Summary
本プロトコールは、膠芽腫細胞に対するミクログリアの抗腫瘍特性を増強する可能性のある免疫調節分子としての4つの異なる真菌β−グルカンの精製ステップおよびその後の研究を記載する。
Abstract
膠芽腫に対する効果的な治療法を開発する上での最大の課題の1つは、腫瘍微小環境内の強力な免疫抑制を克服することです。免疫療法は、腫瘍細胞に対する免疫系の反応を変えるための効果的な戦略として浮上しています。神経膠腫関連マクロファージおよびミクログリア(GAM)は、このような抗炎症シナリオの主要な推進力である。したがって、GAMにおける抗癌反応を増強することは、膠芽腫患者を治療するための潜在的な補助療法を表す可能性がある。その静脈では、真菌βグルカン分子は強力な免疫調節剤として長い間知られています。自然免疫活性を刺激し、治療反応を改善するそれらの能力が記載されている。これらの調節機能は、興味深いことにGAMで大きく発現しているパターン認識受容体に結合する能力に部分的に起因しています。したがって、この研究は、膠芽腫細胞に対するミクログリアの殺腫瘍応答を増強するための真菌β-グルカンの単離、精製、およびその後の使用に焦点を当てています。マウス神経膠芽腫(GL261)およびミクログリア(BV-2)細胞株は、現在のバイオ医薬品業界で頻繁に使用されているキノコから抽出された4つの異なる真菌βグルカン(ヒラタケ、 ヒラタケジャ モール、 ヘリシウムエリナセウス、および 霊芝)の免疫調節特性をテストするために使用されます。これらの化合物を試験するために、共刺激アッセイを実施して、膠芽腫細胞の増殖およびアポトーシス活性化に対する予め活性化されたミクログリア馴化培地の効果を測定した。
Introduction
神経腫瘍学の分野における新しい成果の出現にもかかわらず、膠芽腫患者の平均余命は依然としてわずかである。脳腫瘍に対するゴールドスタンダードの治療法は、手術、放射線療法、化学療法の融合に基づいています。しかし、過去10年間で、免疫療法はさまざまな種類の癌を治療するための強力な戦略として浮上しています1。このように、腫瘍細胞に対する体の免疫応答を利用する可能性は、最近、腫瘍学の第4の柱となっています。
この分野での最大の課題の1つは、腫瘍微小環境内に見られる強力な免疫抑制を克服することであることは長い間知られていました2。特に、脳腫瘍の最も一般的で攻撃的な形態の1つである膠芽腫の場合、そのような腫瘍促進シナリオを調整する重要な経路を解明し、免疫系の抑うつ反応を打ち消す可能性のある新しい化合物を見つけることは、この不治の病に対する将来の治療法への道を開く可能性があります。
脳はそれ自身の免疫系細胞を持っており、最も関連性の高い細胞型はミクログリアです。これらの細胞は、異なる中枢性疾患にわたってかなり複雑な挙動を有することが証明されている3。原発性脳腫瘍(例えば、膠芽腫)の場合、これらの細胞は、腫瘍細胞が脳実質にコロニーを形成することを支持する抗炎症性表現型に向かってシフトする3。多数の出版物が、腫瘍の進行におけるこれらの細胞の主要な役割を強化している。この主な理由の1つは、神経膠腫関連ミクログリアと浸潤マクロファージ(GAM)が全腫瘍量の3分の1を占めているため、脳腫瘍の進行中の活性化状態の明確な影響を示唆しています4,5。
その静脈において、真菌βグルカンは、食作用および炎症誘発因子産生を含む効果的な免疫応答を引き起こし、有害な物質の排除につながる強力な分子として説明されています6,7,8,9,10。真菌βグルカンは、一般に、さまざまなキノコの部分からの抽出物を使用して研究されてきました。しかしながら、特定の効果の帰属は、あいまいさを避け、免疫調節剤8のような分子の作用機序を理解できるようにするために、その精製を必要とする。
この研究では、可溶性βグルカンは、食用(ヒラタケ および ヒラタケ)および薬用キノコ(霊芝 および ヘリシウムエリナセウス)として定期的に使用される4つの異なるキノコの子実体から精製されます。特に、これらの4つのキノコは、食品および製薬業界で非常に用途があり、営利企業の環境に優しい循環経済内で生産されました( 材料表を参照)。
脳腫瘍治療における真菌βグルカンの将来の使用の基礎を築くためには、明確に定義された精製戦略と免疫系細胞との推定相互作用を掘り下げた前臨床試験が、抗腫瘍メディエーターとしての潜在的な役割を評価するために不可欠です。この研究では、選択したキノコの子実体に含まれる可溶性βグルカンを回収するために必要な分離と精製の多数のステップについて説明しています。精製に成功すると、ミクログリア細胞が活性化され、炎症性表現型が増強されます。マウス神経膠芽腫細胞(GL261)を、これらの抽出物で処理した別のミクログリア馴化培地でコーティングし、腫瘍細胞の挙動に対するその効果を評価します。興味深いことに、私たちの研究室からのパイロット研究(データは示されていません)は、炎症誘発性ミクログリアが膠芽腫細胞だけでなく他の癌細胞株においても腫瘍細胞の移動と浸潤特性をどのように遅らせるかを明らかにしました。この学際的な研究は、腫瘍学研究者が多くの異なる種類の腫瘍における免疫応答を高めることができる有望な化合物をテストするための有用なツールを提供する可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルに記載されている4つの異なるキノコの変種は、商業的な情報源から入手しました( 材料表を参照)。
1.真菌β-グルカンの単離
- 可溶性キノコ多糖類の抽出と単離
注:可溶性キノコ多糖類(SMP)は、 図1に模式的に示される手順に従って得られた。- 新鮮なオズトリタス菌、オズミガ原虫、エリナセウス菌、およびグルシダム子実体(約2,000 g /キノコ)を蒸留水で5回そっとすすぎます。
- 子実体を従来の風乾オーブンで50±2°Cで一定の重量に達するまで乾燥させます(~24時間)。
- 乾燥したキノコをブレードミルで粉砕し、各キノコから約200 gの粉末を得る。
- 100 gのキノコ粉末(MP)(P. ostreatus、 P. djamor、H. erinaceus、 およびG. lucidum)を1,000 mLのH2Odに懸濁します。その後、オートクレーブを121°Cで15分間、最後に室温で30分間放置した。
- 得られた懸濁液を6,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 不溶性キノコ多糖類(IMP)を含む沈殿物を50±2°Cの風乾オーブンで24時間乾燥させます。
- 沈殿物を捨て、上清を保管してください。上清をロータリーエバポレーターで10倍濃縮します。
- SMPを含む濃縮物をエタノール(最終濃度80%)で4°Cで一晩沈殿させます。
- エタノール懸濁液を6,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、ペレット(沈殿物)を保持し、上清をピペットで廃棄します。
- 沈殿物を80%エタノールで3回洗浄してから、H2Od (10%w / v)に溶解します。pHを6.5 / 7に、温度を37°Cに調整し、それぞれ2Uおよび4Uのα-アミラーゼおよびグルコアミラーゼで処理して、製造元の指示に従ってα-グルカンを可溶化します( 材料表を参照)。
- α-アミラーゼ/グルコアミラーゼで処理した後、pHと温度をそれぞれ8.0および50°Cに調整し、アルカラーゼ(2.5 U / gタンパク質)で処理してタンパク質を可溶化します( 材料表を参照)。
注:この連続酵素処理は、エタノール沈殿中のβ-グルカンと共沈するほとんどのα-グルカンおよびタンパク質を除去します。 - 加水分解後、加水分解物を6,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、清浄な上清濃縮液をロータリーエバポレーターで5回遠心分離します。80%エタノールで再び沈殿させる。
- 得られた沈殿物をH2Odに可溶化し、セルロースチューブ膜(12,000Daカットオフ膜;材料表参照)を用いて蒸留水中で24時間透析し、低分子量分子を除去した。水溶性部分を回収し、凍結乾燥して可溶性βグルカン(SβG)を生成します。
- 糖とタンパク質の測定
- 各画分の全糖含量をフェノール硫酸法により測定し、標準物質8としてグルコースを用いた。
注:β-グルカン含量の定量は、酵素加水分解および酸化還元酵素(すなわち、exo-1,3-β-グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、およびペルオキシダーゼ)の活性に基づいて、β-グルカンアッセイキット(キノコおよび酵母;材料 表を参照)を使用して行うこともできます。製造元の指示に従ってください。 - 12 MH 2 SO 4の代わりに 18 MH2SO4 を使用してください。
- 総グルカンとαグルカンの含有量を別々に評価します。
- 得られたβグルカン値を、ケルダールプロトコルに従って、総グルカン値とαグルカン(トリプリケート)値の差として測定します。特定の場合において、タンパク質含量は、検量線11、12をプロットするためにアルブミンを用いて、Lowry法によって決定することができる。
- 各画分の全糖含量をフェノール硫酸法により測定し、標準物質8としてグルコースを用いた。
- 紫外吸収分光分析
- 200〜400 nm領域のサンプルをスキャンして、紫外可視分光光度計( 材料の表を参照)を使用してSβG紫外(UV)スペクトルを取得します(図2)。
- H2Od中の各SβGを1.0 mg/mL調製し、溶液を石英キュベットに移し、室温でスキャンします。
- 分子量分布解析
- 屈折率検出器とウルトラヒドロゲルリニアゲルろ過カラム(300 mm x 7.8 mm;図3)。
- 0.5 mL/min-1 の流速で溶離液として脱イオン水を使用し、標準物質としてデキストラン(110、80、および50 kDa)を使用して、40°Cでアッセイを実行します( 材料表を参照)。5 mLの画分を収集します。
- フーリエ変換赤外(FTIR)解析
- FTIR分光計で4000〜500 cm-1の範囲の赤外スペクトル(図4)を記録します。サンプルは、フィルムを形成するために事前にKBrと混合する必要があります(標準のFTIR手順;製造元の指示と材料表を参照)。
- 分子組成解析
- 標準的な手順に従って、高速薄層クロマトグラフィー(HPTLC)および質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー(GC-MS)によってSβGの分子組成を推定します12。
2. βグルカン誘発ミクログリア刺激の in vitro 研究
- 8ウェルチャンバースライドでのマウス膠芽腫およびミクログリア細胞の細胞培養
注:このプロトコルは、GL261(膠芽腫)およびBV2(ミクログリア)細胞株に特異的です。ただし、わずかな変更を加えることで、これらのステップを使用して他の癌および免疫細胞株を研究することができる可能性があります。- L-グルタミン、4.5 g / L D-グルコース、およびピルビン酸を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)完全培地を準備します。10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを追加します( 材料表を参照)。材料を37°Cの水浴中で15分間予熱します。
- 凍結したBV2およびGL261アリコートを水浴(37°C)に2分間解凍し、完全に解凍する直前にそれらを層流フードに運び、細胞を2つの異なる滅菌T25フラスコ(各細胞株に1つ)にプレートします。
- T25フラスコを37°C、5%CO2 で培養物がコンフルエントになるまでインキュベートします。
注意: 凍結条件と凍結保存時間に応じて、合流までの時間は異なる場合があります。これらの細胞株は通常、T75フラスコ内でコンフルエントに達するまでに3〜5日かかります。 - BV2細胞培養がコンフルエントになったら、0.6 x 106 細胞/ウェルの8ウェルチャンバースライドに移します。8ウェルチャンバースライドをインキュベーター内に24時間保持します。
- ミクログリア細胞を8ウェルチャンバースライドに播種したら、GL261細胞で同じプロトコルを繰り返します。
- β-グルカンによるミクログリアの活性化
- BV2細胞を4つの異なるβグルカン(オズトリータス菌、 ジャモール原虫、 G.ルシダム、 エリナセウス菌)で0.2 mg/mLの濃度で72時間コーティングします。1つの実験条件は未処理のままでなければならず(正常培地)、対照群として機能する。
- 72時間後にピペットで上清を収集し、残りの容量を0.20μmのシリンジフィルターに通します。その後、上清を-80°Cで少なくとも24時間凍結します。
- GL261の活性化ミクログリア馴化培地による治療
- GL261が8ウェルチャンバースライド内で80%コンフルエントになったら、βグルカン処理ミクログリア培地(ステップ2.2.2)を最終容量濃度25%で72時間加えます(総容量:250 μl/ウェル)。
- 72時間のインキュベーション後に培地を取り出し、廃棄する。
- 細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4, 0.1 M)で5分間3回洗浄します。
- 200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を4°Cで15分間添加して細胞を固定します。
注:免疫蛍光に使用される可能性のあるさまざまな抗体に応じて、固定方法は一般的な4%PFAとは異なる場合があります。アルコールベースの固定剤は、特定のエピトープを保存するのにより効率的である可能性があります。
- 免疫蛍光試験
- サンプルをトリトンX(PBST;0.01%)を含むPBSで10分間3回洗浄します。
- PBSTを除去し、ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキングバッファーをPBST(表1)に10%加え、室温で30分間加えます。
- ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体混合物(1:500ラットKi-67モノクローナル抗体および1:500ウサギ切断カスパーゼ-3抗体; 材料表参照)を含むPBSをウェルあたり200 μL加えます。4°Cで一晩インキュベートします。
- 4°Cで24時間インキュベートした後、サンプルを室温で30分間放置します。
- ウェルをシェーカー(低速)上のPBSで10分間3回洗浄します。
- PBSを取り出し、二次抗体(1:200ロバ抗ラットIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488および1:200ロバ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647; 材料表参照)の混合物を含むPBSを1ウェルあたり200 μLに交換し、室温、暗所で45分間処理します。
- サンプルをPBSで多目的シェーカーで10分間洗浄します。
- PBSを取り出し、PBS(1:5,000)で1分間希釈した4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をウェルあたり200 μL加えます。
- DAPIを除去し( 材料の表を参照)、PBSで細胞を5分間洗浄します。
- ウェルフレームを取り外し、各ウェルに50 μLのPBS:グリセロール(1:1)を加え、カバーガラスで覆います。
- スライドをマニキュアで密封します。
- 共焦点顕微鏡システムを使用して20倍で画像を取得します( 材料表を参照)。
3. 腫瘍細胞の増殖とアポトーシスの定量と解析
注:腫瘍細胞の増殖とアポトーシスに対するさまざまなβグルカンの潜在的な影響を測定するために、ImageJソフトウェアで社内スクリプトを使用して、Ki67(増殖)とcCasp3(アポトーシス)の正のピクセル数を定量化しました13。
- イメージ J を開きます。 [プラグイン] ボタンをクリックします。以前にプラグインフォルダにインストールされたプラグインである Coloc2をクリックし、最後に分析する画像を選択します11.
注:このプラグインは、Vasiliki Economopoulos博士(veconom@uwo.ca)との以前の接触の後に利用可能でした。スクリプトの代わりに、ImageJとFijiのソフトウェアには、同様の特性を持つ共局在解析用の異なるツールがあります( 材料表を参照)。 - コントロール(未処理、DMEMのみ)の条件に従って閾値を設定します。OK ボタンをクリックします。
注意: 背景と強度の不一致を避けるために、すべての画像を同じ条件で撮影する必要があります。好ましくは、イメージングセッションは同じ日に実行され、顕微鏡パラメータは画像間で変更されないべきである。 - 共局在ピクセルの結果の画像と、しきい値を超えるピクセルの割合または生の数を示す概要ウィンドウがポップアップ表示されることを確認します。対照(未処理)条件に関して結果を正規化する。
注:すべてのデータはSEM±平均値として与えられ、統計分析はグラフ作成および分析ソフトウェアを使用して実行されました(材料表を参照)。テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を使用しました。誤差は平均の標準誤差 (s.e.m.) (*p < 0.05, **p < 0.01) として表されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
β-グルカンの精製に成功
P. ostreatus、 P. djamor、 G. lucidum、および H. erinaceus の子実体から抽出および精製プロセス後に得られた MP、SMP、および SβG の質量を 表 1 にまとめた。真菌から得られたMP、SMP、およびSβGの基本組成(総炭水化物、βグルカン、およびタンパク質)を 表2に示します。これらの結果は、プロトコルがSMP中の大量のタンパク質含有量の検索をどのように可能にしたかを示しています。しかし、α-アミラーゼ/グルコアミラーゼとプロテアーゼによる酵素処理は、タンパク質の量を減らし、β-グルカン濃度を増加させました。
異なるSβGのUVスペクトルは、260 nmと280 nmにUV吸収ピークを示さず(図2A)、SβGには核酸(260 nm)とタンパク質(280 nm)がないことを示しています。さらに、SβGsの均質性は、紫外可視吸収分光電気化学(SEC)に従って試験した。クロマトグラム(図3)は良好な均質性を示し、H. erinaceus、G. lucidum、P. ostreatus、およびP. djamorでそれぞれ8.20、10.5、10、9、および11.3分に主要なシャープで単一のピークを示しました。これらのデータは、画分がホモポリマーと一致していることを示唆している。また、重量平均Mwは、検量線式に従って、それぞれH. erinaceus、G. lucidum、P. ostreatus、およびP. djamorについて、それぞれ約120.8、92.8、80.7、および75.9 kDaと計算されました(y = -0.0655x + 2.6194;R2 = 0.9951)。
FTIRスペクトルは、共有多糖結合に対応する分子振動を測定しました(図4)。スペクトルは、約3,435 cm-1で広く強いヒドロキシル基を示しました。また、多糖類14に対応する2,922 cm-1付近に弱いC-H伸縮ピークを示した。さらに、約1,641 cm-1の吸光度はアミドI15に割り当てられ、C=OおよびCN基の伸長振動に関連している可能性があります。約1,154 cm-1のシグナルは、グリコシド結合のC-O-C不斉伸張によるものと考えられます16。最後に、約1,072 cm-1のバンドは、βグルカンのC-O伸張を示しました16。893 cm-1付近の弱い吸収は、β-ピラノースの非対称屈折振動によるものと考えられ、糖単位17のβ配置を示しています。全体として、SβGは主に最小限の量のタンパク質と結合した炭水化物からなることがわかった。
SβGの単糖プロファイルは、HPTLCおよびGC-MSによってさらに研究されました。少量のD-ガラクトースとD-マンノースを含む大量のD-グルコースと微量のD-キシロース、D-ラムノース、D-フコース、およびL-アラビノースの存在が確認されました。 表3 は、 H. erinaceus、 G. lucidum、P. ostreatus、および P. djamorのSβGについて得られた結果をまとめたものである。
β-グルカンで事前活性化したミクログリア馴化培地は、がん細胞にアポトーシスを誘導しました
選択したキノコからのβ-グルカンの単離に成功し、完全に特性評価されたら、ミクログリア細胞培養物(BV2)に添加しました。GL261細胞にミクログリア馴化培地を添加してから72時間後(図5)、増殖(Ki67)およびアポトーシス(切断カスパーゼ3[cCasp3])の2つの重要なマーカーの発現を免疫蛍光法により測定した。ImageJソフトウェアの社内スクリプトを用いて、各蛍光チャネルの陽性画素数を定量化し、βグルカン誘導ミクログリア活性化の潜在的効果が腫瘍細胞の挙動にどのように影響するかを分析した。各蛍光色素の強度の閾値として対照サンプルを使用し、スクリプトはピクセル数を提供し、したがって、異なる実験条件の後に各マーカーの発現を示しました(図6)。
興味深いことに、GL261は、異なるミクログリア馴化培地に曝露された後、腫瘍増殖に関して有意差を被らなかった(図7)。しかし、 P. djamor (B) および H. erinaceus (C) は cCasp3 の強い誘導 (それぞれ約 6 倍および 9 倍の増加) を示した。
図1:分離プロトコル。P. streatus、P. djamor、H. erinaceus、および G. lucidum から SβG 調製物を単離および精製するためのプロトコルの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:βグルカンのUVスペクトル。 (A) オズトリータス、(B) G.ルシダム、(C) P.ジャモール、および(D) エリナセウスの200〜400 nm領域のUVスペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サイズ排除クロマトグラム。 (A) オズトリタス、(B) G.ルシダム、(C) P.ジャモール、および(D) エリナセウスのサイズ排除クロマトグラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:FTIRスペクトル。 (A) P. ostreatus、(B) G. lucidum、(C) P. djamor、および (D) H. erinaceus のフーリエ変換赤外 (FTIR) スペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:共刺激アッセイの概略図。マウスミクログリア(BV2)細胞をβグルカンで72時間コーティングした共刺激アッセイ。凍結保存およびろ過した後、上清を回収し、GL261細胞培養(25%)に72時間移した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:増殖とアポトーシスの画像。 GL261とDAPI(青)、Ki67(緑)、およびcCasp3(赤)とのトリプル共局在を示す免疫蛍光画像。「Prob Coloc」スクリプト(下の画像)により、各マーカーからの正のピクセルの数を定量化し、それらの間で共局在化することができました。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:増殖速度とアポトーシスの定量。ミクログリア馴化培地暴露後のGL261細胞におけるKi67(左)およびcCasp3(右)発現のコントロール条件(DMEM)に対する正規化値。(ア)ヒラタケ、(B)ヒラタケ、(C)エリナセウスy、(D)霊芝。 誤差は s.e.m. (*p < 0.05, **p < 0.01) として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| メガピクセル (g) | SMP (g) | SβGs (g) | |
| P.オストリータス | 201.3 ± 2.2 | 14.4 ± 0.9 (7.1%) | 5.3 ± 0.2 (2.6%) |
| P.ジャモール | 200.8 ± 1.9 | 13.5 ± 0.6 (6.7%) | 4.9 ± 0.3 (2.4%) |
| G.ルシダム | 201.8 ± 1.6 | 14.7 ± 1.2 (7.3%) | 5.5 ± 0.2 (2.7%) |
| H.エリナセウス | 204.2 ± 1.2 | 15.4 ± 0.8 (7.5%) | 5.7 ± 0.2 (2.8%) |
表1:グルカン含有量の表。P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum、および H. erinaceus の子実体から MP、SMP、および SβG を得るための質量収支。
| メガピクセル: | ティッカー | SβGs | ||
| CHt (%) | 67.3 ± 1.9 | 53.8 ± 2.3 | 90.1 ± 1.2 | |
| P.オストリータス | β-グルカン(%) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89.4 ± 2.3 |
| タンパク質(%) | 21.5±0.9 | 19.6 ± 0.8* | 0.4 ± 0.1※ | |
| CHt (%) | 68.3 ± 2.1 | 61.4 ± 3.1 | 93.4 ± 1.1 | |
| P.ジャモール | β-グルカン(%) | 24.3 ± 2.8 | 30.8 ± 3.5 | 91.3 ± 3.4 |
| タンパク質(%) | 19.9 ± 1.0 | 22.3 ± 1.1* | 0.9 ± 0.2※ | |
| G.ルシダム | CHt (%) | 66.4 ± 1.8 | 56.8 ± 2.9 | 93.7 ± 0.9 |
| β-グルカン(%) | 22.5 ± 1.9 | 24.9 ± 3.1 | 92.0 ± 2.6 | |
| タンパク質(%) | 18.9 ± 0.8 | 21.4 ± 0.6※ | 1.5 ± 0.4※ | |
| H.エリナセウス | CHt (%) | 67.4 ± 1.2 | 58.9 ± 1.9 | 93.8 ± 1.4 |
| β-グルカン(%) | 23.9 ± 1.6 | 35.9 ± 2.1 | 91.8 ± 2.8 | |
| タンパク質(%) | 17.6 ± 1.3 | 22.7 ± 1.8※ | 1.3 ± 0.2※ |
表2:総炭水化物。 MP、SMP、およびSβGの総炭水化物(CHt)、β-グルカン、およびタンパク質の乾燥重量(g)含量。 ケルダ法12により定量したタンパク質含量(MP)。(*、ローリー法9で定量したタンパク質)。
| D-グルック(%) | D-マン(%) | D-ガラ (%) | D-フコ(%) | D-キシロ(%) | D-ラム (%) | L-アラブ (%) | |
| H.エリナセウス | 91.6 ± 0.6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0.5 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | N.D |
| G.ルシダム | 94.3 ± 0.8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 | N.D. | 0.4 ± 0.1 |
| P.オストリータス | 93.8 ± 0.5 | 4.4 ± 0.1 | 0.8 ± 0.1 | 0.4 ± 0.1 | N.D. | N.D. | N.D. |
| P.ジャモール | 95.2 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | N.D. | N.D. | N.D. |
表3:単糖の特性評価。P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum、およびH. erinaceusのSβGの単糖プロファイル(n.d.、いくつかの単糖は検出できなかった)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究では、4つの異なる真菌からSβGの含有量を首尾よく分離、精製、および特性評価するための確立された技術の使用について説明しています。その結果、 P. ostreatus、 P. djamor、 G. lucidum、 H. erinaceusから得られたSMPを熱水抽出した後、α-アミラーゼ、グルコシダーゼ、プロテアーゼで加水分解処理した後、α-グルカンとタンパク質の含有量が減少し、純粋なSβGの量が大幅に濃縮されることが示されました。
それにもかかわらず、我々は、真菌βグルカンのほとんどが精製プロセス中に水不溶性であることを観察しました。この研究の主な関心は、その医学的/薬学的特性のためにSβGでした10,18。さらに、加水分解処理、エタノール沈殿、および透析のおかげで、可溶性低分子炭水化物、ペプチド、オリゴペプチド、およびアミノ酸がSMPから正常に除去され、異なるタイプのキノコを使用したが同様のプロセスを使用した他の以前の研究と同様の効率を示しました19,20。
SβGの純度を試験するために、異なるSβGのUVスペクトルをUV分光光度法によって調査し、200〜400nm領域のサンプルをスキャンした。260 nmと280 nmには紫外線吸収ピークは観察されず、SβGには核酸(260 nm)もタンパク質(280 nm)も含まれておらず、βグルカンが主にSβGを構成していることが再び示されました。200〜400 nmの領域のUVスペクトルは、280 nmで定義された/シャープなピックがないことを示しましたが、それでも小さなピークが観察されました。これは、少量の多糖結合タンパク質の存在によって説明することができ、 表2に示される結果と一致する。しかしながら、そのようなごくわずかな量の多糖類は、グルカンによって遮蔽され得る残りのタンパク質へのアクセスの遅れまたはグルカン結合タンパク質の完全な分解を妨げる立体効果によっても説明され得ると考えることは興味深い。重要なことに、SβGの均一性は、溶解した分子をサイズで精製するために使用される強力な分析技術であるSECによってさらにテストされ、プロトコルの結果が確認されました。
さらに、FTIRスペクトルを使用して、共有多糖結合に対応する分子振動を測定しました。前述のように、4つの真菌すべてについて同様のスペクトルが得られた。スペクトルの特徴は、多糖類14、アミドI15、およびβグルカン16の存在を示した。893 cm-1 付近の弱い吸収は、糖単位17のβ配置を示唆した。全体として、SβGは主に最小限のタンパク質と結合した炭水化物によって形成されることがわかりました。SβGを免疫調節分子として使用することへの関心に関して、多糖 - タンパク質複合体がそれらの免疫調節利益のためにしばしば注目されることを強調する価値がある21。
最後に、SβGの単糖プロファイルをHPTLCおよびGC-MSによって研究した。少量のD-ガラクトースとD-マンノース、および微量のD-キシロース、D-ラムノース、およびD-フコースを含む大量のD-グルコースの存在は、SβGsの主な成分がβ-グルカンであることを厳密に示唆しています。ただし、私たちの精製システムは、さまざまな古典的な手順を最適化することから生じることを明確にすることが重要です。現在、クロマトグラフィー技術(サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー)を中心に、いくつかのステップの改善に取り組んでいます。
免疫細胞に対するβグルカンの影響をテストするというこの研究の主な目的については、4種類のβグルカンの精製に成功した後、ミクログリアの活性化に対するそれらの潜在的な効果がテストされました。免疫蛍光は、増殖およびアポトーシスに関する2つのゴールドスタンダードマーカーに対して使用されました22、23。
腫瘍増殖率に統計的な差はなかったが、P. ostreatus(A)とH. erinaceus(C)はKi67の発現を最大50%低下させることができた。有意性の欠如は、G. lucidumに関する研究の分散が大きいためである可能性があります。さらに、癌細胞におけるアポトーシスの誘導はかなり興味深い治療アプローチであり、P. djamor (B)およびH. erinaceus(C)はcCasp3レベルの有意な誘導を示し、細胞死プログラムの活性化を示唆している。これらの結果はすべて、他のタイプの腫瘍におけるこれらの真菌の抗腫瘍効果を示した以前の研究に準拠しています24,25。実験は、同じ条件を維持し、同じ研究者によって導かれて、二重に実行されました。免疫蛍光研究の結果のソフトウェアベースの分析は、偏りのないアプローチをサポートし、この研究の潜在的な範囲を拡大します。
一般に、これらの研究には、化合物の純度であるβグルカンの使用に関する主な課題があります。免疫学的研究で使用した後、観察された効果が炭水化物によってのみ誘発され、精製が適切に行われない場合にそれらに付着したままになる可能性のあるタンパク質または他の構造によるものではないことを確認するために最高水準を追求することが必須である。将来の研究で考慮される可能性のある追加のステップの1つは、クロマトグラフィー技術(イオン交換またはサイズ排除など)の使用です。
研究後の全体的な結論は、 H. erinaceus を、腫瘍増殖を低下させ(~50%)、膠芽腫細胞の細胞死プログラムの強力な活性化を誘導する能力があるため、膠芽腫の治療のための潜在的な免疫療法の選択肢として最有力候補として位置付けています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
宣言する競合する利益はありません。
Acknowledgments
ImageJでフルオレッセンスシグナルを測定するための社内スクリプトを提供してくれたVasiliki Economopoulos博士に感謝します。また、CITIUS(セビリア大学)とそのすべての職員のデモ中のサポートにも感謝します。この研究は、セビリア大学のスペインのFEDER I + D + i-USE、US-1264152、およびシエンシア大学省PID2021-126090OA-I00によってサポートされました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
