Summary
Denne protokol beskriver oprensningstrinnene og efterfølgende undersøgelser af fire forskellige svampe-β-glucaner som potentielle immunmodulerende molekyler, der forbedrer mikroglia's antitumorale egenskaber mod glioblastomceller.
Abstract
En af de største udfordringer ved at udvikle effektive terapier mod glioblastom er at overvinde den stærke immunundertrykkelse i tumormikromiljøet. Immunterapi har vist sig som en effektiv strategi til at vende immunsystemets respons mod tumorceller. Gliom-associerede makrofager og mikroglia (GAM'er) er vigtige drivkræfter for sådanne antiinflammatoriske scenarier. Derfor kan forbedring af anticancerresponset i GAM'er repræsentere en potentiel co-adjuverende behandling til behandling af glioblastompatienter. På den måde har svampe- β-glucanmolekyler længe været kendt som potente immunmodulatorer. Deres evne til at stimulere den medfødte immunaktivitet og forbedre behandlingsresponsen er blevet beskrevet. Disse modulerende træk tilskrives delvis deres evne til at binde til mønstergenkendelsesreceptorer, som interessant nok i høj grad udtrykkes i GAM'er. Dette arbejde er således fokuseret på isolering, oprensning og efterfølgende anvendelse af svampe-β-glucaner for at forbedre mikroglia's tumoricide respons mod glioblastomceller. Musens glioblastom (GL261) og microglia (BV-2) cellelinjer bruges til at teste de immunmodulerende egenskaber af fire forskellige svampe β-glucaner ekstraheret fra svampe, der er stærkt anvendt i den nuværende biofarmaceutiske industri: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus og Ganoderma lucidum. For at teste disse forbindelser blev co-stimuleringsassays udført for at måle effekten af et præaktiveret mikroglia-konditioneret medium på proliferation og apoptoseaktivering i glioblastomceller.
Introduction
På trods af fremkomsten af nye resultater inden for neuro-onkologi forbliver glioblastompatienters forventede levetid mager. Guldstandardbehandlinger mod hjernetumorer er baseret på sammenlægning af kirurgi, strålebehandling og kemoterapi. Men i det sidste årti har immunterapi vist sig som en stærk strategi til behandling af forskellige typer kræft1. Således er muligheden for at udnytte kroppens immunrespons mod tumorceller for nylig blevet den fjerde søjle i onkologi.
Det har længe været kendt, at en af de største udfordringer på området er at overvinde den stærke immunsuppression, der findes i tumormikromiljøet2. Især i tilfælde af glioblastom, en af de mest almindelige og aggressive former for hjernekræft, kan opklaring af nøgleveje, der orkestrerer sådanne protumorale scenarier og finde nye forbindelser, der kan modvirke immunsystemets deprimerende respons, bane vejen for fremtidige terapier mod denne uhelbredelige sygdom.
Hjernen har sine egne immunsystemceller, og den mest relevante celletype er microglia. Disse celler har vist sig at have en ret kompleks adfærd på tværs af forskellige centrale sygdomme3. I tilfælde af primære hjernetumorer (fx glioblastom) skiftes disse celler mod en antiinflammatorisk fænotype, der understøtter tumorceller til at kolonisere hjernens parenchyma3. Talrige publikationer har forbedret disse cellers hovedrolle under tumorprogression. En af hovedårsagerne til dette er, at gliomassocierede mikroglia og infiltrerede makrofager (GAM'er) tegner sig for en tredjedel af den samlede tumormasse, hvilket tyder på den utvetydige indflydelse af deres aktiveringstilstande under hjernetumorprogression 4,5.
På denne måde er svampe- β-glucaner blevet beskrevet som potente molekyler, der udløser effektive immunresponser, herunder fagocytose og proinflammatorisk faktorproduktion, hvilket fører til eliminering af skadelige stoffer 6,7,8,9,10. Svampe β-glucaner er generelt blevet undersøgt ved hjælp af ekstrakter fra forskellige svampedele. Tilskrivningen af specifikke virkninger kræver imidlertid dets oprensning for at undgå tvetydigheder og for at kunne forstå virkningsmekanismen for sådanne molekyler som immunmodulerende midler8.
I dette arbejde renses opløselige β-glucaner fra frugtlegemet af fire forskellige svampe, der regelmæssigt anvendes som spiselige (Pleurotus ostreatus og Pleurotus djamor) og som medicinske (Ganoderma lucidum og Hericium erinaceus) svampe. Især disse fire svampe har stor anvendelse i fødevare- og medicinalindustrien og blev produceret inden for en miljøvenlig cirkulær økonomi i en kommerciel virksomhed (se materialetabel).
For at lægge grundlaget for den fremtidige anvendelse af svampe-β-glucaner i hjernekræftterapier er veldefinerede oprensningsstrategier og prækliniske undersøgelser, der dykker ned i deres formodede interaktion med immunsystemets celler, afgørende for at evaluere deres potentielle rolle som antitumormediatorer. Dette arbejde beskriver de mange trin i isolering og rensning, der er nødvendige for at hente de opløselige β-glucaner indeholdt i frugtlegemerne i den udvalgte svamp. Når de er renset, aktiveres mikrogliaceller for at forbedre deres inflammatoriske fænotype. Mus glioblastomceller (GL261) er belagt med et andet mikroglia-konditioneret medium, der tidligere er behandlet med disse ekstrakter, og derefter evalueres dets virkning på tumorcellernes adfærd. Interessant nok har pilotundersøgelser fra vores laboratorium (data ikke vist) afdækket, hvordan proinflammatorisk mikroglia kan bremse tumorcellemigration og invasionsegenskaber ikke kun i glioblastomceller, men også i andre kræftcellelinjer. Dette tværfaglige arbejde kan give et nyttigt værktøj for onkologiske forskere til at teste lovende forbindelser, der er i stand til at øge immunresponset i mange forskellige typer tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De fire forskellige svampevarianter, der er beskrevet i denne protokol, blev opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Isolering af svampe β-glucaner
- Ekstraktion og isolering af opløselige svampepolysaccharider
BEMÆRK: Opløselige svampepolysaccharider (SMP'er) blev opnået i henhold til proceduren skematisk vist i figur 1.- Skyl forsigtigt friske frugtlegemer af P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus og G. lucidum (ca. 2.000 g/svampe) i destilleret vand fem gange.
- Frugtlegemerne tørres ved 50 ± 2 °C i en almindelig lufttørreovn, indtil en konstant vægt er nået (~24 timer).
- Jord de tørrede svampe i en bladmølle, opnå ca. 200 g pulver fra hver svamp.
- Suspender 100 g svampepulver (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus og G. lucidum) i 1.000 ml H2O d. Derefter autoklave ved 121 °C i 15 min, og lad til sidst stå ved stuetemperatur i 30 min.
- Den resulterende suspension centrifugeres ved 6.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Bundfaldet med uopløselige svampepolysaccharider (IMP) tørres ved 50 ± 2 °C i en lufttørreovn i 24 timer.
- Bundfaldet kasseres, og supernatanten beholdes. Supernatanten koncentreres 10 gange i en rotationsfordamper.
- Koncentratet indeholdende SMP'er udfældes med ethanol (80 % slutkoncentration) ved 4 °C natten over.
- Ethanolsuspensionen centrifugeres ved 6.000 x g i 15 minutter ved 4 °C, pellet (bundfald) tilbageholdes, og supernatanten bortskaffes med en pipette.
- Bundfaldet vaskes tre gange med 80 % ethanol, før det opløses i H2Od (10 % w/v). pH-værdien indstilles til 6,5/7 og temperaturen til 37 °C, og der bearbejdes med henholdsvis 2 U og 4 U α-amylase og glucoamylase for at opløse α-glucaner efter producentens anvisninger (se materialetabellen).
- Efter behandling med α-amylase/glucoamylase, justeres pH og temperatur til henholdsvis 8,0 og 50 °C, og behandlingen behandles med alcalase (2,5 E/g protein) (se materialetabel) for at opløse proteinerne.
BEMÆRK: Denne sekventielle enzymatiske behandling fjerner de fleste α-glucaner og proteiner, der udfældes sammen med β-glucaner i ethanoludfældningen. - Efter hydrolyse centrifugeres hydrolysatet ved 6 000 x g i 15 minutter ved 4 °C, og det rene supernatant koncentreres fem gange i en rotationsfordamper. Udfæld igen med 80% ethanol.
- Det resulterende bundfald opløses iH2Odog dialyseres i destilleret vand i 24 timer ved hjælp af celluloserørmembraner (12.000 Da afskæringsmembraner; se materialetabel) for at fjerne molekyler med lav molekylvægt. Den vandopløselige del genvindes og frysetørres til opløselige β-glucaner (SβG'er).
- Måling af sukker og protein
- Det totale sukkerindhold i hver fraktion måles ved phenolsvovlsyremetoden ved anvendelse af glucose som standard8.
BEMÆRK: Kvantificering af β-glucanindholdet kan også foretages ved anvendelse af β-glucan-analysesættet (champignon og gær; se materialetabel) baseret på enzymatisk hydrolyse og aktiviteten af oxidoreduktaser: nemlig exo-1,3-β-glucanase, glucoseoxidase, β-glucosidase og peroxidase med den efterfølgende dannelse af quinoneimin. Følg producentens anvisninger med små ændringer. - Brug 18 MH 2 SO4 i stedet for 12 MH2SO4.
- Indholdet af det samlede indhold af glucaner og α-glucaner vurderes separat.
- Mål de resulterende β-glucanværdier som forskellen mellem de samlede glucan- og α-glucan-værdier (triplicate) efter Kjeldahl-protokollen. I visse tilfælde kan proteinindholdet bestemmes ved hjælp af Lowry-metoden, hvor albumin afbildes kalibreringskurven11,12.
- Det totale sukkerindhold i hver fraktion måles ved phenolsvovlsyremetoden ved anvendelse af glucose som standard8.
- Ultraviolet absorptionsspektroskopi analyse
- SβG ultraviolette (UV) spektre opnås ved hjælp af et UV-synligt spektrofotometer (se materialetabellen) ved at scanne prøverne i området 200-400 nm (figur 2).
- Der fremstilles 1,0 mg/ml af hver SβG iH2Od, opløsningen overføres til en kvartskuvette og scannes ved stuetemperatur.
- Analyse af molekylvægtfordeling
- Homoegeniteten af SβG'er og molekylvægten af polymerer estimeres ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) ved hjælp af et højtydende væskekromatografisystem (HPLC) (se materialetabellen) udstyret med en brydningsindeksdetektor og en ultrahydrogel lineær gelfiltreringssøjle (300 mm x 7,8 mm; Figur 3).
- Udfør analysen ved 40 °C ved hjælp af deioniseret vand som elueringsmiddel ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min-1 og dextrans (110, 80 og 50 kDa) som standarder (se materialetabel). Saml en 5 ml fraktion.
- Fourier-transform infrarød (FTIR) analyse
- De infrarøde spektre (figur 4) registreres på et FTIR-spektrometer i området 4000-500 cm-1. Prøverne skal tidligere blandes med KBr for at danne film (standard FTIR-procedure; se producentens instruktioner og materialefortegnelse).
- Molekylær sammensætning analyse
- De molekylære sammensætninger af SβG'er estimeres ved højtydende tyndtlagskromatografi (HPTLC) samt gaskromatografi koblet til massespektrometri (GC-MS) efter standardprocedurer12.
2. In vitro-undersøgelse af β-glucan-induceret mikrogliastimulering
- Cellekultur af museglioblastom og mikrogliaceller i 8-brønds kammerglas
BEMÆRK: Denne protokol er specifik for GL261 (glioblastom) og BV2 (microglia) cellelinjer. Men med små ændringer kan disse trin potentielt bruges til at studere andre kræft- og immuncellelinjer.- Forbered Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) komplet medium modificeret med L-glutamin, 4,5 g / L D-glucose og uden pyruvat. Tilsæt 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (se materialetabel). Forvarm materialet i et vandbad ved 37 °C i 15 min.
- Optø frosne BV2- og GL261-alikvoter i et vandbad (37 °C) i 2 minutter, og lige før de tøer helt op, bæres de ind i en laminar strømningshætte og pladeres cellerne i to forskellige sterile T25-kolber (en for hver cellelinje).
- T25-kolberne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 , indtil kulturen er sammenflydende.
BEMÆRK: Afhængigt af fryseforholdene og tiden under kryopræservering kan tiden indtil sammenløbet variere. Disse cellelinjer kræver normalt mellem 3 og 5 dage for at nå sammenløbet i en T75-kolbe. - Når BV2-cellekulturen er flydende, overføres den til 8-brønds kammerdias 0,6 x 106 celler / brønd. Hold 8-brøndkammergliderne i inkubatoren i 24 timer.
- Når mikrogliacellerne er belagt i kammerobjektglassene med 8 brønde, gentages den samme protokol med GL261-cellerne.
- Aktivering af mikroglia med β-glucaner
- Overtræk BV2-cellerne med fire forskellige β-glucaner (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus) i en koncentration på 0,2 mg / ml i 72 timer. En eksperimentel tilstand skal forblive ubehandlet (normalt medium), der fungerer som kontrolgruppe.
- Supernatanten opsamles med en pipette efter 72 timer, og det resterende volumen ledes gennem et 0,20 μm sprøjtefilter. Derefter fryses supernatanten ved -80 °C i mindst 24 timer.
- Behandling af GL261 med præaktiveret mikroglia-konditioneret medium
- Når GL261 er 80 % sammenflydende i 8-brøndskammerglassene, tilsættes β-glucanbehandlet mikroglialt medium (trin 2.2.2) ved en slutvolumenkoncentration på 25 % i 72 timer (samlet volumen: 250 μl/hul).
- Fjern mediet efter 72 timers inkubation og kassér det.
- Vask cellerne med fosfatbuffersaltvand (PBS; pH 7,4, 0,1 M) tre gange i 5 minutter.
- Fastgør cellerne ved at tilsætte 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C i 15 minutter.
BEMÆRK: Afhængigt af de forskellige antistoffer, der kan anvendes til immunfluorescens, kan fikseringsmetoder afvige fra typisk 4% PFA. Alkoholbaserede fikseringsmidler kan være mere effektive til at bevare visse epitoper.
- Undersøgelse af immunfluorescens
- Prøverne vaskes med PBS med triton X (PBST; 0,01%) i 10 min tre gange.
- PBST fjernes og der tilsættes bovin serumalbumin (BSA) blokerende buffer 10% i PBST (tabel 1) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Den blokerende buffer fjernes, og der tilsættes 200 μL PBS pr. hul indeholdende den primære antistofblanding (1:500 rotte Ki-67 monoklonalt antistof og 1:500 kaninspaltet caspase-3-antistof; se materialetabel). Der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Efter 24 timers inkubation ved 4 °C efterlades prøverne ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Vask hullerne tre gange i 10 minutter med PBS på en ryster (lav hastighed).
- PBS fjernes og erstattes med 200 μL pr. hul PBS indeholdende blandingen af sekundære antistoffer (1:200 æselantirotte IgG (H + L) stærkt krydsadsorberet sekundært antistof, Alexa Fluor 488 og 1:200 æselantikanin IgG (H + L) stærkt krydsadsorberet sekundært antistof, Alexa Fluor 647; se materialetabel) i 45 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Prøverne vaskes med PBS i 10 minutter på en multifunktionel ryster.
- PBS fjernes, og der tilsættes 200 μL pr. hul med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i PBS (1:5.000) i 1 min.
- Fjern DAPI (se materialetabel) og vask cellerne i 5 min i PBS.
- Fjern brøndrammen, og tilsæt 50 μL PBS:glycerol (1:1) på hvert hul, og dæk med en dæksel.
- Forsegl diasene med neglelak.
- Få billeder ved 20x ved hjælp af et konfokalmikroskopsystem (se materialetabel).
3. Kvantificering og analyse af tumorcelleproliferation og apoptose
BEMÆRK: For at måle den potentielle effekt af de forskellige β-glucaner på tumorcelleproliferation og apoptose blev der brugt et internt script i ImageJ-software til at kvantificere antallet af positive pixels af Ki67 (proliferation) og cCasp3 (apoptose)13.
- Åbn ImageJ. Klik på knappen Plugins . Klik på Coloc2, et plugin, der tidligere er installeret i plugin-mappen, og vælg til sidst billedet for at analysere11.
BEMÆRK: Dette plugin var tilgængeligt efter tidligere kontakt med Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). I stedet for scriptet har både ImageJ- og Fiji-software forskellige værktøjer til colokaliseringsanalyse (se materialetabel) med lignende egenskaber. - Indstil tærskler i henhold til kontrolbetingelserne (ubehandlet, kun DMEM). Klik på OK knap.
BEMÆRK: For at undgå uoverensstemmelser mellem baggrund og intensitet skal alle billeder tages under de samme forhold. Billedbehandlingssessioner skal helst udføres samme dag, og mikroskopparametre skal ændres på tværs af billeder. - Sørg for, at de resulterende billeder af de samlokaliserede pixels og et oversigtsvindue, der angiver procentdelen eller det rå antal pixels over tærsklen, dukker op. Normaliser resultaterne med hensyn til kontrol (ubehandlet) tilstande.
BEMÆRK: Alle data er angivet som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af graf- og analysesoftware (se materialetabel). En envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest blev brugt. Fejl er repræsenteret som standardfejl for middelværdien (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket rensning af β-glucaner
Massen af MP, SMP'er og SβG'er opnået fra frugtlegemer af P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus efter ekstraktions- og rensningsprocessen er opsummeret i tabel 1. Den grundlæggende sammensætning (samlede kulhydrater, β-glucaner og protein) af MP, SMP'er og SβG'er opnået fra svampene er afbildet i tabel 2. Disse resultater viser, hvordan protokollen tillod hentning af en stor mængde proteinindhold i SMP'er. Den enzymatiske behandling med α-amylase/glucoamylase og protease reducerede imidlertid mængden af protein og øgede β-glucankoncentrationen.
UV-spektre af de forskellige SβG'er viste ingen UV-absorptionstoppe ved 260 og 280 nm (figur 2A), hvilket indikerer, at SβG'er manglede nukleinsyrer (260 nm) og proteiner (280 nm). Desuden blev homogeniteten af SβG'er testet efter UV-synlig absorptionsspektroelektrokemi (SEC). Kromatogrammerne (figur 3) viste god homogenitet med en skarp og enkelt top på 8,20, 10,5, 10,9 og 11,3 min for henholdsvis H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus og P. djamor. Disse data tyder på, at fraktionen er i overensstemmelse med homopolymerer. Desuden blev den vægtgennemsnitlige Mw beregnet som omkring 120,8, 92,8, 80,7 og 75,9 kDa for henholdsvis H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus og P. djamor ifølge kalibreringskurveligningen (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
FTIR-spektrene målte molekylære vibrationer, der svarede til kovalente polysaccharidbindinger (figur 4). Spektrene udviste en bred og intens hydroxylgruppe på omkring 3.435 cm-1. Det viste også en svag C-H-strækningstop på omkring 2.922 cm-1, svarende til polysaccharider14. Desuden kunne absorbansen på ca. 1,641 cm-1 tildeles amid I15 i forbindelse med forlængelsesvibrationerne i C=O- og KN-grupperne. Signalet på omkring 1.154 cm-1 kan skyldes C-O-C asymmetrisk strækning af den glycosidiske kobling16. Endelig indikerede båndet på omkring 1.072 cm-1 C-O-strækning af β-glucaner 16. Den svage absorption nær 893 cm-1 kan skyldes den asymmetriske brydningsvibration af β-pyranose, der viser β-konfigurationen af sukkerenheder17. Samlet set viste det sig, at SβG'er hovedsageligt bestod af kulhydrat konjugeret med en minimal mængde protein.
SβG's monosaccharidprofil blev yderligere undersøgt af HPTLC og GC-MS. Tilstedeværelsen af en stor mængde D-glucose med mindre mængder D-galactose og D-mannose og et spor af D-xylose, D-rhamnose, D-fucose og L-arabinose blev bekræftet. Tabel 3 opsummerer de opnåede resultater for SβG'er af H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus og P. djamor.
Mikroglia-konditioneret medium, præaktiveret med β-glucan, induceret apoptose i kræftceller
Når β-glucaner fra de udvalgte svampe med succes blev isoleret og fuldt karakteriseret, blev de tilsat til mikrogliacellekulturen (BV2). 72 timer efter tilsætning af mikroglia-konditioneret medium til GL261-cellerne (figur 5) blev ekspressionen af to nøglemarkører for proliferation (Ki67) og apoptose (spaltet caspase 3 [cCasp3]) målt ved immunofluorescens. Ved hjælp af et internt script i ImageJ-software blev antallet af positive pixels for hver fluorescerende kanal kvantificeret, og dermed blev den måde, hvorpå den potentielle effekt af β-glucan-induceret mikroglial aktivering kan påvirke tumorcellernes adfærd, analyseret. Ved hjælp af kontrolprøver som tærskel for intensiteten af hver fluorofor gav scriptet antallet af pixels og angav således udtrykket for hver markør efter de forskellige eksperimentelle betingelser (figur 6).
Interessant nok led GL261 ikke nogen signifikant forskel med hensyn til tumorspredning, når den først blev udsat for de forskellige mikroglia-konditionerede medier (figur 7). Imidlertid viste P. djamor (B) og H. erinaceus (C) en stærk induktion (henholdsvis ca. seks gange og ni gange stigning) af cCasp3.
Figur 1: Isolationsprotokol. Skematisk over protokollen til isolering og rensning af SβG-præparatet fra P. streatus, P. djamor, H. erinaceus og G. lucidum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: UV-spektre af β-glucaner. UV-spektre i 200-400 nm-området af (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor og (D) H. erinaceus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Størrelsesekskluderende kromatogrammer. Størrelseseksklusionskromatogrammer af (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor og (D) H. erinaceus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: FTIR-spektre. Fourier-transform infrarøde (FTIR) spektre af (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor og (D) H. erinaceus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skematisk oversigt over co-stimulationsassays. Co-stimulationsanalyse, hvor musemikrogliaceller (BV2) blev overtrukket i 72 timer med β-glucaner. Efter at være blevet kryopræserveret og filtreret blev supernatanten opsamlet og overført til GL261-cellekultur (25 %) i 72 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billeder af spredning og apoptose. Immunofluorescensbilleder, der viser en tredobbelt colokalisering af GL261 med DAPI (blå), Ki67 (grøn) og cCasp3 (rød). 'Prob Coloc'-scriptet (nederste billeder) gjorde det muligt at kvantificere antallet af positive pixels fra hver markør og colokalisering blandt dem. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kvantificering af spredningshastigheder og apoptose. Normaliserede værdier med hensyn til kontrolbetingelserne (DMEM) for Ki67 (venstre) og cCasp3 (højre) ekspression i GL261-celler efter den mikroglia-konditionerede medieeksponering. a) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Fejl repræsenteres som s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01). Klik her for at se en større version af denne figur.
| MP (g) | SMP'er (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5,3 ± 0,2 (2,6%) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Tabel 1: Tabel over glucanindhold. Massebalance til opnåelse af MP, SMP'er og SβG'er fra frugtlegemer af P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus.
| MP | SMP'er | SβG'er | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-glucan (%) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89,4 ± 2,3 |
| Protein (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2,1 | 61.4 ± 3.1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-glucan (%) | 24.3 ± 2.8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Protein (%) | 19,9 ± 1,0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-glucan (%) | 22,5 ± 1,9 | 24.9 ± 3.1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Protein (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-glucan (%) | 23.9 ± 1.6 | 35.9 ± 2.1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Protein (%) | 17.6 ± 1.3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tabel 2: Samlede kulhydrater. Tørvægt (g) indhold af samlede kulhydrater (CHt), β-glucan og protein af MP, SMP'er og SβGs. Proteinindhold (MP) kvantificeret ved Kjeldah-metoden12. (*, proteiner kvantificeret ved Lowry-metoden9).
| D-gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-xylo (%) | D-Rham (%) | L-arabisk (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0.5 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | n.d |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 0.9 ± 0.2 | n.d. | 0.4 ± 0.1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4.4 ± 0.1 | 0,8 ± 0,1 | 0.4 ± 0.1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabel 3: Karakterisering af monosaccharider. Monosaccharidprofil af SβG'er af P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus (nd, nogle monosaccharider var uopdagelige).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver brugen af veletablerede teknikker til succesfuldt at isolere, rense og karakterisere indholdet af SβG'er fra fire forskellige svampe. Resultaterne viste, hvordan indholdet af α-glucan og protein blev reduceret efter varmtvandsekstraktion af SMP'er, opnået fra P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum og H. erinaceus, efterfulgt af hydrolytisk behandling med α-amylase, glucosidase og protease, hvilket signifikant berigede mængden af rene SβG'er.
På trods af dette observerede vi, at de fleste svampe-β-glucaner var vanduopløselige under rensningsprocessen. Undersøgelsens hovedinteresse var SβG'erne på grund af deres medicinske/farmaceutiske egenskaber10,18. Takket være hydrolytisk forarbejdning, ethanoludfældning og dialyse blev opløselige kulhydrater, peptider, oligopeptider og aminosyrer med lav molekylvægt desuden fjernet med succes fra SMP'er, hvilket viste en lignende effektivitet som andre tidligere værker ved hjælp af en anden type svampe, men med lignende processer19,20.
For at teste renheden af SβG'er blev UV-spektrene for de forskellige SβG'er undersøgt ved UV-spektrofotometri og scannede prøverne i 200-400 nm-området. Der blev ikke observeret UV-absorptionstoppe ved 260 nm og 280 nm, hvilket indikerer, at SβG'er hverken havde nukleinsyrer (260 nm) eller proteiner (280 nm), hvilket igen viser, at β-glucaner hovedsageligt udgjorde SβG'erne. Selvom UV-spektre i området 200-400 nm viste fraværet af et defineret/skarpt valg ved 280 nm, kunne der stadig observeres en lille top. Dette kan forklares ved tilstedeværelsen af en lille mængde polysaccharidbundne proteiner, der stemmer overens med resultaterne vist i tabel 2. Det er imidlertid interessant at overveje, at en så ubetydelig mængde polysaccharider også kan forklares ved den forsinkede adgang til de resterende proteiner, som kan være beskyttet af glucaner eller af steriske virkninger, der forhindrer fuldstændig nedbrydning af glucanbundne proteiner. Det er vigtigt, at homogeniteten af SβG'er blev yderligere testet af SEC, en kraftfuld analytisk teknik, der blev brugt til at rense opløste molekyler efter størrelse, hvilket bekræftede protokolresultaterne.
Derudover blev FTIR-spektre anvendt til at måle molekylære vibrationer svarende til kovalente polysaccharidbindinger. Som tidligere beskrevet blev lignende spektre opnået for alle fire svampe. Spektrefunktionen udviste tilstedeværelsen af polysaccharider14, amid I 15 og β-glucaner16. Den svage absorption nær 893 cm-1 antydede β-konfigurationen af sukkerenheder17. Samlet set viste det sig, at SβG'er hovedsageligt blev dannet af kulhydrater konjugeret med minimalt protein. Med hensyn til interessen for at anvende SβG'er som immunmodulerende molekyler er det værd at fremhæve, at polysaccharidproteinkomplekser ofte bemærkes for deres immunmodulerende fordele21.
Endelig blev monosaccharidprofilen for SβG'er undersøgt af HPTLC og GC-MS. Tilstedeværelsen af en stor mængde D-glucose med mindre mængder D-galactose og D-mannose og spor af D-xylose, D-rhamnose og D-fucose indebærer strengt, at den overvejende komponent i SβGs er β-glucan. Det er dog vigtigt at præcisere, at vores rensningssystem er resultatet af optimering af forskellige klassiske procedurer. Vi arbejder i øjeblikket på at forbedre flere trin, primært fokuseret på kromatografiteknikker (størrelsesudelukkelse og ionbytningskromatografi).
Med hensyn til hovedformålet med dette arbejde, som var at teste virkningen af β-glucaner på immunceller, blev deres potentielle virkninger på aktiveringen af mikroglia testet, når de fire forskellige typer β-glucaner blev renset med succes. Immunofluorescens blev anvendt mod to guldstandardmarkører for proliferation og apoptose22,23.
På trods af ingen statistiske forskelle i tumorspredningshastigheder var P. ostreatus (A) og H. erinaceus (C) i stand til at droppe Ki67-ekspression med op til 50%. Den manglende signifikans skyldes sandsynligvis den høje varians i undersøgelsen vedrørende G. lucidum. Desuden er induktionen af apoptose i kræftceller en ret interessant terapeutisk tilgang, og P. djamor (B) og H. erinaceus (C) viste en signifikant induktion af cCasp3-niveauer, hvilket tyder på aktivering af celledødsprogrammet. Alle disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viste den antitumorale virkning af disse svampe i andre typer tumorer24,25. Eksperimenterne blev udført i to eksemplarer, opretholdt de samme betingelser og ledet af de samme efterforskere. Softwarebaseret analyse af resultaterne fra immunfluorescensundersøgelserne understøtter en upartisk tilgang og forbedrer denne undersøgelses potentielle rækkevidde.
Generelt har disse undersøgelser en hovedudfordring med hensyn til brugen af β-glucaner, som er renheden af forbindelserne. Det er obligatorisk at forfølge de højeste standarder for at bekræfte, at de observerede virkninger efter deres anvendelse i immunologiske undersøgelser udelukkende fremkaldes af kulhydraterne og ikke skyldes proteiner eller andre strukturer, der kan forblive knyttet til dem, hvis rensningen ikke udføres tilstrækkeligt. Et ekstra skridt, der kan overvejes i fremtidige undersøgelser, er brugen af kromatografiteknikker (f.eks. ionbytning eller størrelsesudelukkelse).
Den overordnede konklusion efter undersøgelserne placerer H. erinaceus som topkandidat som en potentiel immunterapeutisk mulighed til behandling af glioblastom på grund af dets evne til at droppe tumorproliferation (~ 50%) og fremkalde stærk aktivering af celledødsprogrammet i glioblastomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende interesser at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Vasiliki Economopoulos for hendes interne script til måling af fuluorescenssignalet i ImageJ. Vi vil også gerne takke CITIUS (universitetet i Sevilla) og alt deres personale for deres støtte under demonstrationen. Dette arbejde blev støttet af den spanske FEDER I + D + i-USE, US-1264152 fra universitetet i Sevilla, og Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
