijn automatiseert de extractie van middellijndynamiek van gepolariseerde afzonderlijke cellen uit fluorescentiemicroscopiebeeldstapels, waardoor het minder tijdrovend en minder vatbaar is voor menselijke fouten. De methode kwantificeert deze time-lapses door kymografen en ratiometrische beeldstapels te genereren (Figuur 1) in groeiende afzonderlijke cellen. Het kan worden aangepast om te werken aan migrerende afzonderlijke cellen, maar verdere experimenten zijn nodig. AMEBaS is in Python geïmplementeerd als een interactief Jupyter Notebook (beschreven in de sectie Interactive Notebook protocol), waardoor het gebruik eenvoudiger is zonder dat programmeerervaring vereist is, en als een opdrachtregeltool (in de sectie Batch mode protocol), waar meerdere stacks kunnen worden geanalyseerd met dezelfde parameterset. Hoewel één of twee fluorescentiekanalen kunnen worden gebruikt, zouden ratiometrische sondes met twee emissiekanalen betrouwbaardere resultaten moeten opleveren, aangezien de fluorescentie-emissie van de ongebonden toestand van de sonde de ruimtelijke heterogeniteit kan verlichten die wordt veroorzaakt door de ongelijke verdeling van het eiwit in het cytoplasma.
De pijplijn levert eerst een binair masker op van de grootste cel op het sterkste kanaal, geëxporteerd als een tif-bestand met de naam Filename_binary_mask.tiff (Afbeelding 2). Drempelschattingen verkregen met isodata voor elk kanaal worden optioneel gladgestreken met löss en opgeslagen in de tabel Filename_background_treshold.csv (figuur 5). De middellijn van de cel, geëxtraheerd uit het binaire masker, wordt geëxporteerd als een tif-bestand met de naam Filename_skeletonized.tiff (Afbeelding 3). Kymografen van elk kanaal worden geproduceerd vanaf de middellijn, genaamd Filename_kymograph_c_*.csv, waarbij * overeenkomt met het kanaalnummer (Figuur 4). Ten slotte wordt een ratiometrische kymograaf opgeslagen als Filename_kymograph_ratio.csv, terwijl de volledige ratiometrische stapel Filename_ratiometric.tiff wordt genoemd (Figuur 6). Plots die overeenkomen met Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5 en Figuur 6 worden optioneel opgeslagen als PNG-bestanden wanneer 'uitgebreid == True' of '--v' door de gebruiker is opgegeven in het eerste codeblok (stap 1.1).
Deze resultaten kunnen worden gekoppeld aan andere beeldanalysepijplijnen om de spatiotemporele dynamiek van de cel verder te onderzoeken, zoals CHUKNORRIS8, dat de kymografen van elk kanaal als input neemt en een groeisnelheidsanalyse uitvoert met subpixelresolutie, samen met verschillende tijdreeksanalysemethoden.
AMEBaS werd getest op datasets van pollenbuizen met genetisch gecodeerde ratiometrische fluorescerende reporters voor intracellulair Ca2+ (CaMeleon; Figuur 7A,B) en H+ (pHluorin; Figuur 7C,D) concentraties verkregen op een optische fluorescentiemicroscoop, evenals projectie van maximale intensiteit van cpVenus/CFP-verhoudingen van groeiende wortelharen die de CaMeleon NES-YC3.6 tot expressie brengen (Figuur 7E,F) verkregen op een light-sheet microscoop zoals eerder beschreven 15,16. De pijplijn werkte met succes ondanks verschillen in de groeirichting, beeldvormingstechnieken, fluorescerende reporters en celtypen. Segmentatie, middellijntracering en kymograafextractie worden getoond voor deze datasets (Figuur 7), wat het potentieel aantoont van het toepassen van AMEBaS op een breed scala aan experimentele opstellingen.
Figuur 7: Representatieve resultaten voor verschillende fluorescentiebeelddatasets van tipgroeiendecellen. (A,B) Stuifmeelbuis die de Ca2+ reporter CaMeleon tot expressie brengt; (C,D) stuifmeelbuisjes die de pH-indicator pHluorine uitdrukken; (E,F) Wortelharen die de Ca2+ reporter NES-YC3.6 uitdrukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend coderingsbestand 1: AMEBaS-main.zip. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde nieuwe methode is een krachtig hulpmiddel om de analyse van fluorescentiemicroscopiebeeldstapels van gepolariseerde cellen te stroomlijnen en te automatiseren. De huidige methoden die in de literatuur worden beschreven, zoals ImageJ Kymograaf-plug-ins, vereisen handmatige tracering van de middellijn van de gepolariseerde cel van belang, een taak die niet alleen tijdrovend is, maar ook vatbaar voor menselijke fouten. Aangezien de definitie van de middellijn in deze pijplijn wordt ondersteund door een numerieke methode18,19 die skeletvorming uitvoert, wordt subjectieve evaluatie verwijderd, waardoor een kwantitatieve standaard in de procedure wordt geïntroduceerd. Dit is vooral handig voor onderzoekers met grote hoeveelheden gegevens, met de mogelijkheid om de pijplijn aan te passen aan verschillende eisen, waaronder het extraheren van de middellijn voor elk frame. Bovendien is het aftrekken van de achtergrondwaarde vaak willekeurig, waarbij een enkele achtergrondwaarde met de hand wordt gekozen voor alle frames van een bepaald kanaal. Hier wordt isodata-segmentatie gebruikt om objectief de achtergronddrempel voor elk frame te bepalen, waarbij deze (optioneel) wordt afgevlakt met een lokale polynoomregressie om langetermijnveranderingen in fluorescentie veroorzaakt door vervaging (fotobleken) vast te leggen. Terwijl de mogelijke artefacten en secundaire elementen op de achtergrond worden genegeerd door het grotere object per pixelgebied te selecteren, kunnen andere methoden, zoals FRET-IBRA12, worden gebruikt om effecten zoals schaduw te verwijderen. Ruimtelijke artefacten (zoals arcering) kunnen de vorm van de gesegmenteerde cel beïnvloeden door drempels, wat de vertekening van de gradiënt naar één kant van de buis kan verklaren die te zien is in de ratiometrische film op het AMEBaS-logo (zie GitHub-pagina of Colab-notebook).
Desalniettemin zijn er nog steeds een paar situaties waarin de gepresenteerde pijplijn kan falen en niet als een wondermiddel moet worden beschouwd. Er moet speciale aandacht worden besteed aan het vastleggen van beelden, omdat grote verstoringen het vermogen van het algoritme om de doelcel te segmenteren kunnen aantasten. Voorbewerking van de afbeeldingsstapel moet worden overwogen voor optimale resultaten, het verwijderen van ongewenste elementen en algehele defecte frames.
Er werden parameters gekozen met het oog op het analyseren van enkele apicaal groeiende cellen, rekening houdend met een beperkte dataset van Arabidopsis-pollenbuizen die ionische concentraties testen met fluorescerende reporters. Andere gegevens kunnen dus verstandige keuzes van parameters vereisen. Voorbewerkingsfilters maken de gegevens glad met als doel een schoon binair masker te produceren na segmentatie (stap 1.2), zodat de sigma-waarde die wordt gebruikt voor de Gauss- en mediaanfilters kan worden verhoogd voor gegevens met meer ruis of kan worden verlaagd als de resultaten te glad worden geveegd. De locatie van het binaire masker dat in het sterkste kanaal wordt verkregen, wordt verondersteld hetzelfde te zijn als het zwakste kanaal, wat een probleem kan zijn als de cellocatie in beide kanalen niet hetzelfde is. Als dit het geval is, moeten ofwel voor elk kanaal verschillende maskers worden gebruikt of moet beeldregistratie worden uitgevoerd, zoals gedaan in FRET-IBRA12.
Skeletvorming wordt standaard uitsluitend gedaan in het laatste frame (stap 1.3), dat uitgaat van een tip-groeiende cel die de locatie van zijn cytoplasma in de loop van de tijd behoudt (anders dan aan de top). Door het skelet uit te breiden, is het mogelijk om kymografen te genereren die analyse van de groeisnelheid mogelijk maken, zelfs met subpixelresolutie, met behulp van methoden zoals CHUKNORRIS8. Deze uitbreiding gebeurt door lineaire extrapolatie van de eerste 25% punten in de groeiende punt van het skelet (stap 1.3) en kan worden afgestemd door de interpolation_fraction aan te passen van 0% tot 100% punten van het gehele skelet. Als de cel echter van locatie tussen frames afwijkt of een migrerende cel is, wordt de analyse van de groeisnelheid complexer. In een dergelijk scenario kunnen onafhankelijke skeletten worden gegenereerd voor elk frame met de keuze van parameters complete_skeletonization=TRUE, die skeletten zullen produceren zonder extracellulaire extensie. Het zou nog steeds mogelijk zijn om de groeisnelheid te analyseren, maar de resolutie zou worden beperkt door het binaire masker dat wordt geproduceerd met isodata-drempels. Bovendien gaat de resulterende kymograaf ervan uit dat opeenvolgende skeletten kunnen worden uitgelijnd door hun standaardcoördinaten, wat, als het niet waar is, het ongeschikt maakt voor het analyseren van intracellulaire dynamiek.
Bij het genereren van kymografen (stap 1.4) maakt AMEBaS gebruik van middeling met een Gaussiaanse kernel in plaats van de traditionele pixelmarge rond de middellijn. De standaardwaarde van een 3x3 is de kleinst mogelijke grootte, die kan worden verhoogd als de gegevens te veel ruis bevatten en/of als de cel groot is. Deze stap kan echter leiden tot overgladheid, in welk geval het filter helemaal moet worden uitgeschakeld door kymograph_kernel = 0 in te stellen. Ten slotte kan de geschatte achtergrond voor elk frame van elk kanaal worden gladgestreken wanneer de gebruiker vervaging verwacht (fotobleken) of met behulp van de ruwe schattingen (stap 1.5). Het afvlakken van de achtergrondwaarden met LOESS-polynoomregressie (stap 1.5) kan worden afgestemd door het aantal punten dat in het venster wordt gebruikt in te stellen n_points op minimaal 3 en maximaal het aantal frames in de stapel (automatisch afgetopt). Een eenvoudigere functie die de achtergrondverandering in de loop van de tijd beschrijft, kan worden bereikt met een groter venster, wat een grovere pasvorm oplevert.
Aangezien deze methode meerdere handmatige stappen consolideert die doorgaans door onderzoekers worden uitgevoerd, is de AMEBaS-pijplijn een efficiënter, onbevooroordeeld en nauwkeuriger benaderingsinstrument om het spatiotemporele gedrag van time-lapses van enkele gepolariseerde cellen te analyseren. In de toekomst kan deze methode worden uitgebreid om de analyse van migrerende afzonderlijke cellen te ondersteunen. Bovendien is verdere analyse nodig om de prestaties van deze methode over een breder scala aan celtypen te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van dit manuscript verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs zijn de FAPESP-subsidies 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01-subsidie GM131043 en de NSF-subsidies MCB1714993, MCB1930165 dankbaar voor financiële steun. Wortelhaargegevens werden geproduceerd met de infrastructuur en onder toezicht van prof. Andrea Bassi en prof. Alex Costa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J.
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
