Summary
Polarize tek hücrelerin hücre içi dinamiklerini analiz etmek için mevcut yöntemler genellikle manueldir ve standardizasyondan yoksundur. Bu makale, tek polarize hücrelerin orta hat ekstraksiyonunu otomatikleştirmek ve kullanıcı dostu bir çevrimiçi arayüzde zaman atlamalarından uzay-zamansal davranışı ölçmek için yeni bir görüntü analizi boru hattı sunmaktadır.
Abstract
Hücre polaritesi, hücre altı düzeyde özel alanların ortaya çıkmasıyla sonuçlanan, uzamsal olarak konsantre moleküller ve yapılar topluluğu tarafından kurulan makroskopik bir fenomendir. Hücre bölünmesi, büyümesi ve göçü gibi temel biyolojik işlevlerin altında yatan asimetrik morfolojik yapıların geliştirilmesiyle ilişkilidir. Ek olarak, hücre polaritesinin bozulması, kanser ve mide displazisi gibi doku ile ilgili bozukluklarla ilişkilendirilmiştir.
Bireysel polarize hücrelerde floresan raportörlerin uzay-zamansal dinamiklerini değerlendirmek için mevcut yöntemler, genellikle hücrelerin ana ekseni boyunca bir orta hattı izlemek için manuel adımlar içerir, bu da zaman alıcıdır ve güçlü önyargılara eğilimlidir. Ayrıca, oransal analiz, iki floresan kanalı kullanarak raportör moleküllerin eşit olmayan dağılımını düzeltebilse de, arka plan çıkarma teknikleri genellikle keyfidir ve istatistiksel destekten yoksundur.
Bu makale, bir hücre polaritesi modeli kullanarak tek hücrelerin uzay-zamansal davranışını otomatikleştirmek ve ölçmek için yeni bir hesaplama hattı sunmaktadır: polen tüpü/kök kılı büyümesi ve sitozolik iyon dinamikleri. Oransal görüntüleri işlemek ve hücre içi dinamiklerin ve büyümenin nicel bir temsilini çıkarmak için üç aşamalı bir algoritma geliştirildi. İlk adım, hücreyi arka plandan bölümlere ayırır ve piksel yoğunluğu uzayında bir eşikleme tekniği aracılığıyla ikili bir maske üretir. İkinci adım, bir iskeletleştirme işlemi yoluyla hücrenin orta hattından geçen bir yolu izler. Son olarak, üçüncü adım, işlenen verileri bir oransal zaman atlamalı olarak sağlar ve bir oransal kimograf (yani, zaman içinde bir 1B uzamsal profil) verir. Büyüyen polen tüplerinden genetik olarak kodlanmış floresan raportörlerle elde edilen oransal görüntülerden elde edilen veriler, yöntemi karşılaştırmak için kullanıldı. Bu boru hattı, polarize hücrelerin orta hattı boyunca uzay-zamansal dinamiklerin daha hızlı, daha az önyargılı ve daha doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlar, böylece hücre polaritesini araştırmak için mevcut nicel araç setini geliştirir. AMEBaS Python kaynak kodu şu adreste mevcuttur: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Hücre polaritesi, uzamsal olarak konsantre moleküller ve yapılardan oluşan bir koleksiyonun uyumlu eyleminin, özel morfolojik hücre altı alanlarınkurulmasıyla sonuçlandığı temel bir biyolojik süreçtir 1. Hücre bölünmesi, büyümesi ve göçü bu tür polarite bölgelerine dayanırken, kaybı epitel doku ile ilgili bozukluklarda kanserle ilişkilendirilmiştir2.
Apikal olarak büyüyen hücreler, uçtaki polarite bölgesinin tipik olarak hücre dışı ipuçlarına yeniden yöneldiğidramatik bir polarite örneğidir 3. Bunlar, çoklu hücresel süreçlerin hücrenin ucundan sapa doğru belirgin farklılıklar gösterdiği nöritler, mantar hifleri, kök kılları ve polen tüplerinin geliştirilmesini içerir. Polen tüplerinde, özellikle, aktin polimerizasyonu, vezikül kaçakçılığı ve iyonik konsantrasyonlar, uç odaklıgradyanlar 4 göstererek belirgin şekilde polarize olur. Polen tüpleri, çiçekli bitkilerin erkek gametofitleridir ve tek bir hücre için bilinen en hızlı büyüme oranlarından birinde yalnızca hücrenin tepesinde büyüyerek sperm hücrelerini ovüle iletmekten sorumludur. Kalsiyum 5 (Ca2+) ve protonlar 6 (H+) gibi iyonların uç odaklı gradyanları, çift döllenme 5,6 ile sonuçlanan ana biyolojik işlevini yerine getirmek için gerekli olan polen tüpü büyümesinin sürdürülmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, apikal olarak büyüyen hücrelerin orta hattı boyunca uzay-zamansal dinamikleri analiz etmek için kantitatif yöntemler, polarize büyümenin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için gereklidir 7,8,9. Araştırmacılar genellikle kimografileri, yani hücrenin orta hattının (örneğin sütunlar) zaman içinde (örneğin satırlar) piksel yoğunluklarını temsil eden ve diyagonalde hücre büyümesini ve göçünü görselleştirmeye izin veren bir matris kullanırlar (Şekil 1). Kullanışlılıklarına rağmen, kimografiler sıklıkla orta hattı manuel olarak izleyerek çıkarılır, önyargılara ve insan hatalarına eğilimlidir ve aynı zamanda oldukça zahmetlidir. Bu, burada tanıtılan AMEBaS adlı boru hattının ilk özelliği olan otomatik bir orta hat ekstraksiyon yöntemini gerektirir: Polarizetek hücrelerin oransal floresan zaman atlamalarının utomatik bir Midline Extraction ve Background Sgeri çekilmesi.
Deneysel prosedürler açısından, tek hücrelerde ilgilenilen iyonların/moleküllerin/türlerin kantitatif görüntülenmesi, genetik olarak kodlanmış floresan problar10 ile elde edilebilir. Sürekli genişleyen seçenekler arasında, oransal problar, ilgilenilen moleküllere bağlı/bağlanmamış olduklarında farklı floresan dalga boyları yaydıkları için en doğru olanlardan biridir11. Bu, probun hücre içi konsantrasyonundaki uzamsal heterojenliğin, kanala özgü arka planları çıkarılmış iki kanalın oranını kullanarak düzeltilmesine izin verir. Bununla birlikte, her kanal ve zaman noktası için arka plan eşiğini tahmin etmek karmaşık bir görev olabilir, çünkü görüntünün köşelerinin merkeze göre parlaklık değişimine sahip olduğu gölgeleme gibi efektler nedeniyle ve floroforun solması (foto ağartma) nedeniyle zaman içinde genellikle uzayda değişir12. Birden fazla olası yöntem olmasına rağmen, bu makale, Isodata algoritması13 ile elde edilen segmentasyon eşiğini kullanarak arka plan yoğunluğunun otomatik olarak belirlenmesini önermektedir ve bu daha sonra standart olarak polinom regresyon yoluyla çerçeveler arasında yumuşatılmaktadır. Bununla birlikte,12'de çıkarılan hedef hücre ile ilgisi olmayan floresan heterojenliğinden kaynaklanan uzamsal bileşenler bu yöntemle göz ardı edildi. Otomatik eşikleme birkaç yöntemle gerçekleştirilebilir, ancak Isodata algoritması ampirik olarak en iyi sonuçları verdi. Bu nedenle, otomatik arka plan değeri çıkarma ve oransal hesaplama, birlikte ele alındığında, çift kanallı floresan mikroskobu görüntülerinin bir yığınını girdi olarak alan, hücrenin orta hattını ve kanala özgü arka planı tahmin eden ve arka plan çıkarma, yumuşatma ve aykırı değer kaldırma işleminden sonra her iki kanalın ve oranlarının (ana çıkış #1) kymograflarını çıkaran AMEBaS'ın (Şekil 1) ikinci ana özelliğidir. bir yığın ratiometrik görüntü ile birlikte (ana çıktı #2).
AMEBaS, polene özgü LAT52 promotörü altında eksprese edilen Ca2+ (CaMeleon)8 veya pH (pHluorin)6 oranlı sensörler ile mikroskop altında elde edilen büyüyen Arabidopsis polen tüplerinin floresan zaman atlamaları ile test edildi. Her kanaldan alınan görüntüler, ters çevrilmiş bir mikroskop, önden aydınlatmalı bir kamera (2560 piksel × 2160 piksel, piksel boyutu 6.45 μm), bir floresan aydınlatıcı ve 63x, 1.2NA suya daldırma objektif lensi ile birlikte her 4 saniyede bir çekildi. CaMeleon için kullanılan filtre ayarları şunlardı: uyarma 426-450 nm (CFP) ve 505-515 nm (YFP), emisyon 458-487 nm (CFP) ve 520-550 nm (YFP), pHluorin için uyarma 318-390 nm (DAPI) ve 428-475 nm (FITC), emisyon 435-448 nm (DAPI) ve 523-536 nm (FITC). Zenodo'da test için eksiksiz bir veri seti eklendi (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Ek olarak, boru hattı, daha önce tarif edildiği gibi bir ışık tabakası mikroskobu (SPIM) ile görüntülemenin yapıldığı kök kıl verileriyle test edildi 15,16 UBQ10 promotörü 17'nin kontrolü altında genetik olarak kodlanmış Ca 2+ raportör NES-YC3.6'yı eksprese eden Arabidopsiskök kılları ile. Işık tabakası mikroskobunun kamera alımını, örnek çevirisini ve deklanşörünü kontrol eden ev yapımı LabView yazılımı, iki cpVenus ve CFP kanalının gözlemlenmesine ve aynı zamanda oranlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi. Hızlandırılmış çekimin her oran görüntüsü, 3 μm aralıklı numunenin 15 diliminden elde edilen cpVenus ve CFP floresan kanalları görüntüleri arasında bir maksimum yoğunluk projeksiyonunu (MIP) temsil ediyordu. MIP'lerin hızlandırılmış cpVenüs/CFP oranı kaydedildi ve doğrudan AMEBaS analizi için kullanıldı.
Bu boru hattı, birden fazla büyüyen ve göç eden hücre türüyle çalışabilmesine rağmen, çerçeveler arasında büyümeyen sitoplazmik bölgelerin bir yazışmasının olduğu polen tüpleri, kök kılları ve mantar hifleri gibi yalnızca uçta büyüyen büyüyen hücreleri analiz etmek için özel olarak tasarlanmıştır. Böyle bir yazışma olmadığında, kullanıcı adım 1.3.1.1'deki complete_skeletonization seçeneğini seçmelidir (daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın).
Şekil 1: İşlem hattı iş akışına genel bakış. AMEBaS boru hattı, mikroskobik zaman atlamalarını üç ana adımda analiz eder ve işler: Tek Hücreli Segmentasyon, Orta Hat İzleme ve Kymograph Oluşturma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etkileşimli not defteri protokolü
Jupyter not defteri, aşağıdaki talimatların temel alındığı https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb'de Google Colab kullanılarak doğrudan web'de kullanılabilir. Alternatif olarak, Jupyter not defteri https://github.com/badain/amebas'da kullanılabilir ve burada Jupyter'da yerel olarak çalışacak şekilde indirilebilir ve yapılandırılabilir (Anaconda kolay ve platformlar arası yükleme işlemi sağlayabilir). Zenodo'da (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), pH veya Ca2+ raportörlerini ifade eden Arabidopsis polen tüplerinin tek ve çift kanallı verilerini içeren eksiksiz bir test verisi bulunabilir14. Boru hattı, kullanıcıya özel seçenekleri ayarladıktan sonra oynat düğmesine tıklanarak her adımın yürütülebileceği bölümlere ayrılmıştır. Bu çalışma için gerekli dosyalar AMEBaS- ana zip klasöründe (Ek Kodlama Dosyası 1) mevcuttur.
- Jupyter not defterini açın ve hızlandırılmış dosyaları okuyun.
- Yukarıda belirtilen Google Colab'daki etkileşimli not defterinin ana sayfasına gidin veya GitHub'dan AMEBaS_Local.ipynb not defterini indirip açın.
- Giriş ve çıkış verileri için dizin kurulumunu hazırlayın:
- Yerel sürümü kullanıyorsanız, floresan zaman atlamalı modunu bir TIFF dosyası veya DV dosyası olarak programın kök klasöründe olması gereken data adlı bir klasörün içine yerleştirin. Oluşturulan verileri almak için out adlı bir klasör oluşturulmalıdır. Ardından Kurulum kod bloğunu çalıştırın.
- Not defterini Google Colab'de kullanıyorsanız, verileri ve çıkış klasörlerini otomatik olarak oluşturmak için Kurulum kod bloğunu çalıştırın.
- Oynat düğmesine tıklayarak hızlandırılmış verileri okumak için Dosya Girişi kod bloğunu çalıştırın. Not defterinin Google Colab sürümünü kullanıyorsanız, hızlandırılmış dosyayı doğrudan veri klasörüne yüklemek için Dosya Seç düğmesine tıklayın.
NOT: Kanal sayısı, görüntünün boyutuna göre otomatik olarak algılanacaktır. - 'ayrıntılı' parametresini Doğru veya Yanlış olarak ayarlayarak her adımın ek çıktılarının oluşturulup oluşturulmayacağını seçin.
- Ana hücreyi ve segmenti arka plandan tespit edin (Şekil 2).
- Oynat düğmesine tıklayarak ilgilenilen hücreyi arka plandan otomatik olarak ayırmak için Tek Hücre Segmentasyonu kod bloğunu çalıştırın.
NOT: Medyan ve Gauss filtreleri, istenmeyen artefaktları kaldırmak için İzoveri eşiklemesi ve en geniş alanın bölgesini izole ederek ön planı arka plandan bölümlere ayırmadan önce istenmeyen gürültüyü gidermek için bir ön işleme adımı olarak uygulanacaktır.- Segmentasyon maskesinin düzgünlüğüne ince ayar yapmak için 'sigma' değişkeninde Gauss tarafından kullanılan sigma değerini ayarlayın. Varsayılan değer 2.0'dır.
- Isodata'dan tahmin edilen eşiği doğrudan depolamak için estimate değişkenini False olarak veya yerel polinom regresyon (LOESS) kullanarak komşu çerçeveler arasında yumuşatmak için True olarak ayarlayın. n_points değişkenini değiştirerek işlevine ince ayar yapın. Varsayılan değer 40'tır.
- Oynat düğmesine tıklayarak ilgilenilen hücreyi arka plandan otomatik olarak ayırmak için Tek Hücre Segmentasyonu kod bloğunu çalıştırın.
- Hücre uzantısı boyunca orta çizgiyi izleyin (Şekil 3).
- Lee'nin yöntemi18'i kullanarak hücreyi otomatik olarak iskeletleştirmek ve doğrusal ekstrapolasyon yoluyla son iskeletin ucunu uzatmak için oynat düğmesine tıklayarak Hücre Orta Hattı İzleme kod bloğunu çalıştırın.
- Orta çizgiyi yalnızca son karede veya complete_skeletonization bağımsız değişkenini ayarlayarak kare başına bir kez izlemeyi seçin.
NOT: Tüm çerçeveler iskeletleştirildiğinde, ekstrapolasyon atlanır. - interpolation_fraction değişkenini ayarlayarak ekstrapolasyon sırasında enterpolasyon yapılacak iskeletteki noktaların oranını ayarlayın. Varsayılan değer 0,25'tir.
- Değişken extrapolation_length değiştirerek orta çizgi ekstrapolasyonunun uzunluğunu seçin. Varsayılan değer, iskeleti en yakın kenara kadar uzatan -1'dir.
- Orta çizgiyi yalnızca son karede veya complete_skeletonization bağımsız değişkenini ayarlayarak kare başına bir kez izlemeyi seçin.
- Lee'nin yöntemi18'i kullanarak hücreyi otomatik olarak iskeletleştirmek ve doğrusal ekstrapolasyon yoluyla son iskeletin ucunu uzatmak için oynat düğmesine tıklayarak Hücre Orta Hattı İzleme kod bloğunu çalıştırın.
- Her kanal için kimografiler oluşturun ( Şekil 4).
- Her iki kanal için de otomatik olarak kymograflar oluşturmak üzere oynat düğmesine tıklayarak ilk Veri Görselleştirme kod bloğunu çalıştırın.
- Değişken kymograph_kernel ayarlayarak yumuşatma için kullanılan Gauss çekirdeğinin boyutunu seçin.
NOT: Piksel yoğunluklarının ortalamasının alındığı komşuluğun boyutuna (piksel cinsinden) karşılık gelir. Varsayılan değer 3 piksel x 3 pikseldir. - Uzatılmamış iskeletler, yoğunluklarını düzgün bir şekilde görüntülemek için özel bir renk haritası kullanması gereken kapaklı Kymograflar oluşturur. shift_fraction değişkenini ayarlayarak arka plan rengine, siyaha atanacak yoğunlukların kesir yüzdesini seçin. Varsayılan değer 0,7'dir.
- Değişken kymograph_kernel ayarlayarak yumuşatma için kullanılan Gauss çekirdeğinin boyutunu seçin.
- Her iki kanal için de otomatik olarak kymograflar oluşturmak üzere oynat düğmesine tıklayarak ilk Veri Görselleştirme kod bloğunu çalıştırın.
- Kanallar arasındaki oranı hesaplayın (Şekil 5).
- Otomatik olarak bir ratiometric kymograph ve bir ratiometric timelapse oluşturmak için oynat düğmesine tıklayarak ikinci Veri Görselleştirme kod bloğunu çalıştırın (Şekil 6).
NOT: Bu adım yalnızca çift kanallı zaman aralıkları kullanılırken kullanılabilir. Adım 1.2.1.2'de saklanan arka plan yoğunluğu eşiği her kanaldan çıkarılır.- Oran hesaplamaları sırasında pay ve payda olarak kullanılan kanalların sırasını değiştirmek için switch_ratio değişkenini ayarlayın. Varsayılan değer False'tur.
- smooth_ratio değişkenini ayarlayarak oran timelapse'ının bir medyan filtre geçişiyle daha da yumuşatılması gerekip gerekmediğini seçin. Varsayılan değer False'tur.
- reject_outliers değişkeni manipüle ederek payda kanalının düşük sinyali tarafından üretilen aykırı değerlerin kaldırılıp kaldırılmayacağını seçin. Varsayılan olarak True değeridir ve aykırı değerleri, üçüncü çeyreğin üzerindeki çeyrekler arası aralığın 1,5 katı değerler olarak tanımlar (burada değerlerin %75'i bulunur).
- Değişken background_ratio ayarlayarak ratiometrik çıktıdaki arka planın dışa aktarılması gerekip gerekmediğini seçin. Varsayılan değer False'tur ve sıfırlarla değiştirilir.
- Otomatik olarak bir ratiometric kymograph ve bir ratiometric timelapse oluşturmak için oynat düğmesine tıklayarak ikinci Veri Görselleştirme kod bloğunu çalıştırın (Şekil 6).
Şekil 2: Tek hücre segmentasyon adımı. İlgilenilen sinyali izole etmek için filtreleme, eşikleme ve alan etiketleme gibi görüntü işleme teknikleri kullanılır (adım 1.2). Bu özel veriler, En Düşük Yoğunluk: 2556, Medyan: 3441 ve En Yüksek Yoğunluk: 32125 için aşağıdaki değerlere sahipti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Orta hat izlemeye genel bakış- Tek hücrenin orta hattı, iskeleti (beyaz) hesaplanarak elde edilir. Uç (macenta), iskeletin sonundaki son noktalardan doğrusal olarak tahmin edilir (adım 1.3). Bu bileşimde hem orta hat hem de ucu orijinal hücrenin üzerine bindirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Timelapse'in kymografları- 'complete_skeletonization' kapalıyken oluşturulan her kanal için kymografların karşılaştırılması (adım 1.4). Dikey eksen, zamanın ilerlemesini tanımlar ve yatay eksen, tek bir hücrenin izlediği tahmin edilen orta hat yolunun ortalama yoğunluğunu çizer. Bu özel veriler için renk haritası, Kanal 1 En Düşük Yoğunluk: 2886, Medyan: 3167, En Yüksek Yoğunluk: 21021 için aşağıdaki değerleri temsil eder. Kanal 2 En Düşük Yoğunluk: 3030, Medyan: 3400, En Yüksek Yoğunluk: 29688. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Arka plan eşiği yumuşatma- Arka plan segmentasyon eşiği, izoveri algoritması aracılığıyla tahmin edilir ve ardından yerel polinom regresyonu yoluyla yumuşatılır (adım 1.5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Oransal sonuçlar- (A) Oransal zaman atlamasının son karesi ile bölümlere ayrılmış orijinal ilk kanal arasındaki karşılaştırma. (B) Oransal zaman atlamasından oluşturulan Kymograph (adım 1.5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Toplu mod protokolü
- AMEBaS GitHub deposundan pipeline.py dosyayı indirin ve verilerle aynı dizine yerleştirin.
- Program dosyasından sonra komut satırına dosya konumunu yazın.
- İsterseniz işlem hattının iç adımlarını göstermek için konumsal bağımsız değişken olarak --v ekleyin.
- Hücre segmentasyonuna hazırlanırken Gauss Filtresi ön işleme adımında kullanılan sigma değerini seçmek için - -s ekleyin. Varsayılan değer 2'dir.
- Zaman atlamasının her karesi için orta çizgiyi izlemek için - -a ekleyin. Varsayılan olarak, işlem hattı yalnızca son kareyi kullanır.
- Enterpolasyonda kullanılacak iskeletin [0,1] fraksiyonunu seçmek için - -f ekleyin. Varsayılan değer 0,25'tir.
- Tahmin edilen iskeletin piksel cinsinden uzunluğunu seçmek için -e ekleyin. Varsayılan değer, iskeleti en yakın kenara kadar uzatan -1'dir.
- Ekstrapolasyonsuz kymograflarda arka plana kaydırılacak renk aralığının fraksiyonunu seçmek için - -sf ekleyin. Varsayılan değer 0,7'dir.
- Kymograph Gauss filtrelemesinde kullanılan çekirdeğin boyutunu belirlemek için - -k ekleyin. Varsayılan değer 3'tür.
- Çerçeveye özgü arka plan eşik yoğunluklarının LOESS polinom regresyonu aracılığıyla genel arka plan eşik yoğunluğunu tahmin etmek için - -eb ekleyin.
- - -n parametresini değiştirerek arka plan eşik değerlerinin LOESS yumuşatmasında kullanılan nokta sayısını özelleştirin. Varsayılan değer 40'tır.
- Timelapse'in iki kanalı varsa, oran hesaplamaları sırasında pay ve payda olarak kullanılan - r veya - -switch_ratio dahil olmak üzere kanalları değiştirin. Varsayılan olarak, ikinci kanal pay ve ilk kanal paydadır.
- Oran zaman atlamalı oranının - -sm bağımsız değişkeniyle Medyan Filtre geçişiyle daha da yumuşatılması gerekip gerekmediğini seçin. Varsayılan değer False'tur.
- Oransal zaman atlamalı oluşturma sırasında anormal yoğunluklara sahip pikselleri reddetmek için -o ekleyin.
- ratiometric çıktısındaki arka planın - -b bağımsız değişkeni kullanılarak dışa aktarılması gerekip gerekmediğini seçin. Varsayılan değer False'tur ve sıfırlarla değiştirilir.
- Çalıştırmak için enter tuşuna basın. Çıktı, program dosyasıyla aynı dizinde oluşturulacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AMEBaS boru hattı, floresan mikroskobu görüntü yığınlarından polarize tek hücrelerin orta hat dinamiklerinin çıkarılmasını otomatikleştirerek daha az zaman alır ve insan hatalarına daha az eğilimli hale getirir. Yöntem, büyüyen tek hücrelerde kimograflar ve oransal görüntü yığınları (Şekil 1) oluşturarak bu zaman atlamalarını ölçer. Tek hücrelerin taşınması üzerinde çalışacak şekilde ayarlanabilir, ancak daha fazla deney gereklidir. AMEBaS, Python'da etkileşimli bir Jupyter Notebook ( Etkileşimli not defteri protokolü bölümünde açıklanmıştır) olarak uygulanır ve programlama deneyimi gerektirmeden daha kolay kullanım sağlar ve aynı parametre kümesiyle birden çok yığının analiz edilebildiği bir komut satırı aracı ( Toplu iş modu protokolü bölümünde) olarak uygulanır. Bir veya iki floresan kanalı kullanılabilse de, iki emisyon kanalına sahip oransal problar daha güvenilir sonuçlar vermelidir, çünkü probun bağlanmamış durumunun floresan emisyonu, proteinin sitoplazmadaki eşit olmayan dağılımının neden olduğu uzamsal heterojenliği hafifletebilir.
İşlem hattı ilk olarak en güçlü kanaldaki en büyük hücrenin ikili maskesini verir ve Filename_binary_mask.tiff adlı bir tif dosyası olarak dışa aktarılır (Şekil 2). Her kanal için izodata ile elde edilen eşik tahminleri isteğe bağlı olarak lös ile düzeltilir ve tablo Filename_background_treshold.csv kaydedilir (Şekil 5). İkili maskeden çıkarılan hücrenin orta çizgisi, Filename_skeletonized.tiff adlı bir tif dosyası olarak dışa aktarılır (Şekil 3). Her kanalın kimografileri, Filename_kymograph_c_*.csv olarak adlandırılan orta hattan üretilir, burada * kanal numarasına karşılık gelir (Şekil 4). Son olarak, bir ratiometrik kimograf Filename_kymograph_ratio.csv olarak kaydedilirken, tam ratiometrik yığın Filename_ratiometric.tiff olarak adlandırılır (Şekil 6). Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6'ya karşılık gelen grafikler, kullanıcı tarafından ilk kod öbeğinde (adım 1.1) 'ayrıntılı == True' veya '--v' belirtildiğinde isteğe bağlı olarak PNG dosyaları olarak kaydedilir.
Bu sonuçlar, hücrenin uzay-zamansal dinamiklerini daha fazla araştırmak için, her kanalın kymograflarını bir girdi olarak alan ve çeşitli zaman serisi analiz yöntemleriyle birlikte alt piksel çözünürlüğü ile büyüme hızı analizi yapan CHUKNORRIS8 gibi diğer görüntü analizi boru hatlarıyla birleştirilebilir.
AMEBaS, hücre içi Ca2+ (CaMeleon; Şekil 7A,B) ve H+ (pHluorin; Şekil 7C,D) optik floresan mikroskobunda elde edilen konsantrasyonların yanı sıra, daha önce tarif edildiği gibi bir ışık tabakası mikroskobunda elde edilen CaMeleon NES-YC3.6'yı (Şekil 7E,F) eksprese eden büyüyen kök kıllarının cpVenüs/CFP oranlarının maksimum yoğunluk projeksiyonu 15,16. Boru hattı, büyüme yönü, görüntüleme teknikleri, floresan raportörler ve hücre tiplerindeki farklılıklara rağmen başarılı bir şekilde çalıştı. Bu veri kümeleri için segmentasyon, orta hat izleme ve kimograf ekstraksiyonu gösterilmiştir (Şekil 7), bu da AMEBaS'ın çok çeşitli deney kurulumlarına uygulanma potansiyelini göstermektedir.
Şekil 7: Uç büyüyen hücrelerin farklı floresan görüntü veri kümeleri için temsili sonuçlar. (A,B) Ca2+ muhabiri CaMeleon'u ifade eden polen tüpü; (C,D) pH indikatörü pHluorin'i ifade eden polen tüpleri; (E,F) Ca2+ muhabiri NES-YC3.6'yı ifade eden kök kılları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: AMEBaS-main.zip. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yeni yöntem, polarize hücrelerin floresan mikroskobu görüntü yığınlarının analizini kolaylaştırmak ve otomatikleştirmek için güçlü bir araçtır. ImageJ Kymograph eklentileri gibi literatürde açıklanan mevcut yöntemler, ilgilenilen polarize hücrenin orta hattının manuel olarak izlenmesini gerektirir, bu sadece zaman alıcı değil, aynı zamanda insan hatalarına da eğilimli bir görevdir. Bu boru hattındaki orta hattın tanımı, iskeletleştirmeyi gerçekleştiren sayısal bir yöntem18,19 ile desteklendiğinden, öznel değerlendirme kaldırılarak prosedüre nicel bir standart getirilmiştir. Bu, özellikle büyük miktarda veriye sahip araştırmacılar için kullanışlıdır ve boru hattını her kare için orta çizginin çıkarılması da dahil olmak üzere farklı taleplere göre özelleştirme olasılığı vardır. Ayrıca, belirli bir kanalın tüm kareleri için elle seçilen tek bir arka plan değeri ile arka plan değeri çıkarma işlemi genellikle keyfidir. Burada, izoveri segmentasyonu, her kare için arka plan eşiğini objektif olarak belirlemek, solmanın (foto ağartma) neden olduğu floresanstaki uzun vadeli değişiklikleri yakalamak için yerel bir polinom regresyon ile yumuşatmak (isteğe bağlı olarak) kullanılır. Olası artefaktlar ve ikincil öğeler, piksel alanına göre daha büyük nesne seçilerek arka planda yok sayılırken, gölgeleme gibi efektleri kaldırmak için FRET-IBRA12 gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Uzamsal artefaktlar (gölgeleme gibi), eşikleme ile bölümlere ayrılmış hücrenin şeklini etkileyebilir ve bu da AMEBaS logosunda yer alan oran ölçer filminde görülen gradyanın tüpün bir tarafına doğru yanmasını açıklayabilir (GitHub sayfasına veya Colab not defterine bakın).
Bununla birlikte, sunulan boru hattının başarısız olabileceği ve sihirli bir çözüm olarak düşünülmemesi gereken birkaç durum vardır. Görüntü yakalama sırasında özel dikkat gösterilmelidir, çünkü büyük bozulmalar algoritmanın hedef hücreyi bölümlere ayırma yeteneğini bozabilir. En iyi sonuçlar için görüntü yığınının önceden işlenmesi, istenmeyen öğelerin ve genel olarak hatalı çerçevelerin kaldırılması düşünülmelidir.
Parametreler, floresan raportörlerle iyonik konsantrasyonları analiz eden Arabidopsis polen tüplerinin kısıtlı veri setini göz önünde bulundurarak apikal olarak büyüyen tek hücreleri analiz etmeyi amaçlayan seçildi. Bu nedenle, diğer veriler mantıklı parametre seçimleri gerektirebilir. Ön işleme filtreleri, segmentasyondan sonra temiz bir ikili maske üretmek amacıyla verileri yumuşatır (adım 1.2), böylece Gauss ve medyan filtreleri için kullanılan sigma değeri, daha gürültülü veriler için artırılabilir veya sonuçlar aşırı yumuşatılırsa azaltılabilir. En güçlü kanalda elde edilen ikili maskenin konumunun en zayıf kanalla aynı olduğu varsayılır, bu da hücre konumu her iki kanalda da aynı değilse sorun olabilir. Bu durumda, her kanal için farklı maskeler kullanılmalı veya FRET-IBRA12'de yapıldığı gibi görüntü kaydı yapılmalıdır.
İskeletleşme, varsayılan olarak yalnızca son karede (adım 1.3) yapılır, bu da sitoplazmasının zaman içinde (tepe noktası dışında) konumunu koruyan uç büyüyen bir hücreyi varsayar. İskeleti genişleterek, CHUKNORRIS8 gibi yöntemler kullanarak alt piksel çözünürlüğünde bile büyüme hızının analizine izin veren kimograflar oluşturmak mümkündür. Bu uzatma, iskeletin büyüyen ucundaki ilk %25'lik noktalar (adım 1.3) dikkate alınarak doğrusal ekstrapolasyon ile yapılır ve interpolation_fraction tüm iskeletin %0 ila %100 noktaları arasında ayarlanarak ayarlanabilir. Bununla birlikte, hücre çerçeveler arasında yer değiştirirse veya göç eden bir hücreyse, büyüme hızı analizi daha karmaşık hale gelir. Böyle bir senaryoda, hücre dışı genişleme olmadan iskeletler üretecek olan complete_skeletonization=TRUE parametrelerinin seçimi ile her kare için bağımsız iskeletler oluşturulabilir. Büyüme oranını analiz etmek yine de mümkün olacaktır, ancak çözünürlük, izoveri eşiklemesi ile üretilen ikili maske ile sınırlı olacaktır. Ayrıca, ortaya çıkan kimografi, ardışık iskeletlerin varsayılan koordinatlarına göre hizalanabileceğini varsayar, bu da doğru değilse, hücre içi dinamikleri analiz etmek için uygun değildir.
Kimografi oluştururken (adım 1.4), AMEBaS, orta çizginin etrafındaki geleneksel piksel kenar boşluğunu kullanmak yerine Gauss çekirdeği ile ortalamayı kullanır. 3x3'ün varsayılan değeri, mümkün olan en küçük boyuttur ve veriler çok gürültülüyse ve/veya hücre büyükse artırılabilir. Ancak, bu adım aşırı yumuşatmaya neden olabilir, bu durumda filtre kymograph_kernel = 0 ayarlanarak tamamen kapatılmalıdır. Son olarak, her kanalın her karesi için tahmin edilen arka plan, kullanıcı solma (foto ağartma) beklediğinde veya ham tahminler kullanılarak (adım 1.5) yumuşatılabilir. LOESS polinom regresyonu (adım 1.5) ile arka plan değerlerinin yumuşatılması, n_points penceresinde kullanılan nokta sayısı en az 3 ve yığındaki maksimum kare sayısı (otomatik olarak sınırlandırılır) olarak ayarlanarak ayarlanabilir. Zaman içindeki arka plan değişikliğini açıklayan daha basit bir işlev, daha büyük bir pencere ile elde edilebilir ve daha kaba bir uyum sağlar.
Bu yöntem, tipik olarak araştırmacılar tarafından yürütülen birden fazla manuel adımı birleştirdiğinden, AMEBaS boru hattı, tek polarize hücre zaman aralıklarının uzay-zamansal davranışını analiz etmek için daha verimli, tarafsız ve kesin bir yaklaşım aracıdır. Gelecekte, bu yöntem, göç eden tek hücrelerin analizini desteklemek için genişletilme potansiyeline sahiptir. Ayrıca, bu yöntemin performansını daha geniş bir hücre tipi yelpazesinde değerlendirmek için daha fazla analiz gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu makalenin yazarları, rekabet eden hiçbir mali çıkar veya diğer çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Yazarlar, FAPESP hibeleri 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 hibe GM131043 ve NSF hibeleri MCB1714993, MCB1930165 mali destek için minnettardır. Kök saç verileri Prof. Andrea Bassi ve Prof. Alex Costa'nın süpervizörlüğünde ve altyapısında üretildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J.
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
