Summary
Metaplastische cellen van de alvleesklier zijn voorlopers van kwaadaardige cellen die aanleiding geven tot pancreastumoren. Het isoleren van intacte levensvatbare alvleeskliercellen is echter een uitdaging. Hier presenteren we een efficiënte methode voor dissociatie van pancreasweefsel. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of voor twee- of driedimensionale co-culturing.
Abstract
De alvleesklier omvat twee belangrijke systemen: het endocriene systeem, dat hormonen produceert en afscheidt, en het exocriene systeem, dat ongeveer 90% van de alvleesklier uitmaakt en cellen omvat die spijsverteringsenzymen produceren en afscheiden. De spijsverteringsenzymen worden geproduceerd in de acinaire cellen van de alvleesklier, opgeslagen in blaasjes die zymogens worden genoemd, en worden vervolgens via het pancreaskanaal in de twaalfvingerige darm vrijgegeven om metabolische processen op gang te brengen. De enzymen die door de acinaire cellen worden geproduceerd, kunnen cellen doden of celvrij RNA afbreken. Bovendien zijn acinaire cellen kwetsbaar en resulteren gemeenschappelijke dissociatieprotocollen in een groot aantal dode cellen en celvrije proteasen en RNases. Daarom is een van de grootste uitdagingen bij de vertering van pancreasweefsel het herstellen van intacte en levensvatbare cellen, met name acinaire cellen. Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, toont een tweestapsmethode die we hebben ontwikkeld om aan deze behoefte te voldoen. Het protocol kan worden gebruikt om normale alvleesklier, alvleesklier met premaligne laesies of alvleeskliertumoren met een groot aantal stromale en immuuncellen te verteren.
Introduction
Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier (PDAC) is een van de meest agressieve kankersoorten1. Klinisch bewijs ondersteunt het idee dat PDAC zich gedurende vele jaren ontwikkelt uit cellen van het exocriene systeem, waaronder acinaire cellen, aangedreven door mutaties in het KRAS-proto-oncogen2.
Pancreastumoren omvatten veel verschillende celtypen en het is aangetoond dat kwaadaardige cellen slechts 20%-50% van de tumormassa uitmaken3. Verschillende celtypen interageren met de epitheelcellen, ondersteunen hun transformatie en verbeteren de vorming en groei van tumoren. Vroege gebeurtenissen veroorzaken acinaire metaplasie, die aanleiding geeft tot microscopisch kleine laesies die intra-epitheliale neoplasie van de pancreas (PanIN's) worden genoemd en die zich in sommige gevallen kunnen ontwikkelen tot PDAC4.
Het is van cruciaal belang om deze interacties te onderzoeken en zich te richten op cruciale signalen. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is een krachtige methode die genexpressie onthult met een resolutie van één cel, waardoor de veranderingen die epitheelcellen ondergaan worden gevolgd, waardoor de ontwikkeling van alvleesklierkanker kan worden onderzocht.
Weefseldissectie en vertering naar afzonderlijke cellen is de eerste fase in een scRNA-seq-experiment. Verschillende factoren maken de vertering van pancreasweefsel bijzonder uitdagend: i) acinaire cellen zijn goed voor meer dan 90% van de pancreas en acinaire cellen bevatten grote hoeveelheden spijsverteringsenzymen, waaronder proteasen en RNases die de kwaliteit van op RNA gebaseerde bibliotheken verminderen; ii) acinaire cellen zijn zeer gevoelig en kunnen lyseren als standaardprotocollen worden gebruikt; (iii) acinaire cellen brengen een klein aantal genen tot expressie op zeer hoge niveaus. Daarom, als deze cellen tijdens het experiment worden gelyseerd, kan dit het waargenomen genexpressieprofiel van andere cellen besmetten; (iv) pancreasweefsel dat uit tumoren wordt teruggewonnen, is desmoplastisch, waardoor het moeilijk te ontleden is zonder de cellen te beschadigen. Dus hoewel het handhaven van een hoge levensvatbaarheid van alle celtypen vereist is, voegen het grote aantal en de gevoeligheid van acinaire cellen extra complexiteit toe. Deze factoren maken het moeilijk om een eencellige suspensie te bereiken die voor meer dan 80% levensvatbaar is en geen klonten heeft, zoals vereist is voor scRNA-seq-experimenten.
Hier ontwikkelden we een protocol met trypsine C en collagenase P, samen met frequente weefselmonitoring. Dit ondersteunt de dissociatie van afzonderlijke cellen met behoud van een hoge levensvatbaarheid om het succes van scRNA-seq-experimenten te ondersteunen 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De gezamenlijke ethische commissie (Institutional Animal Care and Use Committee) van de Hebreeuwse Universiteit (Jeruzalem, Israël) en het Hadassah Medical Center (Jeruzalem, Israël) keurde het onderzoeksprotocol voor dierenwelzijn goed (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in muizen"), en het hier gepresenteerde protocol voldeed aan alle relevante ethische voorschriften voor dierproeven en onderzoek. De Hebreeuwse Universiteit is een door Vereniging voor Beoordeling en Accreditatie van Proefdierverzorging Internationaal geaccrediteerd instituut.
OPMERKING: De muizenstam voorraad #007908, voorraad #019378 en voorraad #008179 zijn verkregen uit het laboratorium van Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) muizen zijn gemaakt door de bovenstaande stammen te kruisen. Muizen van beide geslachten, tussen 6 weken en 15 maanden oud, werden gebruikt voor het onderzoek. Tamoxifen werd bereid door het poeder op te lossen in maïsolie. Volwassen muizen (6-8 weken oud, vrouwtjes en mannetjes) werden subcutaan geïnjecteerd met tamoxifen op dag 0 en 2 in een dosis van 400 mg/kg en tweemaal per week na de injectie onderzocht. Het was niet mogelijk om tumoren te meten omdat ze zich inwendig bevonden; Daarom werd euthanasie uitgevoerd als abnormale klinische symptomen werden waargenomen volgens het ethische protocol. Muizen werden op verschillende tijdstippen na de introductie van tamoxifen geëuthanaseerd, met behulp van isofluraan en cervicale dislocatie.
1. Alvleesklierdissectie
OPMERKING: Voor een optimale opbrengst tijdens de extractie en om een goede levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is een snelle dissectie van cruciaal belang. Om de tijd die nodig is voor de isolatie van de alvleesklier te verkorten, moeten alle instrumenten en apparatuur klaar zijn op ijs voordat de muis wordt geëuthanaseerd.
- Euthanaseer de muis door CO2 -verstikking en verifieer met behulp van cervicale dislocatie. Vanaf deze stap moeten alle procedures worden uitgevoerd met steriele ontleedinstrumenten.
- Fixeer de muis en spuit de buik in met 70% ethanol. Maak met een schaar en pincet een V-vormige incisie van 2,5 cm in het genitale gebied en ga omhoog om de buikholte volledig te openen.
- Zoek de maag aan de linkerkant van de muis. Zoek de alvleesklier, die zich in de buurt van de milt bevindt. Scheid de alvleesklier van de maag en de twaalfvingerige darm met behulp van twee pincetten (zonder te scheuren). Ga verder en scheid de alvleesklier van de dunne darm, het jejunum en het ileum.
- Verplaats de alvleesklier naar de rechterkant van de muis. Scheid de resterende verbindingen tussen de alvleesklier en de borstholte met een tang om de alvleesklier en de aangehechte milt volledig los te maken.
- Verwijder de alvleesklier en spreid deze uit voor onderzoek in een petrischaal op ijs.
OPMERKING: Tijdens deze stap moet ervoor worden gezorgd dat alleen de alvleesklier wordt verwijderd en niet mesenterisch vetweefsel of ander aangrenzend weefsel samen met de alvleesklier, om cellulaire besmetting te voorkomen.
2. Enzymatische en mechanische dissociatie van de alvleesklier
- Bereid de volgende buffers van tevoren voor.
- Dissociatiebuffer 1: 4 ml trypsine C + 6 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (zie tabel 1) voor elk monster.
- Dissociatiebuffer 2: 9 ml Hanks′ gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) 1x; 4% runderserumalbumine (BSA); 1 ml collagenase P (10 mg/ml); 200 μL trypsineremmer (10 mg/ml); en 200 μL DNase I (10 mg/ml) (zie tabel 1).
- Wasbuffer: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml trypsineremmer (10 mg/ml); en 1 ml DNase 1 (10 mg/ml).
- Enzymactiviteitstopoplossing: HBSS 1x met 5% foetaal runderserum (FBS) en 150 g DNase I (0,2 mg/ml).
- Plaats de alvleesklier in een buis van 50 ml op ijs. Spoel de alvleesklier in 1x, 10% FBS in HBSS. Het vetweefsel gaat drijven en de alvleesklier zinkt. Dit is een gemakkelijke manier om het vervuilende witte vetweefsel dat nog aan de alvleesklier vastzit, te visualiseren en snel te verwijderen.
- Breng het alvleesklierweefsel van de muis over in een steriele petrischaal met 5 ml HBSS 1x op ijs. Knip de alvleesklier in kleine stukjes van 1 tot 3mm3 met een Noyes-schaar en een scalpel (figuur 2A). In het geval van meer dan één monster moeten de monsters op ijs worden bewaard in 10% FBS/HBSS 1x.
- Breng de weefsels over in een centrifugebuis. Centrifugeer bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en gooi het weg om celfragmenten en bloedcellen te verwijderen.
- Resuspendeer de stukken in dissociatiebuffer 1 met 0,02% trypsine C-0,05% EDTA gedurende 10 minuten bij 37 °C met agitatie (180 rpm). Onmiddellijk wassen met 10% FBS/Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 g bij 4 °C.
- Opnieuw wassen door de pellet opnieuw te suspenderen in 10 ml wasbuffer en te centrifugeren op 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C vóór de volgende dissociatiestap.
- Incubeer de alvleesklier in dissociatiebuffer 2 gedurende 15 minuten bij 37 °C met agitatie (180 rpm).
- Voer na 15 minuten mechanische dissociatie uit door de pancreasfragmenten 10 keer krachtig op en neer te pipetteren in steriele pipetten van afnemende grootte (serologische pipetten van 25, 10 en 5 ml) en breng terug naar 37 °C.
- Herhaal na nog eens 5 minuten de mechanische dissociatie en gebruik lichtmicroscopie om de dissociatie te controleren op basis van de hoeveelheid eencellige suspensie. Als in dit stadium minder dan 90% van de suspensie uit geïsoleerde afzonderlijke cellen bestaat, is meestal een langere incubatietijd nodig. Gebruik trypan blue om de levensvatbaarheid van de cel te controleren.
- Ga door met de incubatie en neem elke 5 minuten monsters om de dissociatie te detecteren.
OPMERKING: De totale incubatietijd is afhankelijk van het weefsel en kan per monster verschillen. De incubatie en weefseldissociatie moeten eindigen wanneer 90% van de cellen in afzonderlijke cellen is gescheiden of wanneer een vermindering van de levensvatbaarheid wordt vastgesteld.
- Nadat het pancreasweefsel goed is gedissocieerd (overeenkomend met het verdwijnen van pancreasfragmenten en de toenemende troebelheid van de oplossing) (Figuur 2), stopt u de enzymatische reactie door tweemaal te wassen met enzymactiviteit, stop de oplossing gedurende 5 minuten bij 4 °C. Houd vanaf deze stap de celsuspensie op ijs.
- Haal de celsuspensie door een nylon gaas van 70 μm en controleer de levensvatbaarheid van de cel onder de microscoop. Kleinere maten nylon gaas kunnen de levensvatbaarheid van de cel verminderen.
- Resuspendeer en was de pellet met 5-10 ml ijskoude gebufferde wasoplossing. Tel de cellen.
- Als er meerdere rode bloedcellen worden waargenomen, behandel de cellen dan gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur met een lysebuffer voor rode bloedcellen. In gevallen waarin klonters worden waargenomen, moet het monster opnieuw worden behandeld met trypsine, zoals beschreven in stap 2.5. De levensvatbaarheid wordt gedetecteerd met trypanblauw onder de microscoop en als de levensvatbaarheid minder dan 80% is, moeten levende cellen worden geïsoleerd met behulp van de magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dode cellen verwijderingskit met MACS MS-kolommen (zie tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een recent gepubliceerd werk5 hebben we het hierboven beschreven protocol toegepast om de vroege stadia van PDAC-ontwikkeling te verkennen met behulp van een muismodel. De muis werd genetisch gemanipuleerd om de cassettes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7 op te nemen, die de expressie van constitutief actieve KRAS in acinaire cellen na tamoxifen-injectie mogelijk maken.
Na cervicale dislocatie (volgens het ethische protocol van de muis) werd de alvleesklier weggesneden en werd het hierboven beschreven protocol toegepast (zie figuur 1 en protocol).
Om het dissociatieprotocol te optimaliseren, werd de dissociatie uitgevoerd met of zonder pre-incubatie van het weefsel met trypsine C. Het bleek dat pre-incubatie met trypsine C de dissociatie versnelde zonder de levensvatbaarheid aan te tasten. Daarnaast werden verschillende collagenasen uitgeprobeerd, waaronder collagenase D, collagenase 1a en collagenase P (zie tabel 1). Het bleek dat het gebruik van collagenase D resulteerde in massale celdood, en inderdaad in andere onderzoeken die dit collagenase gebruikten, was de fractie acinaire cellen erg klein8. Het gebruik van collagenase 1a leverde ook niet de verwachte resultaten op, omdat zelfs na een incubatie van 90 minuten met collagenase 1a het weefsel niet gedissocieerd was. Alleen collagenase P stelde ons in staat om het weefsel te dissociëren en de hoge levensvatbaarheid van alle celtypen te behouden.
Deze experimenten werden herhaald op zeven verschillende tijdstippen na de tamoxifen-injectie. Gelijktijdig met acinaire naar ductale metaplasie en PanIN-laesievorming was er een opeenhoping van stromale en immuuncellen, waaronder fibroblasten, en werd het weefsel desmoplastisch en stijf. De verschillende tijdstippen na de tamoxifen-injectie stelden ons in staat om het protocol onder verschillende weefseltoestanden te onderzoeken en het herstel van epitheel-, stromale en immuuncellen te meten.
Een foto van een muis is te zien in figuur 2A en de geïsoleerde alvleesklier, een pluizig weefsel, is te zien in figuur 2C. De rode kleur van het weefsel is het gevolg van de expressie van tdTomato in de acinaire cellen. Het protocol werd met succes gebruikt met alle weefseltoestanden en met menselijke monsters. De incubatietijd met trypsine en collagenase kan echter variëren. Het is daarom belangrijk om het monster te controleren en de dissociatie van het weefsel en de levensvatbaarheid van de cellen om de paar minuten onder de microscoop te observeren. In een vroeg stadium van het dissociatieprotocol waren er lage aantallen geïsoleerde cellen en grote aantallen klonten (Figuur 2D, links). Ons doel was om geïsoleerde levensvatbare cellen te bereiken, zoals weergegeven in figuur 2D, midden, en een vermindering van het aantal levensvatbare cellen te voorkomen (figuur 2D, rechts).
Het is belangrijk op te merken dat langere incubatietijden de levensvatbaarheid van de cellen verminderden. Uitgaande van een weefsel van 0,5 x 10cm3 groot, hebben we in totaal 5 x 106 cellen teruggevonden, waarvan 5 x 105 tdTomato-positieve cellen. Volgens de analyse van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) in figuur 3 ondersteunt ons pancreasdissociatieprotocol het herstel van meerdere celtypen, waaronder acinaire cellen, ductale cellen, endotheelcellen, fibroblasten, immuuncellen en pericyten met een hoge levensvatbaarheid. De werkelijke verhouding tussen het aantal cellen van elk type in het weefsel vóór dissociatie kan echter verschillen, afgeleid uit de fluorescentiebeelden van bevroren pancreassecties die tdTomato-positieve cellen bevatten (Figuur 2E). De hoge levensvatbaarheid die wordt bereikt met behulp van het hierboven beschreven protocol wordt aangetoond door de FACS-analyse (Figuur 3) en het tellen van levende cellen/dode cellen met behulp van een hemocytometer (Figuur 3H).
Voor elk monster voerden we scRNA-seq uit en, in overeenstemming met de FACS-analyse, bevestigden we de detectie van alle bovengenoemde celtypen (Figuur 4A,B), in elk van de gereseceerde weefsels vanaf alle tijdstippen na de tamoxifeninjectie. We onderzochten ook de expressie van carboxypeptidase 1 (Cpa1), dat codeert voor carboxypeptidase1. Cpa1-expressie in acinaire cellen is extreem hoog en kan aangeven in welke mate acinaire cellen tijdens de dissociatie zijn gelyseerd, evenals de mate waarin ze het transcriptoom van andere celtypen hebben besmet. We ontdekten minimale verontreiniging, zoals te zien is in figuur 4C,D. De zachte dissociatie resulteert ook in een hoge levensvatbaarheid die ons in staat stelt om de celsortering van gewenste celtypen op te volgen voor aanvullende experimenten (Figuur 3).
Samen ondersteunt de kwaliteit van het dissociatieprotocol verschillende vervolgexperimenten, waaronder scRNA-seq.
Figuur 1: Schema van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van pancreascellen. (A) Een foto van de alvleesklier (in rood), lever en milt van de muis na het volledig openen van de buikholte. (B) Dezelfde muis als in (A) na verwijdering van de alvleesklier. (C) De dissectie van de alvleesklier. De alvleesklier na verwijdering van het dier (links). De alvleesklier splitst zich daarna in kleine stukjes (midden). Fasescheiding na centrifugeren (rechts). (D) Bewaking van de cellen onder de microscoop om de levensvatbaarheid van afzonderlijke cellen te onderzoeken. Totale primaire pancreascelisolatie (20x). Klompjes cellen na 15 minuten enzymatische reactie (links). Eencellige suspensie na 25 minuten enzymatische reactie (midden). Verminderde levensvatbaarheid van de cellen na een lange incubatie (rechts). (E) Fluorescentiebeelden van een bevroren pancreassectie. Acinar-cellen zijn tdTomato-positief ; DAPI kleuring in blauw (foto bij 40x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: FACS-analyse van eencellige suspensie van alvleesklierkanker . (A) tdTomatenpositieve en -negatieve cellen. (B) Flowcytometrie van ongesorteerde (rode) versus gesorteerde (blauwe) acinaire cellen. (C,F) Ongekleurde cellen, APC en PB450. (D) FACS-analyse na kleuring met anti-CD31, een marker van endotheelcellen. (E) FACS-analyse na kleuring met Anti-CD140b, een marker van pericyten. (G) FACS-analyse na kleuring met Anti-CD11c, een marker van dendritische cellen en macrofagen. (H) Verhouding tussen levende en dode cellen in vier verschillende pancreascelisolaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van scRNA-seq data die is geproduceerd met behulp van het protocol dat we in dit artikel beschrijven. (A) UMAP toont scRNA-seq van een alvleesklier van een muis op verschillende tijdstippen na de tamoxifen-injectie, zoals aangegeven aan de rechterkant van het paneel. (B) Celtypen werden bepaald op basis van bekende markers. (C,D) Cellen worden gekleurd volgens het expressieniveau van Cpa1 (in C) of het niveau van tdTomato (in D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we een protocol voor dissociatie van pancreasweefsel. Het protocol is eenvoudig, gebruiksvriendelijk en biedt een hulpmiddel om levensvatbare afzonderlijke cellen uit pancreasweefsel te isoleren in verschillende stadia tijdens het maligniteitsproces, inclusief solide tumoren. In eerdere studies werden verschillende soorten collagenasen gebruikt om de alvleesklier te verteren 8,9. Het gebruik van een zeer krachtig collagenase, zoals collagenase D, resulteert in een grote populatie immuuncellen en een lager percentage epitheelcellen. Het gebruik van collagenase P maakt pancreasvertering mogelijk die geschikt is voor intact of tumoralvleesklierweefsel.
Op basis van onze waarnemingen kunnen alle celtypen worden geïsoleerd. Eerder valideerden we de infiltratie van immuun-T-cellen, bijvoorbeeld met behulp van immunohistochemie5; We zijn van mening dat het relatieve aantal cellen dat we in onze analyse hebben waargenomen een goede benadering is van de werkelijke representatie van cellen in het weefsel, met uitzondering van acinaire cellen die kwetsbaar zijn en daarom ondervertegenwoordigd waren. We raden aan om immunohistochemie of ruimtelijke transcriptomics10,11,12 te gebruiken als er behoefte is aan nauwkeurige verhoudingen van celtypen in het weefsel. Bovendien hebben we waargenomen dat de dissociatie van weefsel van wildtype muizen in afwezigheid van constitutief actieve KRAS-expressie een grotere uitdaging is en frequentere monitoring vereist, om de enzymatische reactie op tijd te stoppen door 10% FBS aan de wasbuffer toe te voegen en massale celdood te voorkomen. Dit komt ook overeen met contaminatie door sommige zeer overvloedige acinaire transcripten, zoals Cpa1, hoewel ons protocol dit probleem minimaliseert.
De celisolatie kan worden gebruikt voor scRNA-seq, zoals we er5 lieten zien, voor het kweken van cellen, of als uitgangsmateriaal voor bijvoorbeeld organoïden.
De behoefte aan vers weefsel is een beperking van de methode. Een alternatieve benadering die zich richt op de isolatie van kernen, single-nucleus RNA sequencing (sNuc-seq)13, werd onlangs gebruikt om PDAC-tumoren van patiënten met een eencellige resolutie te onderzoeken11; in de toekomst zal het interessant zijn om de datakwaliteit van pancreasepitheelcellen die worden verkregen uit sNuc-seq te vergelijken met scRNA-seq. Belangrijk is dat kernextractie geen celkweek mogelijk maakt, en sorteren om te verrijken voor specifieke celtypen is een enorme uitdaging. Daarom zal het weefseldissociatieprotocol in de toekomst nuttig zijn voor scRNA-seq-experimenten en voor deze aanvullende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
We willen Dr. Avital Sarusi-Portuguez bedanken voor zijn hulp bij de data-analyse en Dr. Dror Kolodkin-Gal voor zijn hulp bij het opstellen van het protocol in een eerdere studie. We danken alle voormalige en huidige leden van het Parnas-lab. We danken Dr. Gillian Kay en Dr. Michael Kanovsky voor hun hulp bij het bewerken. Dit project is gefinancierd door de Israel Science Foundation-subsidie (nr. 526/18 O.P.), het Alex U. Soyka-programma en een subsidie van het Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
