Summary
分極した単一細胞の細胞内動態を解析する現在の方法は、多くの場合、手作業であり、標準化されていません。この原稿では、単一偏光細胞の正中線抽出を自動化し、ユーザーフレンドリーなオンラインインターフェースでタイムラプスからの時空間挙動を定量化するための新しい画像解析パイプラインを紹介します。
Abstract
細胞極性は、空間的に集中した分子と構造の集合体によって確立される巨視的な現象であり、細胞内レベルでの特殊なドメインの出現で最高潮に達します。これは、細胞分裂、成長、遊走などの主要な生物学的機能の根底にある非対称な形態学的構造の発達に関連しています。さらに、細胞極性の破壊は、癌や胃異形成などの組織関連疾患に関連しています。
個々の偏光細胞における蛍光レポーターの時空間動態を評価する現在の方法では、細胞の長軸に沿って正中線をトレースする手作業が必要になることが多く、時間がかかり、強いバイアスが発生しがちです。さらに、レシオメトリック分析では、2つの蛍光チャンネルを使用してレポーター分子の不均一な分布を補正できますが、バックグラウンド減算手法は恣意的であることが多く、統計的な裏付けがありません。
この論文では、細胞極性(花粉管/根毛の成長と細胞質イオン動態)のモデルを使用して、単一細胞の時空間的挙動を自動化および定量化するための新しい計算パイプラインを紹介します。レシオメトリック画像を処理し、細胞内の動態と増殖の定量的表現を抽出するために、3段階のアルゴリズムが開発されました。最初のステップでは、背景からセルをセグメント化し、ピクセル強度空間の閾値化技術によってバイナリマスクを生成します。2 番目のステップでは、スケルトン化操作によってセルの正中線を通るパスをトレースします。最後に、3番目のステップでは、処理されたデータをレシオメトリックタイムラプスとして提供し、レシオメトリックキモグラフ(すなわち、経時的な1D空間プロファイル)を生成します。成長する花粉管から遺伝子コードされた蛍光レポーターで取得したレシオメトリック画像からのデータを使用して、分析法のベンチマークを行いました。このパイプラインにより、分極された細胞の正中線に沿った時空間動態をより速く、より偏りが少なく、より正確に表現できるため、細胞極性を調べるために利用できる定量的ツールキットが進歩します。AMEBaS Pythonのソースコードは、https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
細胞極性は、空間的に集中した分子と構造の集合体の協調的な作用が、特殊な形態学的細胞内ドメインの確立で最高潮に達する基本的な生物学的プロセスです1。細胞分裂、増殖、遊走はこのような極性部位に依存していますが、その喪失は上皮組織関連疾患の癌と関連しています2。
頂端に増殖する細胞は極性の劇的な例であり、先端の極性部位は通常、細胞外の手がかりに再配向する3。これらには、神経突起、真菌菌糸、根毛、花粉管の発達が含まれ、複数の細胞プロセスが細胞の先端からすねに向かって顕著な違いを示します。特に花粉管では、アクチン重合、小胞輸送、イオン濃度が著しく分極し、先端に焦点を絞った勾配を示す4。花粉管は顕花植物の雄性配偶体であり、単一細胞で知られている最速の成長率の1つで細胞の頂点でのみ成長することにより、精子細胞を胚珠に送達する役割を担っています。カルシウム5(Ca2+)やプロトン6(H+)などのイオンの先端に焦点を絞った勾配は、花粉管の成長を維持する上で主要な役割を果たし、二重受精で最高潮に達する主要な生物学的機能を達成するために不可欠です5,6。したがって、頂端増殖細胞の正中線に沿った時空間動態を定量的に解析する手法は、分極増殖の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するために不可欠です7,8,9。研究者は、細胞の正中線(列など)のピクセル強度を経時的(行など)で表すマトリックスであるキモグラフを使用することが多く、対角線上の細胞の成長と移動を視覚化できます(図1)。キモグラフは、その有用性にもかかわらず、正中線を手作業でトレースして抽出されることが多く、バイアスや人為的ミスが発生しやすく、かなり手間がかかります。これは、AMEBaSと名付けられた本明細書で紹介するパイプラインの最初の特徴である正中線抽出の自動化された方法を必要とします:偏光された単一細胞のレシオメトリック蛍光タイムラプスのユートマティックMidline EエクストラクションおよびBackground Sウブトラクション。
実験手順に関しては、単一細胞における目的のイオン/分子/種の定量的イメージングは、遺伝的にコードされた蛍光プローブ10を用いて達成することができる。拡大し続ける選択肢の中で、レシオメトリックプローブは、目的の分子に結合/非結合するときに異なる蛍光波長を発するため、最も正確なプローブの1つです11。これにより、2つのチャンネルの比からチャンネル特異的なバックグラウンドを差し引いた値を使用することで、プローブの細胞内濃度の空間的不均一性を補正することができます。しかし、各チャンネルや時点の背景閾値を推定することは、画像の隅が中心に対して光度が変動するシェーディングなどの効果や、蛍光色素の退色(光退色)による時間的に変化することが多いため、複雑な作業になる可能性があります12。複数の方法が考えられるが、本稿では、Isodataアルゴリズム13で得られたセグメンテーション閾値を用いてバックグラウンド強度を自動的に決定し、これを標準として多項式回帰によってフレーム間で平滑化することを提案している。しかし、12で除去した標的細胞とは無関係な蛍光の不均一性に由来する空間成分は、この方法では無視された。自動閾値はいくつかの方法で実行できますが、Isodataアルゴリズムは経験的に最良の結果を生み出しました。したがって、自動バックグラウンド値減算とレシオメトリック計算は、AMEBaS(図1)の2番目の主な機能であり、これらをまとめると、デュアルチャンネル蛍光顕微鏡画像のスタックを入力として受け取り、細胞の正中線とチャンネル固有のバックグラウンドを推定し、バックグラウンド減算、平滑化、および外れ値除去後に両方のチャンネルとその比率(メイン出力#1)のキモグラフを出力します。 レシオメトリック画像のスタック(メイン出力#2)と一緒に。
AMEBaSは、花粉特異的LAT52プロモーター下で発現したCa2+ (CaMeleon)8 またはpH(pH)6 レシオメトリックセンサーを用いて、顕微鏡下で得られた成長中のシロイヌナズナ花粉管の蛍光タイムラプスで試験されました。倒立顕微鏡、表面照射型カメラ(2560画素×2160画素、画素サイズ6.45μm)、蛍光イルミネーター、水浸対物レンズ63倍、1.2NAを組み合わせて、各チャンネルの画像を4秒ごとに撮影した。CaMeleonのフィルター設定は、励起426-450 nm(CFP)および505-515 nm(YFP)、発光458-487 nm(CFP)および520-550 nm(YFP)であり、pHluorinでは励起318-390 nm(DAPI)および428-475 nm(FITC)、発光435-448 nm(DAPI)および523-536 nm(FITC)であった。Zenodoでテストするための完全なデータセットが追加されました(DOI:10.5281/zenodo.7975350)14。
さらに、パイプラインは、UBQ10プロモーター17の制御下で遺伝的にコードされたCa2+レポーターNES-YC3.6を発現するシロイヌナズナの根毛を用いて、前述のようにライトシート顕微鏡(SPIM)でイメージングを行った15,16。ライトシート顕微鏡のカメラ取得、サンプル変換、シャッターを制御する自作のLabViewソフトウェアにより、2つのcpVenusチャンネルとCFPチャンネルの観察だけでなく、それらの比率をリアルタイムで視覚化することもできました。タイムラプスの各比率画像は、3 μm間隔のサンプルの15スライスから得られたcpVenus蛍光チャンネル画像とCFP蛍光チャンネル画像の間の最大強度投影(MIP)を表しています。MIPのタイムラプスcpVenus/CFP比を保存し、AMEBaS解析に直接使用しました。
このパイプラインは、複数の種類の増殖細胞と遊走細胞を扱うことができますが、花粉管、根毛、真菌菌糸など、フレーム間に成長しない細胞質領域が対応している先端のみで成長する成長細胞を分析するために特別に設計されました。このような対応が存在しない場合、ユーザーはステップ 1.3.1.1 で complete_skeletonization オプションを選択する必要があります (詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください)。
図 1: パイプライン ワークフローの概要。 AMEBaSパイプラインは、シングルセルセグメンテーション、ミッドライントレーシング、キモグラフ生成の3つの主要なステップで、顕微鏡のタイムラプスを解析および処理します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1.インタラクティブノートブックプロトコル
Jupyter Notebook は、以下の手順の基になっている Google Colab at https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb を使用して、Web 上で直接使用できます。または、Jupyter Notebook は https://github.com/badain/amebas で入手でき、ダウンロードして Jupyter でローカルに実行するように構成できます (Anaconda は簡単でクロスプラットフォームのインストールプロセスを提供できます)。完全な試験データはZenodo(https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350)にあり、pHまたはCa2+ レポーターのいずれかを発現するシロイヌナズナ花粉管のシングルチャンネルおよびデュアルチャンネルデータが含まれています14。パイプラインはいくつかの部分に分かれており、ユーザー固有のオプションを設定した後、再生ボタンをクリックすることですべてのステップを実行できます。本研究に必要なファイルは、AMEBaS-のメインzipフォルダ(Supplementary Coding File 1)にあります。
- Jupyter Notebookを開き、タイムラプスファイルを読み取ります。
- 上記の Google Colab のインタラクティブ ノートブックのホームページに移動するか、GitHub から AMEBaS_Local.ipynb ノートブックをダウンロードして開きます。
- 入力データと出力データのディレクトリ設定を準備します。
- ローカルバージョンを使用する場合は、蛍光タイムラプスをTIFFファイルまたはDVファイルとして、プログラムのルートフォルダーにある dataという名前のフォルダー 内に配置します。生成されたデータを受け取るには、 out という名前のフォルダーを作成する必要があります。次に、セットアップ コード ブロックを実行します。
- Google Colabでノートブックを使用している場合は、 セットアップ コードブロックを実行して、 データ と 出力 フォルダーを自動的に生成します。
- [ファイル入力] コード ブロックを実行し、再生ボタンをクリックしてタイム ラプス データを読み取ります。ノートブックのGoogle Colabバージョンを使用している場合は、[ファイルの選択]ボタンをクリックして、タイムラプスファイルをデータフォルダーに直接アップロードします。
注:チャンネル数は、画像のサイズに基づいて自動的に検出されます。 - 'verbose' パラメーターを True または False に設定して、各ステップの追加出力を生成するかどうかを選択します。
- メインセルとセグメントをバックグラウンドから検出します(図2)。
- [Single Cell Segmentation] コード ブロックを実行し、再生ボタンをクリックして、対象のセルを背景から自動的に分離します。
注: メディアン フィルターとガウス フィルターは、不要なノイズを除去するための前処理ステップとして適用され、Isodata しきい値処理によって前景を背景からセグメント化し、最大領域の領域を分離して不要なアーティファクトを除去します。- 'sigma' 変数のガウスによって使用されるシグマ値を調整して、セグメンテーション マスクの滑らかさを微調整します。デフォルト値は 2.0 です。
- 変数 estimate を False に設定して Isodata から推定されたしきい値を直接 保存するか、 True に設定して局所多項式回帰 (LOESS) を使用して隣接するフレーム間で平滑化します。 n_points 変数を変更して、その機能を微調整します。デフォルト値は 40 です。
- [Single Cell Segmentation] コード ブロックを実行し、再生ボタンをクリックして、対象のセルを背景から自動的に分離します。
- セルの延長に沿って正中線をトレースします(図3)。
- 再生ボタンをクリックして [Cell Midline Tracing] コード ブロックを実行し、Lee の方法18 を使用してセルを自動的にスケルトン化し、線形外挿によって最後のスケルトンの先端を拡張します。
- 最後のフレームでのみ正中線をトレースするか、 complete_skeletonization 引数を調整してフレームごとに 1 回トレースするかを選択します。
注: すべてのフレームがスケルトン化されると、外挿はスキップされます。 - interpolation_fraction変数を調整して、外挿中に補間されるスケルトンのポイントの割合を設定します。デフォルト値は 0.25 です。
- 変数 extrapolation_length を変更して、正中線外挿の長さを選択します。既定値は -1 で、スケルトンが最も近いエッジまで延長されます。
- 最後のフレームでのみ正中線をトレースするか、 complete_skeletonization 引数を調整してフレームごとに 1 回トレースするかを選択します。
- 再生ボタンをクリックして [Cell Midline Tracing] コード ブロックを実行し、Lee の方法18 を使用してセルを自動的にスケルトン化し、線形外挿によって最後のスケルトンの先端を拡張します。
- 各チャンネルのキモグラフを生成します( 図4)。
- 再生ボタンをクリックして最初の Data Visualization コードブロックを実行し、両方のチャンネルのキモグラフを自動的に生成します。
- 変数 kymograph_kernel を調整して、平滑化に使用するガウス カーネルのサイズを選択します。
注: これは、ピクセル強度が平均化される近傍のサイズ (ピクセル単位) に対応します。既定値は 3 ピクセル x 3 ピクセルです。 - 非拡張スケルトンは、強度を適切に表示するためにカスタムカラーマップを使用する必要があるキャップ付きキモグラフを生成します。背景色である黒に割り当てる強度の割合を選択し、 shift_fraction 変数を調整します。デフォルト値は 0.7 です。
- 変数 kymograph_kernel を調整して、平滑化に使用するガウス カーネルのサイズを選択します。
- 再生ボタンをクリックして最初の Data Visualization コードブロックを実行し、両方のチャンネルのキモグラフを自動的に生成します。
- チャネル間の比率を計算します(図5)。
- 再生ボタンをクリックして 2 つ目の Data Visualization コード ブロックを実行すると、レシオメトリック キモグラフとレシオメトリック タイムラプスが自動的に生成されます(図 6)。
注意: この手順は、デュアルチャンネルタイムラプスを使用している場合にのみ使用できます。ステップ1.2.1.2で保存したバックグラウンド強度の閾値は、各チャンネルから差し引かれます。- switch_ratio変数を調整して、比率計算時に分子と分母として使用されるチャネルの順序を切り替えます。既定値は False です。
- smooth_ratio変数を調整して、中央値フィルターパスでタイムラプス比をさらに平滑化する必要があるかどうかを選択します。既定値は False です。
- 分母チャネルの低信号によって生成される外れ値を、 reject_outliers 変数を操作して削除するかどうかを選択します。既定値は True で、外れ値を第 3 四分位数 (値の 75% がある) より上の四分位範囲の 1.5 倍の値として定義します。
- レシオメトリック出力の背景を変数 background_ratioを調整してエクスポートする必要があるかどうかを選択します。既定値は False で、0 に置き換えられます。
- 再生ボタンをクリックして 2 つ目の Data Visualization コード ブロックを実行すると、レシオメトリック キモグラフとレシオメトリック タイムラプスが自動的に生成されます(図 6)。
図2:シングルセルセグメンテーションステップ。 フィルタリング、閾値処理、エリアラベリングなどの画像処理技術を使用して、目的の信号を分離します(ステップ1.2)。この特定のデータには、最低強度:2556、中央値:3441、および最高強度:32125の値がありました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:正中線追跡の概要-単一細胞の正中線は、その骨格(白)を計算することによって得られます。先端(マゼンタ)は、スケルトンの終端にある最後の点から線形に外挿されます(ステップ1.3)。この構図では、正中線とその先端の両方が元のセルに重ね合わされています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:タイムラプスのキモグラフ - 「complete_skeletonization」をオフにした状態で生成された各チャンネルのキモグラフの比較(ステップ1.4)。縦軸は時間の進行を表し、横軸は外挿された正中線経路とそれに続く単一のセルの平均強度をプロットします。この特定のデータでは、カラーマップはチャネル 1 の最低強度: 2886、中央値: 3167、最高強度: 21021 の値を表します。チャンネル2の最低輝度:3030、中央値:3400、最高輝度:29688。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:バックグラウンド閾値平滑化 - バックグラウンドセグメンテーション閾値は、アイソデータアルゴリズムによって推定され、局所多項式回帰によって平滑化されます(ステップ1.5)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:レシオメトリックの結果-(A)レシオメトリックタイムラプスの最後のフレームとセグメント化された元の最初のチャネルとの比較。(B)レシオメトリックタイムラプスから生成されたキモグラフ(ステップ1.5)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
2.バッチモードプロトコル
- ファイル pipeline.py をAMEBaS GitHubリポジトリーからダウンロードし、データと同じディレクトリに配置します。
- コマンドラインでプログラムファイルの後にファイルの場所を入力します。
- 必要に応じて、パイプラインの内部ステップを示す位置引数として - -v を含めます。
- セル セグメンテーションの準備としてガウス フィルターの前処理手順で使用されるシグマ値に - -s を含めます。既定値は 2 です。
- タイムラプスの各フレームの正中線をトレースするには、- -a を含めます。既定では、パイプラインは最後のフレームのみを使用します。
- - -f を含めると、補間に使用するスケルトンの分数 [0,1] が選択されます。デフォルト値は 0.25 です。
- -e を含めると、外挿されたスケルトンの長さをピクセル単位で選択できます。既定値は -1 で、スケルトンが最も近いエッジまで延長されます。
- - -sf を含めると、外挿されていないキモグラフで背景にシフトされる色範囲の割合を選択できます。デフォルト値は 0.7 です。
- --k を含めて、キモグラフのガウス フィルタリングで使用されるカーネルのサイズを決定します。既定値は 3 です。
- フレーム固有のバックグラウンド閾値強度の LOESS 多項式回帰を介してグローバル背景閾値強度を推定するには、- -eb を含めます。
- パラメータ - -n を変更して、背景しきい値の LOESS スムージングで使用されるポイント数をカスタマイズします。デフォルト値は 40 です。
- タイムラプスにチャンネルが2つある場合は、 -r または- -switch_ratioなど、比率計算時に分子と分母として使用するチャンネルを切り替えます。デフォルトでは、2番目のチャネルが分子で、1番目のチャネルが分母です。
- - -sm 引数を指定したメディアンフィルターパスでタイムラプス比をさらに平滑化する必要があるかどうかを選択します。既定値は False です。
- レシオメトリックタイムラプス生成中に異常な強度を持つピクセルを拒否するには、 -o を含めます。
- レシオメトリック出力の背景を引数 - -b を使用してエクスポートする必要があるかどうかを選択します。既定値は False で、0 に置き換えられます。
- Enter キーを押して実行します。出力は、プログラムファイルと同じディレクトリに生成されます。
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Representative Results
AMEBaSパイプラインは、蛍光顕微鏡の画像スタックから偏光した単一細胞の正中線ダイナミクスの抽出を自動化するため、時間がかからず、人為的ミスも発生しにくくなります。この方法では、増殖中の単一細胞でキモグラフとレシオメトリック画像スタック(図1)を生成することにより、これらの時間経過を定量化します。単一細胞の遊走に作用するように調整することは可能ですが、さらなる実験が必要です。AMEBaS は、プログラミングの経験がなくても簡単に使用できるインタラクティブな Jupyter Notebook (「 対話型ノートブック・プロトコル」のセクションで説明) として、また、同じパラメーター・セットで複数のスタックを分析できるコマンド・ライン・ツール ( 「バッチ・モード・プロトコル」のセクション) として Python で実装されています。1つまたは2つの蛍光チャネルを使用できますが、2つの発光チャネルを備えたレシオメトリックプローブは、プローブの非結合状態の蛍光発光により、細胞質内のタンパク質の不均一な分布によって引き起こされる空間的不均一性を緩和できるため、より信頼性の高い結果が得られるはずです。
パイプラインはまず、最も強いチャネル上の最大のセルのバイナリマスクを生成し、Filename_binary_mask.tiffという名前のtifファイルとしてエクスポートします(図2)。各チャンネルのアイソデータで得られた閾値推定値は、オプションで黄土で平滑化され、テーブルFilename_background_treshold.csvに保存されます(図5)。バイナリマスクから抽出されたセルの正中線は、Filename_skeletonized.tiffという名前のtifファイルとしてエクスポートされます(図3)。各チャンネルのキモグラフは、正中線からFilename_kymograph_c_*.csvと名付けられ、*はチャンネル番号に対応します(図4)。最後に、レシオメトリックキモグラフはFilename_kymograph_ratio.csvとして保存され、完全なレシオメトリックスタックにはFilename_ratiometric.tiffという名前が付けられます(図6)。図2、図3、図4、 図5、図6に対応するプロットは、最初のコードチャンク(ステップ1.1)でユーザーが「verbose == True」または「--v」を指定した場合、オプションでPNGファイルとして保存されます。
これらの結果は、各チャンネルのキモグラフを入力としてサブピクセル分解能で成長率解析を行うCHUKNORRIS8など、細胞の時空間動態を様々な時系列解析手法とともに、他の画像解析パイプラインと組み合わせてさらに調べることができます。
AMEBaSは、細胞内Ca2+(CaMeleon;図7A、B)およびH+(pHluorin;図7C,D)は、光学蛍光顕微鏡で取得した濃度と、前述のようにライトシート顕微鏡で取得したCaMeleon NES-YC3.6(図7E,F)を発現する成長根毛のcpVenus/CFP比の最大強度投影です15,16。このパイプラインは、増殖方向、イメージング技術、蛍光レポーター、細胞の種類が異なっていても、うまく機能しました。これらのデータセットのセグメンテーション、正中線トレーシング、およびキモグラフ抽出が示されており(図7)、AMEBaSを幅広い実験セットアップに適用できる可能性が示されています。
図7:チップ増殖細胞のさまざまな蛍光画像データセットの代表的な結果。(A,B)Ca2+レポーターCaMeleonを発現する花粉管;(C、D)pH指示薬pHluorinを発現する花粉管;(E、F)Ca2+レポーターNES-YC3.6を発現する根毛。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足コーディング・ファイル1: AMEBaS-main.zip.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する新しい方法は、偏光細胞の蛍光顕微鏡画像スタックの解析を合理化および自動化するための強力なツールです。ImageJ Kymographプラグインなど、文献に記載されている現在の方法では、対象の偏光細胞の正中線を手動でトレースする必要がありますが、この作業は時間がかかるだけでなく、人為的ミスも発生しやすい作業です。このパイプラインにおける正中線の定義は、スケルトン化を実行する数値的方法18,19によって支持されているので、主観的評価は除去され、手順に定量的基準が導入される。これは、大量のデータを扱う研究者にとって特に便利で、フレームごとに正中線を抽出するなど、さまざまな要求に合わせてパイプラインをカスタマイズすることができます。さらに、背景値の減算は任意であることが多く、特定のチャネルのすべてのフレームに対して 1 つの背景値が手動で選択されます。ここでは、アイソデータセグメンテーションを使用して、各フレームのバックグラウンド閾値を客観的に決定し、局所多項式回帰で(オプションで)平滑化して、フェージング(光退色)によって引き起こされる蛍光の長期的な変化を捉えます。ピクセル領域で大きなオブジェクトを選択することにより、バックグラウンドで発生する可能性のあるアーティファクトと二次要素は無視されますが、FRET-IBRA12などの他の方法を使用して、シェーディングなどの効果を除去できます。空間的アーティファクト(陰影など)は、閾値によってセグメント化されたセルの形状に影響を与える可能性があり、AMEBaSロゴに掲載されているレシオメトリックムービーに見られるチューブの片側への勾配の偏りを説明する可能性があります(GitHubページまたはColabノートブックを参照)。
それにもかかわらず、提示されたパイプラインが失敗する可能性があり、銀の弾丸の解決策と見なすべきではない状況がまだいくつかあります。大きな外乱は、ターゲットセルをセグメント化するアルゴリズムの能力を損なう可能性があるため、画像キャプチャ中に特別な注意を払う必要があります。最適な結果を得るには、画像スタックの前処理を検討し、不要な要素や全体的な欠陥のあるフレームを削除する必要があります。
シロイヌナズナ花粉管の限られたデータセットを考慮して、蛍光レポーターでイオン濃度をアッセイする単一の頂端増殖細胞を分析することを目的としたパラメーターを選択しました。したがって、他のデータでは、パラメータの賢明な選択が必要になる場合があります。前処理フィルターは、セグメンテーション (ステップ 1.2) 後にクリーンなバイナリ マスクを生成することを目的としてデータを平滑化するため、ガウス フィルターと中央値フィルターに使用されるシグマ値は、ノイズの多いデータに対しては大きくし、結果が過度に平滑化されている場合は小さくすることができます。最も強いチャネルで得られたバイナリ マスクの位置は、最も弱いチャネルと同じであると仮定され、セルの位置が両方のチャネルで同じでない場合に問題になる可能性があります。この場合、各チャンネルに異なるマスクを使用するか、FRET-IBRA12 で行ったようにイメージ登録を実行する必要があります。
スケルトン化は、デフォルトでは最後のフレーム(ステップ1.3)でのみ行われ、細胞質の位置を経時的に(頂点以外で)維持する先端成長細胞を想定しています。骨格を拡張することで、サブピクセル解像度でも成長速度を分析できるキモグラフを、CHUKNORRIS8のような手法で生成することができます。この拡張は、スケルトンの成長する先端の最初の25%ポイントを考慮した線形外挿(ステップ1.3)によって行われ、スケルトン全体の0%から100%ポイントに interpolation_fraction を調整することで調整できます。ただし、細胞がフレーム間で位置をずらしたり、移動する細胞であったりすると、増殖速度の解析がより複雑になります。このようなシナリオでは、パラメータ complete_skeletonization=TRUEを選択することで、フレームごとに独立したスケルトンを生成することができ、細胞外伸長のないスケルトンが生成されます。成長率を分析することは可能ですが、分解能はisodataしきい値処理で生成されたバイナリマスクによって制限されます。さらに、結果として得られるキモグラフは、連続する骨格をデフォルトの座標で整列させることができることを前提としており、これが真実でなければ、細胞内動態の解析には適さないことになります。
キモグラフを生成する際(ステップ1.4)、AMEBaSは正中線の周りの従来のピクセルマージンを使用する代わりに、ガウスカーネルによる平均化を使用します。3x3 の既定値は可能な限り小さいサイズであり、データのノイズが多すぎる場合やセルが大きい場合は、このサイズを大きくすることができます。ただし、このステップでは過度の平滑化が発生する可能性があるため、その場合は kymograph_kernel = 0 に設定してフィルターを完全にオフにする必要があります。最後に、各チャンネルの各フレームについて推定された背景は、ユーザーがフェード(光退色)を予想する場合、または生の推定値(ステップ1.5)を使用して平滑化できます。LOESS多項式回帰による背景値の平滑化(ステップ1.5)は、ウィンドウ n_points で使用されるポイントの数を最小3、スタック内のフレーム数の最大値(自動的に上限)に設定することで調整できます。時間の経過に伴う背景の変化を記述するより単純な関数は、より大きなウィンドウで実現でき、より粗い近似が得られます。
この手法は、研究者が通常行う複数の手作業のステップを統合するため、AMEBaSパイプラインは、単一偏光細胞のタイムラプスの時空間的挙動を解析するための、より効率的で偏りのない正確なアプローチツールです。将来的には、この分析法を拡張して、移動する単一細胞の解析をサポートする可能性があります。さらに、より広い範囲の細胞タイプでこの方法の性能を評価するには、さらなる分析が必要です。
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Disclosures
この原稿の著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、FAPESP助成金2015/22308-2、2019/23343-7、2019/26129-6、2020/06744-5、2021/05363-0、CNPq、NIH R01助成金GM131043、およびNSF助成金MCB1714993、MCB1930165の財政的支援に感謝します。根毛データは、Andrea Bassi教授とAlex Costa教授の指導の下、インフラストラクチャを使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
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