Summary
Derzeitige Methoden zur Analyse der intrazellulären Dynamik polarisierter Einzelzellen sind oft manuell und nicht standardisiert. Dieses Manuskript stellt eine neuartige Bildanalyse-Pipeline zur Automatisierung der Mittellinienextraktion einzelner polarisierter Zellen und zur Quantifizierung des raumzeitlichen Verhaltens aus Zeitraffern in einer benutzerfreundlichen Online-Oberfläche vor.
Abstract
Zellpolarität ist ein makroskopisches Phänomen, das durch eine Ansammlung von räumlich konzentrierten Molekülen und Strukturen entsteht, die in der Entstehung spezialisierter Domänen auf subzellulärer Ebene gipfeln. Es ist mit der Entwicklung asymmetrischer morphologischer Strukturen verbunden, die wichtigen biologischen Funktionen wie Zellteilung, Wachstum und Migration zugrunde liegen. Darüber hinaus wurde die Störung der Zellpolarität mit gewebebezogenen Erkrankungen wie Krebs und Magendysplasie in Verbindung gebracht.
Derzeitige Methoden zur Bewertung der raumzeitlichen Dynamik von fluoreszierenden Reportern in einzelnen polarisierten Zellen beinhalten oft manuelle Schritte, um eine Mittellinie entlang der Hauptachse der Zellen zu verfolgen, was zeitaufwändig und anfällig für starke Verzerrungen ist. Obwohl die ratiometrische Analyse die ungleichmäßige Verteilung von Reportermolekülen mit Hilfe von zwei Fluoreszenzkanälen korrigieren kann, sind die Techniken der Hintergrundsubtraktion häufig willkürlich und nicht statistisch abgesichert.
Dieses Manuskript stellt eine neuartige Rechenpipeline vor, um das raumzeitliche Verhalten einzelner Zellen unter Verwendung eines Modells der Zellpolarität zu automatisieren und zu quantifizieren: Wachstum der Pollenröhren/Wurzelhaare und zytosolische Ionendynamik. Es wurde ein dreistufiger Algorithmus entwickelt, um ratiometrische Bilder zu verarbeiten und eine quantitative Darstellung der intrazellulären Dynamik und des Wachstums zu extrahieren. Der erste Schritt segmentiert die Zelle vom Hintergrund und erzeugt eine binäre Maske durch eine Schwellwerttechnik im Pixelintensitätsraum. Im zweiten Schritt wird ein Weg durch die Mittellinie der Zelle durch eine Skelettierungsoperation nachgezeichnet. Der dritte Schritt schließlich liefert die verarbeiteten Daten als ratiometrischen Zeitraffer und ergibt einen ratiometrischen Kymographen (d.h. ein räumliches 1D-Profil über die Zeit). Daten aus ratiometrischen Bildern, die mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern aus wachsenden Pollenschläuchen aufgenommen wurden, wurden verwendet, um die Methode zu vergleichen. Diese Pipeline ermöglicht eine schnellere, weniger verzerrte und genauere Darstellung der raumzeitlichen Dynamik entlang der Mittellinie polarisierter Zellen und erweitert so das quantitative Instrumentarium, das zur Untersuchung der Zellpolarität zur Verfügung steht. Der AMEBaS-Python-Quellcode ist verfügbar unter: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Die Zellpolarität ist ein grundlegender biologischer Prozess, bei dem die konzertierte Wirkung einer Ansammlung von räumlich konzentrierten Molekülen und Strukturen in der Etablierung spezialisierter morphologischer subzellulärer Domänen gipfelt1. Zellteilung, Wachstum und Migration hängen von solchen Polaritätsstellen ab, während ihr Verlust mit Krebs bei epithelialen Gewebeerkrankungen in Verbindung gebracht wurde2.
Apikal wachsende Zellen sind ein dramatisches Beispiel für Polarität, bei der sich die Polaritätsstelle an der Spitze typischerweise auf extrazelluläre Signale umorientiert3. Dazu gehören die Entwicklung von Neuriten, Pilzhyphen, Wurzelhaaren und Pollenschläuchen, bei denen mehrere zelluläre Prozesse ausgeprägte Unterschiede von der Zellspitze zum Schaft hin zeigen. Insbesondere in Pollenschläuchen sind die Aktinpolymerisation, der Vesikeltransport und die Ionenkonzentrationen deutlich polarisiert und zeigen spitzenfokussierte Gradienten4. Pollenschläuche sind die männlichen Gametophyten von Blütenpflanzen und sind dafür verantwortlich, die Samenzellen in die Eizelle zu bringen, indem sie ausschließlich an der Spitze der Zelle mit einer der schnellsten Wachstumsraten wachsen, die für eine einzelne Zelle bekannt sind. Die spitzenfokussierten Gradienten von Ionen wie Calcium 5 (Ca2+) und Protonen 6 (H+) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Pollenschlauchwachstums, das für die Erfüllung seiner biologischen Hauptfunktion, die in einer doppelten Befruchtung gipfelt, unerlässlich ist 5,6. Daher sind quantitative Methoden zur Analyse der raumzeitlichen Dynamik entlang der Mittellinie apikal wachsender Zellen unerlässlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem polarisierten Wachstum zugrunde liegen 7,8,9. Forscher verwenden häufig Kymographen, d. h. eine Matrix, die die Pixelintensitäten der Mittellinie der Zelle (z. B. Spalten) im Laufe der Zeit (z. B. Zeilen) darstellt und es ermöglicht, das Zellwachstum und die Zellwanderung in der Diagonalen zu visualisieren (Abbildung 1). Trotz ihrer Nützlichkeit werden Kymographen häufig durch manuelles Nachzeichnen der Mittellinie extrahiert, was anfällig für Verzerrungen und menschliche Fehler ist und gleichzeitig ziemlich mühsam ist. Dies erfordert ein automatisiertes Verfahren der Mittellinienextraktion, das das erste Merkmal der hier vorgestellten Pipeline mit dem Namen AMEBaS ist: Eineutomatische M-Idline-E-Xtraktion und eine Ba ckground-S-Traktion von ratiometrischen Fluoreszenzzeitraffern polarisierter Einzelzellen.
In Bezug auf experimentelle Verfahren kann die quantitative Abbildung von Ionen/Molekülen/Spezies von Interesse in einzelnen Zellen mit genetisch kodierten Fluoreszenzsondenerreicht werden 10. Unter den ständig wachsenden Möglichkeiten sind ratiometrische Sonden eine der genauesten, da sie unterschiedliche Fluoreszenzwellenlängen emittieren, wenn sie an die interessierenden Moleküle gebunden oder ungebunden sind11. Dies ermöglicht die Korrektur der räumlichen Heterogenität in der intrazellulären Konzentration der Sonde, indem das Verhältnis zweier Kanäle mit ihrem kanalspezifischen Hintergrund subtrahiert wird. Die Schätzung des Hintergrundschwellenwerts für jeden Kanal und jeden Zeitpunkt kann jedoch eine komplexe Aufgabe sein, da er oft räumlich aufgrund von Effekten wie Schattierungen, bei denen die Ecken des Bildes Helligkeitsschwankungen relativ zur Mitte aufweisen, und im Laufe der Zeit aufgrund des Verblassens des Fluorophors (Photobleaching)12 variiert. Obwohl es mehrere mögliche Methoden gibt, schlägt dieses Manuskript vor, die Hintergrundintensität automatisch unter Verwendung der mit dem Isodata-Algorithmus13 erhaltenen Segmentierungsschwelle zu bestimmen, die dann durch polynomiale Regression als Standard über Frames geglättet wird. Räumliche Komponenten, die sich aus der Fluoreszenzheterogenität ergeben, die nicht mit der entfernten Zielzelle inVerbindung steht, wurden bei dieser Methode jedoch ignoriert. Die automatische Schwellenwertbestimmung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, aber der Isodata-Algorithmus lieferte empirisch die besten Ergebnisse. Daher sind die automatische Hintergrundwertsubtraktion und die ratiometrische Berechnung das zweite Hauptmerkmal von AMEBaS (Abbildung 1), das zusammengenommen einen Stapel von Zweikanal-Fluoreszenzmikroskopiebildern als Eingabe empfängt, die Mittellinie der Zelle und den kanalspezifischen Hintergrund schätzt und Kymographen beider Kanäle und ihres Verhältnisses (Hauptausgang #1) nach Hintergrundsubtraktion, Glättung und Ausreißerentfernung ausgibt. zusammen mit einem Stapel ratiometrischer Bilder (Hauptausgabe #2).
AMEBaS wurde mit Fluoreszenzzeitraffern von wachsenden Arabidopsis-Pollenröhrchen getestet, die unter einem Mikroskop aufgenommen wurden, entweder mit ratiometrischen Ca2+ (CaMeleon)8 oder pH (pHluorin)6 Sensoren, die unter dem pollenspezifischen LAT52-Promotor exprimiert wurden. Die Bilder von jedem Kanal wurden alle 4 s aufgenommen, gekoppelt mit einem inversen Mikroskop, einer frontbelichteten Kamera (2560 Pixel × 2160 Pixel, Pixelgröße 6,45 μm), einem Fluoreszenzstrahler und einem Wasserimmersionsobjektiv 63x, 1,2NA. Die für CaMeleon verwendeten Filtereinstellungen waren: Anregung 426-450 nm (CFP) und 505-515 nm (YFP), Emission 458-487 nm (CFP) und 520-550 nm (YFP), während für pHluorin Anregung 318-390 nm (DAPI) und 428-475 nm (FITC), Emission 435-448 nm (DAPI) und 523-536 nm (FITC). Ein vollständiger Datensatz wurde zum Testen bei Zenodo hinzugefügt (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Darüber hinaus wurde die Pipeline mit Wurzelhaardaten getestet, wobei die Bildgebung mit einem Lichtblattmikroskop (SPIM) durchgeführt wurde, wie zuvor beschrieben 15,16, wobei Arabidopsis-Wurzelhaare den genetisch kodierten Ca2+ Reporter NES-YC3.6 unter der Kontrolle des UBQ10-Promotors17 exprimierten. Die selbstgebaute Software LabView, die die Kameraaufnahme, die Probenverschiebung und den Shutter des Lichtblattmikroskops steuerte, ermöglichte die Beobachtung der beiden cpVenus- und CFP-Kanäle, aber auch die Visualisierung ihres Verhältnisses in Echtzeit. Jedes Verhältnisbild des Zeitraffers stellte eine Projektion maximaler Intensität (MIP) zwischen den cpVenus- und CFP-Fluoreszenzkanälen dar, die von 15 Schichten der Probe im Abstand von 3 μm aufgenommen wurden. Das Zeitraffer-cpVenus/CFP-Verhältnis der MIPs wurde gespeichert und direkt für die AMEBaS-Analyse verwendet.
Obwohl diese Pipeline mit mehreren Arten von wachsenden und migrierenden Zellen arbeiten kann, wurde sie speziell entwickelt, um wachsende Zellen zu analysieren, die ausschließlich an der Spitze wachsen, wie z. B. Pollenschläuche, Wurzelhaare und Pilzhyphen, bei denen es eine Entsprechung der nicht wachsenden zytoplasmatischen Regionen zwischen den Frames gibt. Wenn eine solche Entsprechung nicht vorhanden ist, sollte der Benutzer die Option complete_skeletonization in Schritt 1.3.1.1 auswählen (weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion).
Abbildung 1: Ein Überblick über den Pipeline-Workflow. Die AMEBaS-Pipeline analysiert und verarbeitet mikroskopische Zeitraffer in drei Hauptschritten: Einzelzellsegmentierung, Midline-Tracing und Kymograph-Generierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Protocol
1. Interaktives Notebook-Protokoll
Das Jupyter-Notebook kann direkt im Web verwendet werden, indem Google Colab at https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb verwendet wird, auf dem die folgenden Anweisungen basieren. Alternativ ist das Jupyter-Notebook unter https://github.com/badain/amebas verfügbar, wo es heruntergeladen und für die lokale Ausführung in Jupyter konfiguriert werden kann (Anaconda kann einen einfachen und plattformübergreifenden Installationsprozess bereitstellen). Vollständige Testdaten sind bei Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350) zu finden, die ein- und zweikanalige Daten von Arabidopsis-Pollenröhrchen enthalten, die entweder pH- oder Ca2+ -Reporter exprimieren14. Die Pipeline wurde in Teile unterteilt, in denen jeder Schritt durch Klicken auf den Play-Button ausgeführt werden kann, nachdem die benutzerspezifischen Optionen festgelegt wurden. Die für diese Studie notwendigen Dateien sind im AMEBaS-Haupt-ZIP-Ordner (Supplementary Coding File 1) verfügbar.
- Öffnen Sie Jupyter Notebook, und lesen Sie die Zeitrafferdateien.
- Navigieren Sie zur Startseite des oben genannten interaktiven Notizbuchs in Google Colab, oder laden Sie das Notizbuch AMEBaS_Local.ipynb von GitHub herunter und öffnen Sie es.
- Bereiten Sie die Verzeichniseinrichtung für die Ein- und Ausgabedaten vor:
- Wenn Sie die lokale Version verwenden, platzieren Sie den Fluoreszenz-Zeitraffer als TIFF-Datei oder DV-Datei in einem Ordner mit dem Namen data , der sich im Stammordner des Programms befinden muss. Es muss ein Ordner mit dem Namen out erstellt werden, um die generierten Daten zu empfangen. Führen Sie dann den Setup-Codeblock aus.
- Wenn Sie das Notizbuch in Google Colab verwenden, führen Sie den Setup-Codeblock aus, um die Daten - und Ausgangsordner automatisch zu generieren.
- Führen Sie den Codeblock Dateieingabe aus, um die Zeitrafferdaten zu lesen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken. Wenn Sie die Google Colab-Version des Notizbuchs verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Datei auswählen, um die Zeitrafferdatei direkt in den Datenordner hochzuladen.
HINWEIS: Die Anzahl der Kanäle wird automatisch anhand der Größe des Bildes erkannt. - Wählen Sie aus, ob zusätzliche Ausgaben für jeden Schritt generiert werden sollen, indem Sie den Parameter "verbose" auf "True " oder " False" setzen.
- Erkennen Sie die Hauptzelle und das Segment im Hintergrund (Abbildung 2).
- Führen Sie den Codeblock Einzelzellensegmentierung aus, um die gewünschte Zelle automatisch vom Hintergrund zu trennen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.
HINWEIS: Median- und Gauß-Filter werden als Vorverarbeitungsschritt angewendet, um unerwünschtes Rauschen zu entfernen, bevor der Vordergrund vom Hintergrund durch Isodata-Schwellenwerte segmentiert und der Bereich des größten Bereichs isoliert wird, um unerwünschte Artefakte zu entfernen.- Passen Sie den Sigma-Wert an, der von der Gauß-Funktion in der Variablen "Sigma" verwendet wird, um die Glätte der Segmentierungsmaske fein abzustimmen. Der Standardwert ist 2,0.
- Legen Sie die Variablenschätzung auf False fest, um den aus Isodata geschätzten Schwellenwert direkt zu speichern, oder auf True , um ihn mithilfe der lokalen Polynomregression (LOESS) über benachbarte Frames hinweg zu glätten. Passen Sie die Funktion an, indem Sie die n_points Variable ändern. Der Standardwert ist 40.
- Führen Sie den Codeblock Einzelzellensegmentierung aus, um die gewünschte Zelle automatisch vom Hintergrund zu trennen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.
- Zeichnen Sie die Mittellinie entlang der Zellverlängerung nach (Abbildung 3).
- Führen Sie den Codeblock Cell Midline Tracing aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken, um die Zelle mithilfe der Lee-Methode18 automatisch zu skelettieren und die Spitze des letzten Skeletts durch lineare Extrapolation zu verlängern.
- Wählen Sie aus, ob die Mittellinie nur auf dem letzten Frame oder einmal pro Frame nachgezeichnet werden soll, indem Sie das Argument complete_skeletonization anpassen.
HINWEIS: Wenn alle Frames skelettiert sind, wird die Extrapolation übersprungen. - Legen Sie den Anteil der Punkte im Skelett fest, der während der Extrapolation interpoliert werden soll, indem Sie die Variable interpolation_fraction anpassen. Der Standardwert ist 0,25.
- Wählen Sie die Länge der Mittellinienextrapolation aus, indem Sie die Variable extrapolation_length ändern. Der Standardwert ist -1, wodurch das Skelett bis zur nächsten Kante verlängert wird.
- Wählen Sie aus, ob die Mittellinie nur auf dem letzten Frame oder einmal pro Frame nachgezeichnet werden soll, indem Sie das Argument complete_skeletonization anpassen.
- Führen Sie den Codeblock Cell Midline Tracing aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken, um die Zelle mithilfe der Lee-Methode18 automatisch zu skelettieren und die Spitze des letzten Skeletts durch lineare Extrapolation zu verlängern.
- Generieren Sie Kymographen für jeden Kanal ( Abbildung 4).
- Führen Sie den ersten Codeblock für die Datenvisualisierung aus, indem Sie auf die Schaltfläche " Wiedergabe" klicken, um automatisch Kymographen für beide Kanäle zu generieren.
- Wählen Sie die Größe des Gaußschen Kerns, der für die Glättung verwendet wird, indem Sie die Variable kymograph_kernel anpassen.
HINWEIS: Sie entspricht der Größe der Nachbarschaft (in Pixeln), über die die Pixelintensitäten gemittelt werden. Der Standardwert ist 3 Pixel x 3 Pixel. - Nicht verlängerte Skelette erzeugen gekappte Kymographen, die eine benutzerdefinierte Farbkarte verwenden müssen, um ihre Intensitäten korrekt anzuzeigen. Wählen Sie den prozentualen Anteil der Intensitäten, die der Hintergrundfarbe Schwarz zugewiesen werden, und passen Sie die Variable shift_fraction an. Der Standardwert ist 0,7.
- Wählen Sie die Größe des Gaußschen Kerns, der für die Glättung verwendet wird, indem Sie die Variable kymograph_kernel anpassen.
- Führen Sie den ersten Codeblock für die Datenvisualisierung aus, indem Sie auf die Schaltfläche " Wiedergabe" klicken, um automatisch Kymographen für beide Kanäle zu generieren.
- Berechnen Sie das Verhältnis zwischen den Kanälen (Abbildung 5).
- Führen Sie den zweiten Codeblock für die Datenvisualisierung aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken, um automatisch einen ratiometrischen Kymographen und einen ratiometrischen Zeitraffer zu generieren (Abbildung 6).
HINWEIS: Dieser Schritt ist nur verfügbar, wenn Sie Dual-Channel-Zeitraffer verwenden. Der in Schritt 1.2.1.2 gespeicherte Schwellenwert für die Hintergrundintensität wird von jedem Kanal subtrahiert.- Passen Sie die Variable switch_ratio an, um die Reihenfolge der Kanäle zu ändern, die bei der Berechnung des Verhältnisses als Zähler und Nenner verwendet werden. Der Standardwert ist False.
- Wählen Sie aus, ob das Zeitrafferverhältnis mit einem Median-Filterdurchlauf weiter geglättet werden muss, indem Sie die Variable smooth_ratio anpassen. Der Standardwert ist False.
- Wählen Sie aus, ob Ausreißer, die durch das Low-Signal des Nennerkanals erzeugt werden, durch Manipulation der Variablen reject_outliers entfernt werden sollen. Der Standardwert ist True und definiert Ausreißer als Werte, die dem 1,5-fachen des Interquartilsabstands über dem dritten Quartil (wo 75 % der Werte liegen) entsprechen.
- Wählen Sie aus, ob der Hintergrund in der ratiometrischen Ausgabe exportiert werden soll, indem Sie die Variable background_ratio anpassen. Der Standardwert ist False, wodurch er durch Nullen ersetzt wird.
- Führen Sie den zweiten Codeblock für die Datenvisualisierung aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken, um automatisch einen ratiometrischen Kymographen und einen ratiometrischen Zeitraffer zu generieren (Abbildung 6).
Abbildung 2: Schritt der Einzelzellsegmentierung. Bildverarbeitungstechniken wie Filterung, Schwellwertbildung und Bereichsbeschriftung werden verwendet, um das interessierende Signal zu isolieren (Schritt 1.2). Diese speziellen Daten enthielten die folgenden Werte für die niedrigste Intensität: 2556, den Median: 3441 und die höchste Intensität: 32125. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Übersicht über die Mittellinienverfolgung - Die Mittellinie der einzelnen Zelle wird durch Berechnung ihres Skeletts (weiß) ermittelt. Die Spitze (Magenta) wird linear von den letzten Punkten am Ende des Skeletts extrapoliert (Schritt 1.3). In dieser Komposition werden sowohl die Mittellinie als auch ihre Spitze über die ursprüngliche Zelle gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zeitraffer-Kymographen - Vergleich der Kymographen für jeden Kanal, der mit ausgeschaltetem "complete_skeletonization" erzeugt wurde (Schritt 1.4). Die vertikale Achse beschreibt den Verlauf der Zeit, und die horizontale Achse stellt die durchschnittliche Intensität des extrapolierten Mittellinienpfads dar, dem eine einzelne Zelle folgt. Für diese speziellen Daten stellt die Farbkarte die folgenden Werte für Kanal 1 (Niedrigste Intensität): 2886, Median: 3167, Höchste Intensität: 21021 dar. Kanal 2 Niedrigste Intensität: 3030, Median: 3400, Höchste Intensität: 29688. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Glättung des Hintergrundschwellenwerts - Der Schwellenwert für die Hintergrundsegmentierung wird über den Isodata-Algorithmus geschätzt und dann über die lokale polynomiale Regression geglättet (Schritt 1.5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Ratiometrische Ergebnisse- (A) Vergleich zwischen dem letzten Frame des ratiometrischen Zeitraffers und dem segmentierten ursprünglichen ersten Kanal. (B) Kymograph, der aus dem ratiometrischen Zeitraffer (Schritt 1.5) generiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Protokoll für den Batch-Modus
- Laden Sie die Datei pipeline.py aus dem AMEBaS GitHub-Repository herunter und legen Sie sie im selben Verzeichnis wie die Daten ab.
- Geben Sie den Speicherort der Datei in der Befehlszeile nach der Programmdatei ein.
- Fügen Sie - -v als Positionsargument ein, um die internen Schritte der Pipeline anzuzeigen, falls gewünscht.
- Schließen Sie --s ein, um den Sigma-Wert auszuwählen, der im Vorverarbeitungsschritt des Gaußschen Filters in Vorbereitung auf die Zellsegmentierung verwendet wird. Der Standardwert ist 2.
- Fügen Sie - -a ein, um die Mittellinie für jedes Bild des Zeitraffers nachzuzeichnen. Standardmäßig verwendet die Pipeline nur den letzten Frame.
- Fügen Sie - -f ein, um den Bruchteil [0,1] des Skeletts auszuwählen, der in der Interpolation verwendet werden soll. Der Standardwert ist 0,25.
- Fügen Sie -e ein, um die Länge des extrapolierten Skeletts in Pixeln auszuwählen. Der Standardwert ist -1, wodurch das Skelett bis zur nächsten Kante verlängert wird.
- Fügen Sie - -sf ein, um den Anteil des Farbbereichs auszuwählen, der in nicht extrapolierten Kymographen in den Hintergrund verschoben wird. Der Standardwert ist 0,7.
- Fügen Sie - -k ein, um die Größe des Kernels zu bestimmen, der in der Gaußschen Filterung des kymographen verwendet wird. Der Standardwert ist 3.
- Fügen Sie --eb ein, um die globale Intensität des Hintergrundschwellenwerts über die polynomiale LOESS-Regression der framespezifischen Hintergrundschwellenwertintensitäten zu schätzen.
- Passen Sie die Anzahl der Punkte an, die bei der LOESS-Glättung der Hintergrundschwellenwerte verwendet werden, indem Sie den Parameter - -n ändern. Der Standardwert ist 40.
- Wechseln Sie die Kanäle, die als Zähler und Nenner bei der Berechnung des Verhältnisses verwendet werden, einschließlich - r oder - -switch_ratio, wenn der Zeitraffer zwei Kanäle hat. Standardmäßig ist der zweite Kanal der Zähler und der erste der Nenner.
- Wählen Sie aus, ob das Zeitrafferverhältnis mit einem Medianfilter-Durchlauf mit dem Argument - -sm weiter geglättet werden muss. Der Standardwert ist False.
- Schließen Sie -o ein, um Pixel mit abnormaler Intensität während der ratiometrischen Zeitraffererzeugung abzulehnen.
- Wählen Sie mit dem Argument - -b aus, ob der Hintergrund in der ratiometrischen Ausgabe exportiert werden soll. Der Standardwert ist False, wodurch er durch Nullen ersetzt wird.
- Drücken Sie die Eingabetaste, um auszuführen. Die Ausgabe wird im selben Verzeichnis wie die Programmdatei erzeugt.
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Representative Results
Die AMEBaS-Pipeline automatisiert die Extraktion der Mittelliniendynamik polarisierter Einzelzellen aus fluoreszenzmikroskopischen Bildstapeln, wodurch sie weniger zeitaufwändig und weniger anfällig für menschliche Fehler ist. Die Methode quantifiziert diese Zeitspanner durch die Erzeugung von Kymographen und ratiometrischen Bildstapeln (Abbildung 1) in wachsenden Einzelzellen. Es kann so eingestellt werden, dass es an der Migration einzelner Zellen arbeitet, aber weitere Experimente sind notwendig. AMEBaS ist in Python als interaktives Jupyter Notebook implementiert (beschrieben im Abschnitt Interaktives Notebook-Protokoll), das eine einfachere Verwendung ohne Programmierkenntnisse ermöglicht, und als Befehlszeilenwerkzeug (im Abschnitt Batch-Modus-Protokoll), in dem mehrere Stacks mit demselben Parametersatz analysiert werden können. Obwohl entweder ein oder zwei Fluoreszenzkanäle verwendet werden können, sollten ratiometrische Sonden mit zwei Emissionskanälen zuverlässigere Ergebnisse liefern, da die Fluoreszenzemission des ungebundenen Zustands der Sonde die räumliche Heterogenität, die durch die ungleichmäßige Verteilung des Proteins im Zytoplasma verursacht wird, verringern kann.
Die Pipeline liefert zunächst eine binäre Maske der größten Zelle auf dem stärksten Kanal, die als TIF-Datei mit dem Namen Filename_binary_mask.tiff exportiert wird (Abbildung 2). Schwellwertschätzungen, die mit Isodaten für jeden Kanal erhalten wurden, werden optional mit Löss geglättet und in der Tabelle Filename_background_treshold.csv gespeichert (Abbildung 5). Die Mittellinie der Zelle, die aus der binären Maske extrahiert wurde, wird als TIF-Datei mit dem Namen Filename_skeletonized.tiff exportiert (Abbildung 3). Kymographen jedes Kanals werden von der Mittellinie aus hergestellt, die als Filename_kymograph_c_*.csv bezeichnet wird, wobei * der Kanalnummer entspricht (Abbildung 4). Schließlich wird ein ratiometrischer Kymograph als Filename_kymograph_ratio.csv gespeichert, während der gesamte ratiometrische Stack als Filename_ratiometric.tiff bezeichnet wird (Abbildung 6). Diagramme, die Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6 entsprechen, werden optional als PNG-Dateien gespeichert, wenn 'verbose == True' oder '--v' vom Benutzer im ersten Codeblock (Schritt 1.1) angegeben wird.
Diese Ergebnisse können mit anderen Bildanalyse-Pipelines gekoppelt werden, um die raumzeitliche Dynamik der Zelle weiter zu untersuchen, wie z. B. CHUKNORRIS8, das die Kymographen jedes Kanals als Eingabe nimmt und eine Wachstumsratenanalyse mit Subpixelauflösung zusammen mit verschiedenen Zeitreihenanalysemethoden durchführt.
AMEBaS wurde an Pollenschlauch-Datensätzen mit genetisch kodierten ratiometrischen Fluoreszenzreportern für intrazelluläres Ca2+ (CaMeleon; Abbildung 7A,B) und H+ (pHluorin; Abbildung 7C,D) Konzentrationen, die mit einem optischen Fluoreszenzmikroskop gemessen wurden, sowie die Projektion der maximalen Intensität der cpVenus/CFP-Verhältnisse von wachsenden Wurzelhaaren, die das CaMeleon NES-YC3.6 exprimieren (Abbildung 7E,F), das mit einem Lichtblattmikroskop aufgenommen wurde, wie zuvor beschrieben 15,16. Die Pipeline funktionierte trotz Unterschieden in der Wachstumsrichtung, den bildgebenden Verfahren, den Fluoreszenzreportern und den Zelltypen erfolgreich. Segmentierung, Mittellinienverfolgung und Kymographenextraktion werden für diese Datensätze gezeigt (Abbildung 7), was das Potenzial der Anwendung von AMEBaS auf eine breite Palette von Versuchsanordnungen zeigt.
Abbildung 7: Repräsentative Ergebnisse für verschiedene Fluoreszenz-Bilddatensätze von spitzenwachsendenZellen. (A,B) Pollenschlauch, der den Ca2+ Reporter Cameleon exprimiert; (C,D) Pollenröhrchen, die den pH-Indikator pHluorin exprimieren; (E,F) Wurzelhaare, die den Ca2+ Reporter NES-YC3.6 exprimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: AMEBaS-main.zip. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die hier vorgestellte neuartige Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Analyse von fluoreszenzmikroskopischen Bildstapeln polarisierter Zellen zu rationalisieren und zu automatisieren. Aktuelle Methoden, die in der Literatur beschrieben werden, wie z. B. ImageJ Kymograph-Plugins, erfordern eine manuelle Verfolgung der Mittellinie der polarisierten Zelle von Interesse, eine Aufgabe, die nicht nur zeitaufwändig, sondern auch anfällig für menschliche Fehler ist. Da die Definition der Mittellinie in dieser Pipeline durch eine numerische Methode18,19 unterstützt wird, die eine Skelettierung durchführt, wird die subjektive Bewertung entfernt, wodurch ein quantitativer Standard in das Verfahren eingeführt wird. Dies ist besonders nützlich für Forscher mit großen Datenmengen, mit der Möglichkeit, die Pipeline an unterschiedliche Anforderungen anzupassen, einschließlich der Extraktion der Mittellinie für jeden Frame. Darüber hinaus ist die Subtraktion des Hintergrundwerts oft willkürlich, wobei ein einzelner Hintergrundwert für alle Frames eines bestimmten Kanals von Hand ausgewählt wird. Hier wird die Isodatensegmentierung verwendet, um den Hintergrundschwellenwert für jedes Bild objektiv zu bestimmen und ihn (optional) mit einer lokalen polynomialen Regression zu glätten, um langfristige Änderungen der Fluoreszenz zu erfassen, die durch Ausbleichen (Photobleaching) verursacht werden. Während die möglichen Artefakte und sekundären Elemente im Hintergrund ignoriert werden, indem das größere Objekt nach Pixelfläche ausgewählt wird, können andere Methoden, wie z.B. FRET-IBRA12, verwendet werden, um Effekte wie Schattierungen zu entfernen. Räumliche Artefakte (z. B. Schattierungen) können die Form der Zelle beeinflussen, die durch Schwellenwerte segmentiert ist, was die Verzerrung des Farbverlaufs zu einer Seite der Röhre erklären kann, die in dem ratiometrischen Film auf dem AMEBaS-Logo zu sehen ist (siehe GitHub-Seite oder Colab-Notebook).
Nichtsdestotrotz gibt es immer noch einige Situationen, in denen die vorgestellte Pipeline versagen kann und nicht als Wunderwaffe in Betracht gezogen werden sollte. Besondere Aufmerksamkeit ist bei der Bildaufnahme geboten, da große Störungen die Fähigkeit des Algorithmus, die Zielzelle zu segmentieren, beeinträchtigen können. Die Vorverarbeitung des Bildstapels sollte in Betracht gezogen werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen und unerwünschte Elemente und insgesamt fehlerhafte Frames zu entfernen.
Die Parameter wurden mit dem Ziel ausgewählt, einzelne apikal wachsende Zellen unter Berücksichtigung eines begrenzten Datensatzes von Arabidopsis-Pollenröhrchen zu analysieren, die Ionenkonzentrationen mit fluoreszierenden Reportern messen. Daher können andere Daten eine sinnvolle Auswahl von Parametern erfordern. Vorverarbeitungsfilter glätten die Daten mit dem Ziel, nach der Segmentierung (Schritt 1.2) eine saubere binäre Maske zu erzeugen, so dass der Sigma-Wert, der für die Gauß- und Medianfilter verwendet wird, für verrauschtere Daten erhöht oder verringert werden kann, wenn die Ergebnisse übermäßig geglättet werden. Es wird angenommen, dass die Position der binären Maske, die im stärksten Kanal erhalten wird, mit der Position des schwächsten Kanals identisch ist, was ein Problem darstellen kann, wenn die Position der Zelle in beiden Kanälen nicht identisch ist. Ist dies der Fall, muss entweder für jeden Kanal unterschiedliche Masken verwendet werden oder es muss eine Bildregistrierung durchgeführt werden, wie es in FRET-IBRA12 der Fall ist.
Die Skelettierung erfolgt standardmäßig ausschließlich im letzten Frame (Schritt 1.3), der von einer spitzenwachsenden Zelle ausgeht, die den Ort ihres Zytoplasmas im Laufe der Zeit beibehält (außer an der Spitze). Durch die Erweiterung des Skeletts ist es möglich, Kymographen zu generieren, die eine Analyse der Wachstumsrate auch mit Subpixelauflösung ermöglichen, mit Methoden wie CHUKNORRIS8. Diese Verlängerung erfolgt durch lineare Extrapolation unter Berücksichtigung der ersten 25 %-Punkte in der wachsenden Spitze des Skeletts (Schritt 1.3) und kann durch Anpassung des interpolation_fraction von 0 % auf 100 %-Punkte des gesamten Skeletts eingestellt werden. Wenn die Zelle jedoch zwischen den Frames driftet oder es sich um eine migrierende Zelle handelt, wird die Analyse der Wachstumsrate komplexer. In einem solchen Szenario können für jeden Frame unabhängige Skelette mit den Parametern complete_skeletonization=TRUEgeneriert werden, wodurch Skelette ohne extrazelluläre Ausdehnung erzeugt werden. Es wäre immer noch möglich, die Wachstumsrate zu analysieren, aber die Auflösung wäre durch die binäre Maske begrenzt, die mit dem Isodata-Schwellwert erzeugt wird. Darüber hinaus geht der resultierende Kymograph davon aus, dass aufeinanderfolgende Skelette anhand ihrer Standardkoordinaten ausgerichtet werden können, was, wenn er nicht zutrifft, ihn für die Analyse der intrazellulären Dynamik ungeeignet macht.
Bei der Generierung von Kymographen (Schritt 1.4) verwendet AMEBaS die Mittelwertbildung mit einem Gaußschen Kern anstelle des traditionellen Pixelrands um die Mittellinie. Der Standardwert von 3x3 ist die kleinstmögliche Größe, die erhöht werden kann, wenn die Daten zu verrauscht sind und/oder wenn die Zelle groß ist. Dieser Schritt kann jedoch zu einer übermäßigen Glättung führen, in diesem Fall sollte der Filter ganz ausgeschaltet werden, indem kymograph_kernel = 0 eingestellt wird. Schließlich kann der für jedes Bild jedes Kanals geschätzte Hintergrund geglättet werden, wenn der Benutzer ein Ausbleichen (Photobleaching) erwartet oder die Rohschätzungen verwendet werden (Schritt 1.5). Die Glättung der Hintergrundwerte mit der LOESS-Polynomregression (Schritt 1.5) kann eingestellt werden, indem die Anzahl der im Fenster verwendeten Punkte n_points auf mindestens 3 und die maximale Anzahl der Frames im Stapel (automatisch gedeckelt) eingestellt wird. Eine einfachere Funktion, die die Hintergrundänderung im Zeitverlauf beschreibt, kann mit einem größeren Fenster erreicht werden, was zu einer gröberen Anpassung führt.
Da diese Methode mehrere manuelle Schritte konsolidiert, die typischerweise von Forschern durchgeführt werden, ist die AMEBaS-Pipeline ein effizienteres, unvoreingenommeneres und präziseres Ansatzwerkzeug zur Analyse des raumzeitlichen Verhaltens von Zeitraffern einzelner polarisierter Zellen. In Zukunft hat diese Methode das Potenzial, erweitert zu werden, um die Analyse von wandernden Einzelzellen zu unterstützen. Darüber hinaus sind weitere Analysen erforderlich, um die Leistung dieser Methode über ein breiteres Spektrum von Zelltypen hinweg zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren dieses Manuskripts erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich für die FAPESP-Zuschüsse 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 Grant GM131043 und die NSF-Zuschüsse MCB1714993, MCB1930165 für die finanzielle Unterstützung. Die Wurzelhaardaten wurden mit der Infrastruktur und unter der Aufsicht von Prof. Andrea Bassi und Prof. Alex Costa erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
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