Summary
In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um den Transfer von Versuchssettings und Analyseschablonen zwischen zwei Durchflusszytometern in zwei Laboratorien zum Nachweis von Lymphozyten bei mit Japanischer Enzephalitis geimpften Kindern zu erleichtern. Die Standardisierungsmethode für die Durchflusszytometer-Experimente wird es ermöglichen, Forschungsprojekte in mehreren Zentren effektiv durchzuführen.
Abstract
Immer mehr Labore müssen Daten von mehreren Durchflusszytometern sammeln, insbesondere für Forschungsprojekte, die in mehreren Zentren durchgeführt werden. Zu den Herausforderungen bei der Verwendung von zwei Durchflusszytometern in verschiedenen Labors gehören das Fehlen standardisierter Materialien, Software-Kompatibilitätsprobleme, Inkonsistenzen bei der Geräteeinrichtung und die Verwendung unterschiedlicher Konfigurationen für verschiedene Durchflusszytometer. Um ein standardisiertes Durchflusszytometrie-Experiment zu etablieren, um die Konsistenz und Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse über mehrere Zentren hinweg zu erreichen, wurde eine schnelle und praktikable Standardisierungsmethode etabliert, um Parameter über verschiedene Durchflusszytometer hinweg zu übertragen.
Die in dieser Studie entwickelten Methoden ermöglichten den Transfer von Versuchssettings und Analyseschablonen zwischen zwei Durchflusszytometern in verschiedenen Laboratorien zum Nachweis von Lymphozyten bei Kindern, die mit Japanischer Enzephalitis (JE) geimpft wurden. Eine konsistente Fluoreszenzintensität wurde zwischen den beiden Zytometern unter Verwendung von Fluoreszenz-Standardkügelchen erhalten, um die Zytometereinstellungen festzulegen. Vergleichbare Ergebnisse wurden in zwei Laboratorien mit unterschiedlichen Instrumententypen erzielt. Mit dieser Methode können wir die Analyse zur Bewertung der Immunfunktion von JE-geimpften Kindern in verschiedenen Labors mit unterschiedlichen Instrumenten standardisieren, die Unterschiede in den Daten und Ergebnissen zwischen Durchflusszytometern in mehreren Zentren verringern und einen praktikablen Ansatz für die gegenseitige Akkreditierung von Laborergebnissen bieten. Die Standardisierungsmethode von Durchflusszytometer-Experimenten wird die effektive Durchführung von Forschungsprojekten über mehrere Zentren hinweg sicherstellen.
Introduction
Die Standardisierung der Durchflusszytometrie ist nützlich für die Vergleichbarkeit von Ergebnissen, die von verschiedenen Zytometern in verschiedenen Labors und Studienzentren erhalten wurden, und fördert die gegenseitige Anerkennung von Ergebnissen, um die Arbeitseffizienz zu verbessern. Immer mehr Szenarien erfordern eine Standardisierung. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist die Standardisierung der Durchflusszytometrie wichtig, da ein entwickelter und validierter Assay den gesamten Arzneimittelentwicklungsprozess von der präklinischen bis zur klinischen Analyse unterstützt. Durchflusszytometrische Methoden werden häufig zwischen der pharmazeutischen Industrie und kooperierenden Laboratorien transferiert1. Darüber hinaus ist es wichtig, vergleichbare Daten aus multizentrischen klinischen Studien zu erhalten. So wurde beispielsweise im Rahmen des Multizentrischen Klinischen Forschungsprojekts Systemische Autoimmunerkrankungen ein Standardisierungs-Workflow entwickelt, um vergleichbare Daten aus der multizentrischen Durchflusszytometrie2 zu erhalten.
Die Standardisierung von Durchflusszytometrie-Methoden ist eine Herausforderung. Die Herausforderungen, mit denen die Labore konfrontiert sind, werden auf das Fehlen standardisierter Materialien, Software-Kompatibilitätsprobleme, Inkonsistenzen bei der Geräteeinrichtung und die Verwendung unterschiedlicher Konfigurationen zwischen verschiedenen Durchflusszytometern und divergierenden Gating-Strategien zwischen den Zentren zurückgeführt 3,4. Daher ist es wichtig, eine Lückenanalyse zwischen den Laboren durchzuführen. Der Probenzugang, die Qualitätssysteme, die Qualifikation des Personals und die Gerätekonfiguration müssen überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Anforderungen erfüllt werden.
Gegenwärtig haben Kinder, die mit dem Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis (JE) geimpft wurden, eine signifikant reduzierte Inzidenz von JE5. Die Überwachung peripherer Blutimmunzellen kann helfen, die Veränderungen der zellvermittelten adaptiven Immunität nach der Impfung und die Korrelation zwischen den Veränderungen in peripheren Blutlymphozyten-Untergruppen und den Auswirkungen der Impfung zu verstehen. Aufgrund der begrenzten Stabilität von Vollblutproben werden die Evaluierungen der Wirksamkeit des Impfstoffs häufig in mehreren Zentren durchgeführt. Für diese Analyse definierten wir naive CD8+- oder CD4+-T-Zellen als CD27+ CD45RA+, zentrale Gedächtnis-T-Zellen (TCM) als CD27+ CD45RA-, Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (TEM) als CD27-CD45RA- und terminal-differenzierte Effektorgedächtnis-T-Zellen (TEMRA) als CD27-CD45RA+. CD19+ B-Zellen können in Populationen unterteilt werden, die CD27 gegenüber IgD 6,7 exprimieren, naive B-Zellen exprimieren CD27n-Gedächtnis-B-Zellen (mBCs) können basierend auf der Expression von IgD6 identifiziert werden, und regulatorische T-Zellen (Tregs) können als CD4+CD25++CD127niedrig 8 identifiziert werden. Um ein standardisiertes Durchflusszytometrie-Experiment zu etablieren, um die Konsistenz und Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse in mehreren Zentren zu erreichen, wurde eine schnelle und praktikable Standardisierungsmethode etabliert, um die Übertragung von Protokollen zwischen verschiedenen Durchflusszytometern für den Nachweis von Lymphozyten im Vollblut von JE-geimpften Kindern zu erleichtern. Sechs gesunde Kinder (2 Jahre alt) wurden aus dem Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Nach einer Grund- und Auffrischungsimpfung mit einem attenuierten JE SA14-14-2-Lebendimpfstoff vor weniger als 6 Monaten wurden periphere Blutproben von den Freiwilligen entnommen. Es wurden hochgradig vergleichbare Daten von verschiedenen Instrumenten nach standardisierten Verfahren gewonnen, was für multizentrische Assessments hilfreich ist.
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Protocol
Die Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, genehmigt (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Auf die Einverständniserklärung der Probanden wurde verzichtet, da in dieser Studie nur Restproben nach klinischen Tests verwendet wurden. An dieser Studie sind zwei Labore beteiligt. Im Transferlabor wurde die standardisierte Methode mit einem Durchflusszytometer entwickelt. Das Zytometer in diesem Labor wird im Folgenden als Zytometer A bezeichnet. Das Prüfverfahrenslabor ist das Labor, das Verfahren unter Verwendung eines anderen Durchflusszytometers erhält, und das Zytometer in diesem Labor wird im Folgenden als Zytometer B bezeichnet.
1. Periphere Blutprobenentnahme und Zellaufbereitung
- Entnahme peripherer Blutproben (2 ml) von JE-geimpften Kindern und ungeimpften Kindern in EDTA-K 2-Antikoagulationsröhrchen durch Standardvenenpunktion.
- Mischen Sie die Vollblutprobe, indem Sie die Röhrchen 10x auf den Kopf stellen. Geben Sie 100 μl Vollblut in ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen. Machen Sie jede Probe in doppelter Form.
- Geben Sie 10 μl brillanten Fleckenpuffer (BV-Puffer) in ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen. Geben Sie 5 μl jedes Antikörpers (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; Verdünnungsfaktor: 1:20) und 20 μl Antikörper (CD25, CD45RA; Verdünnungsfaktor: 1:5) in den BV-Puffer. Wirbeln Sie sanft.
ANMERKUNG: Die Volumina und Informationen der Antikörperreagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt. - Geben Sie den Antikörpercocktail in das Röhrchen mit der Vollblutprobe. Vorsichtig wirbeln und bei Raumtemperatur 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.
- Verdünnen Sie die 10-fache Lyselösung 1:10 mit destilliertem Wasser, um 1-fache Lyselösung herzustellen. Lysieren Sie die Blutproben durch Zugabe von 2 ml 1x Lyselösung. Vorsichtig vorwirbeln und 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Bei 300 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
- Das Pellet wird in 2 ml 1x PBS resuspendiert, bei 300 × g 5 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 0,5 ml 1x PBS und mischen Sie es gründlich. Bei 2 °C bis 8 °C lagern. Senden Sie die Proben zur durchflusszytometrischen Analyse an die beiden Labore.
ANMERKUNG: Die Negativkontrollprobe und die einfach gefärbte Zellkontrolle müssen gleichzeitig verarbeitet werden.
2. Vorbereitung von Kompensationsperlen und Einzelfleckenkontrolle
- Etikett V500-Anti-CD45 einfach gefärbt, APC-H7-Anti-CD3 einfach gefärbt, FITC-Anti-CD4 einfach gefärbt, R718-Anti-CD8 einfach gefärbt, BV605-Anti-CD27 einfach gefärbt, APC-Anti-CD45RA einfach gefärbt, PE-Anti-CD25 einfach gefärbt, BV421-Anti-CD127 einfach gefärbt, BB700-Anti-CD19 einfach gefärbt und PE-CY7-Anti-IgD einfach gefärbt.
- Geben Sie 100 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco, der 1 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, in ein 5-ml-Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden.
- Fügen Sie 50 μl der negativen Kügelchen und 50 μl der Anti-Maus-Ig-κ-Kügelchen zu jeder Röhre und jedem Wirbel hinzu.
- Geben Sie 2 μl jedes markierten Antikörpers (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) in ein einfach gefärbtes Röhrchen. Die Mischung vorsichtig schwenken und 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C) inkubieren.
- Resuspendieren Sie die Kügelchen in 2 ml 1x PBS, zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min und dekantieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Kügelchen in 0,5 ml 1x PBS und mischen Sie sie gründlich. Bei 2 °C bis 8 °C lagern.
3. Verwendung identischer Konfigurationsnamen auf den verschiedenen Zytometern in zwei Labors
- Erstellen Sie eine neue Konfiguration in der Software des Zytometers A. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zytometer und wählen Sie Konfigurationen anzeigen , um das Konfigurationsfenster anzuzeigen.
- Klicken Sie in der Konfigurationsliste mit der rechten Maustaste auf den Basiskonfigurationsordner, wählen Sie Neuer Ordner aus, und benennen Sie ihn um.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Basiskonfiguration und wählen Sie Kopieren.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den neuen Ordner , und fügen Sie die Basiskonfiguration ein, um eine neue Konfiguration zu erstellen. Benennen Sie die neue Konfiguration in "Standardisierter Methodentransfer" um.
- Ziehen Sie den Parameternamen, z. B. FITC, aus der Liste Parameter auf den entsprechenden Detektor (530/30).
- Bearbeiten Sie zusätzliche Parameter (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605) in die neue Konfiguration.
- Befolgen Sie diese Methode, um eine neue Konfiguration für ein anderes Durchflusszytometermodell mit demselben Namen "Standardisierter Methodentransfer" zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass die Konfiguration für jeden Melder die gleichen Parameter enthält.
HINWEIS: Um die Versuchsvorlage auf den beiden verschiedenen Durchflusszytometermodellen erfolgreich zu identifizieren, stellen Sie sicher, dass der Name konsistent ist. - Verwenden Sie unter den Zytometerkonfigurationen CST-Perlen (Cytometer Setup and Tracking), um die Zytometer-Baseline zu definieren und die Leistung des Zytometers zu verfolgen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zytometer und wählen Sie CST, um den Arbeitsbereich für die Einrichtung und Verfolgung des Zytometers anzuzeigen.
- Fügen Sie drei Tropfen (150 μl) Setup-Kügelchen zu 0,5 ml 1x PBS in einem 5-ml-Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden hinzu. Legen Sie das Perlenröhrchen auf das Zytometer.
- Wählen Sie im Fenster " Setup-Steuerung " die Option " Baseline definieren" aus, und klicken Sie auf "Ausführen".
4. Standardisierung des Experiments mit dem Zytometer A im übertragenden Labor
- Führen Sie eine Leistungsprüfung mit dem Zytometer-Setup und den Tracking-Beads durch, um sicherzustellen, dass das Zytometer eine gute Leistung erbringt.
- Klicken Sie im Software-Browser-Fenster mit der rechten Maustaste auf die Zytometereinstellungen und wählen Sie Anwendungseinstellungen , um ein Arbeitsblatt zu erstellen.
- Stellen Sie unter Verwendung einer ungefärbten Probe die Photomultiplier-Röhrenspannungen (PMT) von FSC, SSC und allen Fluoreszenzparametern ein. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; Schützenpanzer: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; und BV605: 505.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Einstellungen des Zytometers für das Experiment und wählen Sie die Anwendungseinstellungen , um es zu speichern.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment " und wählen Sie das Menü "Kompensationseinrichtung ". Wählen Sie dann Create compensation controls (Kompensationssteuerelemente erstellen) aus, um Kompensationssteuerelemente automatisch hinzuzufügen.
- Zeichnen Sie Daten für alle Kompensationskontrollperlen auf.
- Klicken Sie auf das Experiment und wählen Sie Kompensationseinrichtung. Berechnen Sie dann die Entschädigung automatisch.
- Zeichnen Sie Daten für Einzelfärbe-Kontrollen auf.
- Verwenden Sie CD45RA APC, um den Kompensationswert von R718 auf 15 % APC zu ändern. Verwenden Sie CD19 BB700, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 14% BB700 zu ändern. Verwenden Sie CD8 R718, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 60 % R718 zu ändern.
- Zeichnen Sie die Daten für die CST-Perlen auf.
- Erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt mit der Zielwertvorlage für die hellen CST-Perlen.
- Zeichnen Sie mit einem FSC/SSC-Diagramm das Polygongatter für die hellen CST-Perlen. Erhalten Sie Histogrammdiagramme von 10 Fluoreszenzkanälen für die hellen CST-Perlen: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605. Erstellen Sie Intervall-Gatter in den Histogrammdiagrammen. Erstellen Sie die Statistikansicht, indem Sie den Median der Intervallgatter anzeigen.
- Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus. Sammeln Sie insgesamt 25.000 Lymphozyten.
- Erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt der Analysevorlage für die Proben.
- Verwenden Sie die folgende Beispiel-Gating-Strategie:
- Zeichnen Sie unter Verwendung eines CD45/Side-Scatter-Area (SSC-A)-Punktdiagramms das Polygon-Gate, um die intakte Lymphozytenpopulation zu identifizieren und gleichzeitig Trümmer auszuschließen.
- Zeichnen Sie mit einem CD3/CD19-Punktdiagramm ein rechteckiges Gate, um CD3+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen auszuwählen.
- Zeichnen Sie mit einem CD4/CD8-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD4+- oder CD8+-T-Zellen auszuwählen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Marker).
- Zeichnen Sie mit einem CD45RA/CD27-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD8+- oder CD4+-T-Zellen in naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) und TEMRA-Zellen (CD27-CD45RA+) zu unterteilen.
- Zeichnen Sie mit einem CD25/CD127-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD4+ T-Zellen in Treg-Zellen zu unterteilen (CD4+CD25++CD127niedrig).
- Zeichnen Sie mit einem CD27/IgD-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD19+ B-Zellen in naive B-Zellen (CD27-IgD+) und Gedächtnis-B-Zellen (CD27+IgD-) zu unterteilen.
- Speichern Sie die experimentelle Vorlage auf dem Zytometer A.
- Verwenden Sie die CD-ROM, um die experimentelle Vorlage zu exportieren.
5. Übertragung der Versuchsvorlage auf das Zytometer B im Prüfmethodenlabor
HINWEIS: Die experimentelle Vorlage enthält die Geräteeinstellungen, die Analysevorlage und die Zielwertvorlage der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI).
- Führen Sie eine Leistungsprüfung mit CST-Kügelchen durch, um sicherzustellen, dass das Zytometer eine gute Leistung erbringt.
- Importieren Sie die Versuchsvorlage und erstellen Sie mit der Vorlage ein Experiment für das Zytometer B.
- Verwenden Sie die gleiche Menge an CST-Kügelchen, um die Fluoreszenzparameterspannungen für jeden Fluoreszenzkanal an das vorherige MFI-Gerät anzupassen.
HINWEIS: Die MFI-Werte variieren innerhalb von ±5% (die MFI von hellen Perlen vor und nach der Übertragung sind in Tabelle 2 dargestellt). - Stellen Sie bei Bedarf die Spannung für FSC mit der ungefärbten Probe ein.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Einstellungen des experimentellen Zytometers und wählen Sie die Anwendungseinstellungen, um die Anwendungseinstellungen zu speichern.
- Verwenden Sie CD45RA APC, um den Kompensationswert von R718 auf 15 % APC zu ändern. Verwenden Sie CD19 BB700, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 24% BB700 zu ändern. Verwenden Sie CD8 R718, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 60 % R718 zu ändern.
- Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus. Sammeln Sie insgesamt 25.000 Lymphozyten.
6. Übereinstimmung zwischen den Versuchsergebnissen, die mit den beiden Zytometern erzielt wurden
- Beurteilen Sie die Unterschiede in den Lymphozyten-Untergruppen zwischen den Instrumenten unter Verwendung der Einweg-ANOVA (p < 0,05).
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein globales Arbeitsblatt der Zielwertvorlage für die hellen CST-Perlen. Unter Verwendung eines FSC/SSC-Diagramms wird ein Polygon-Gate gezeichnet, um die hellen CST-Perlen auszuwählen. Histogrammdiagramme von 10 Fluoreszenzkanälen wurden für die hellen CST-Beads erhalten: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605. Der Zielwert für jeden Parameter wird angezeigt, indem der Median innerhalb der Histogrammgatter in Tabelle 2 angezeigt wird. Die Screenshots von Vorlagen und Parametereinstellungen in der Software von Zytometer A und Zytometer B sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.
Abbildung 2 zeigt die Punktdiagramme einer Probe zwischen den beiden Instrumenten nach der Standardisierung des Geräts. Die Daten demonstrieren die Konsistenz zwischen verschiedenen Instrumenten mithilfe einer automatischen Analysevorlage. Die Ergebnisse von sechs Proben wurden in Tabelle 3 mit zwei verschiedenen Instrumentenmodellen verglichen. In den beiden Laboratorien wurden keine signifikanten Unterschiede in den Prozentsätzen von 15 lymphatischen Untergruppen gemessen. Diese Ergebnisse zeigen, dass nach der standardisierten Methode hochgradig vergleichbare Daten gewonnen wurden. Die Prozentsätze von 15 lymphatischen Untergruppen aus verschiedenen Instrumenten sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt.
Abbildung 1: Globale Arbeitsblattvorlage für die hellen CST-Perlen. Helle CST-Perlen sind im FSC- und SSC-Diagramm eingezäunt. Histogrammdiagramme von 10 Fluoreszenzkanälen werden für die hellen CST-Perlen dargestellt. Intervall-Gates werden erstellt, um die helle Bead-Population von CST-Beads für jeden Fluoreszenzdetektor einzubeziehen. Abkürzungen: FSC-A = Vorwärtsstreufläche; SSC-A = seitliche Streufläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich von Punktdiagrammen aus einer Probe zwischen den beiden Instrumenten. (A) CD45/SSC-A-Punktdiagramm wird verwendet, um Lymphozyten zu gaten. (B) Das CD3/CD19-Punktdiagramm wird verwendet, um CD3+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen zu steuern. (C) Das CD4/CD8-Punktdiagramm wird verwendet, um CD3+ CD8+ T- und CD3+ CD4+ T-Zellen zu identifizieren. (D) Das CD25/CD127-Punktdiagramm wird verwendet, um Treg-Zellen zu gate (CD4 + CD25 ++ CD127niedrig). (E) Das CD45RA/CD27-Punktdiagramm für CD4+ T-Zellen wird verwendet, um naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) und TEMRA (CD27-CD45RA+) zu erreichen. (F) Das CD45RA/CD27-Punktdiagramm für CD8+ T-Zellen wird verwendet, um naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) und TEMRA (CD27-CD45RA+) zu steuern. (G) Das CD27/IgD-Punktdiagramm wird verwendet, um naive B-Zellen (CD27-IgD+) und Gedächtnis-B-Zellen (CD27+ IgD-) zu steuern. Die Gating-Strategie stammt von Zhang et al.7. Abkürzungen: SSC-A = Side Scattering Area; TCM = zentrale Speicher-T-Zellen; TEM = Effektor-Gedächtnis-T-Zellen; TEMRA = terminale differentielle Effektor-Gedächtnis-T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Antikörper-Target | Fluorochrom | Klonen | Katalog-Nr. | Volumen pro Test (μl) |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
Tabelle 1: Antikörpervolumina und konjugierte Fluorophorinformationen für durchflusszytometrische Analysen. Abkürzungen: BV = leuchtendes Violett; BB = brillantes Blau; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin.
| MFI von hellen Perlen | |||
| Kanal | Zytometer A | Zytometer B | %Diff in MFI |
| FSC (Begriffsklärung | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tabelle 2: MFI von hellen Perlen vor und nach dem Transfer. Abkürzungen: MFI = mittlere Fluoreszenzintensität; BV = leuchtendes Violett; BB = brillantes Blau; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin.
| Durchschnitt der Prozentsätze | Durchschnitt der Prozentsätze | ||
| Zytometer A (n=6) | Zytometer B (n=6) | P-Wert | |
| T-Zellen | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ T-Zellen | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ naiv | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg (Begriffsklärung | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ T-Zellen | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ naiv | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B-Zellen | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| naiv B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Speicher B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tabelle 3: Bewertung der Unterschiede in den Lymphozyten-Untergruppen zwischen den Instrumenten. p > 0,05 zeigt keinen signifikanten Unterschied an. Abkürzungen: TCM = zentrale Speicher-T-Zellen; TEM = Effektor-Gedächtnis-T-Zellen; TEMRA = terminale differenzierte Effektor-Gedächtnis-T-Zellen.
Ergänzende Tabelle S1: Prozentuale Anteile der Lymphozyten-Untergruppen in sechs Proben verschiedener Instrumente. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S1: Die Screenshots von Vorlagen und Parametereinstellungen in der Software von Zytometer A und Zytometer B. (A) Die XML-Datei von Vorlagen. (B) Die Screenshots von Vorlagen. (C) Die Parametereinstellungen im Zytometer A. (D) Die Parametereinstellungen im Zytometer B. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Immunphänotypisierung von Untergruppen peripherer Blutlymphozyten kann helfen, die Veränderungen der zellvermittelten adaptiven Immunität nach der Impfung bei Kindern zu verstehen. In klinischen Anwendungen treten unerwartete Situationen auf, wie z. B. das Versäumnis, Proben rechtzeitig zu erkennen, oder der Austausch eines Durchflusszytometers; Daher sind schnell standardisierte Methoden erforderlich, die den Transfer zwischen Durchflusszytometern in verschiedenen Labors erleichtern 9,10,11. Hier beschreiben wir eine schnelle standardisierte Methode, um konsistente Ergebnisse zwischen verschiedenen Instrumenten zu gewährleisten. Die standardisierte Methode wurde verwendet, um Immunzellen im peripheren Blut von Kindern nach der Impfung zu überwachen, und in zwei Laboratorien wurden konsistente Ergebnisse erzielt. Die standardisierte Methode wurde zwischen BD Canto und LSRFortessa etabliert. Das Protokoll ist auch für FACSCelesta, FACSymphony A5 und FACSAria II geeignet. Im Vergleich zu anderen Standardisierungsmethoden 2,3 erfordert dieses Standardverfahren nicht die Verwendung von Software von Drittanbietern, um die Konsistenz der Daten zu erhalten. Es verwendet nur die Eigenschaften der Diva-Software, um ein Vorlagenmodul zu erstellen, das die Zielwertposition und die automatische Analyse enthält, um die Methode der Übertragung zwischen verschiedenen Instrumenten zu realisieren, und reduziert den Bedarf an Datenanalyse. Die Methode spart Zeit, ist einfach zu bedienen und erfordert keine Entwicklung eines automatisierten Angusswerkzeugs.
Die Standardisierung eines Durchflusszytometrieprotokolls in dieser Studie wird erreicht, indem eine experimentelle Vorlage auf einem Gerät erstellt wird, die Zytometrieeinstellungen, automatische Datenanalyse und ein Arbeitsblatt für die Zielposition enthält. Dann verwenden die anderen Geräte CST-Perlen, um die Parameterspannungen anzupassen, um den Zielwert zu erreichen. Mehrere wichtige Merkmale sollten berücksichtigt werden, um eine erfolgreiche Standardisierung über verschiedene Durchflusszytometergeräte hinweg abzuschließen. Erstens erfordert die standardisierte Methode, dass die Geräte das gleiche Softwaresystem verwenden, so dass die XML-Datei der Experimentvorlage zwischen der Software der Instrumente gemeinsam genutzt werden kann. Zweitens sollten die beiden Instrumente den gleichen Namen für die Konfiguration haben, und die Parameter sollten auch identisch benannt sein. Drittens sollten die CST-Kügelchen unter den spezifizierten Spannungsbedingungen ohne Kompensation als Zielwerte gesammelt werden. Angesichts der unterschiedlichen Laserleistungen und PMT-Empfindlichkeiten verschiedener Instrumente ist es notwendig, CST-Perlen aus derselben Chargennummer zu verwenden, um die Spannungsparameter entsprechend den Zielwerten anderer Instrumente anzupassen und sicherzustellen, dass der MFI-Wert innerhalb von ±5% liegt. Viertens sind auch die täglichen Qualitätskontrollen der Instrumente sehr wichtig. Wenn ein Gerät die Bewertung nicht besteht, muss die Durchflusszelle auf Blasen gereinigt oder einer Laserkalibrierung unterzogen werden. Um die durch die Vorbereitungsverfahren verursachten Unterschiede zu verringern, sollten die Proben bei der Durchführung solch großer multizentrischer Studien auf identische Weise vorbereitet werden, zusätzlich zu den übertragenen Einstellungen, um die Proben in verschiedenen Labors analysieren zu können. Es gibt jedoch noch Raum für eine Panel-Optimierung zur besseren Identifizierung von Speicher-B-Zellen in diesem Protokoll. Die Häufigkeit von Gedächtnis-B-Zellen ist bei 2-jährigen Kindern relativ gering und die CD27-Expression auf der Oberfläche dieser Zellen ist diffus. Dies kann Gedächtnis-B-Zellen besser identifizieren, wenn der Marker durch ein helleres Fluorescein als BV605 ersetzt wird.
Es sollten jedoch einige Einschränkungen beachtet werden. Zunächst wurden in diesem Experiment zwei Durchflusszytometer zur Standardisierung verwendet; Zusätzliche Instrumentenmodelle sollten in nachfolgende Experimente einbezogen werden. Zweitens wurde die Methode zur Färbung der Zelloberfläche verwendet, um Lymphozyten-Untergruppen zu unterscheiden und zu bestimmen, und beinhaltete nicht den Nachweis von mehr intrazellulären Zytokinen. Drittens haben wir die experimentellen Ergebnisse nicht mit und ohne den Standardisierungsprozess von zwei Durchflusszytometern verglichen.
Der Vorteil dieser standardisierten Methode besteht darin, dass verschiedene Geräte die XML-Datei der Experimentvorlage gemeinsam nutzen können, wenn die Software identisch ist. Die experimentelle Vorlage enthält die Vorlage für feste Zielwerte, und die Daten können nur nach Anpassung der PMT-Spannungen an die Zielwerte zwischen den Instrumenten abgerufen werden. Darüber hinaus enthält die experimentelle Vorlage auch eine automatische Gate-Strategieanalyse. Sobald die Daten vorliegen, wird der automatische Analysebericht erstellt. Dieses Verfahren ist einfach zu bedienen und reduziert die Unterschiede in den Ergebnissen, die durch die manuelle Analyse verursacht werden. Diese standardisierte Methode kann verwendet werden, um Veränderungen der Lymphozyten-Untergruppen im Vollblut von JE-geimpften Kindern mit verschiedenen Instrumenten laborübergreifend zu bewerten, um sicherzustellen, dass das Studienprojekt konsistent über mehrere Zentren hinweg durchgeführt wird. In dieser Studie wollen wir die Konvertibilität der standardisierten Methode durch Oberflächenfärbung testen, und ihr Erfolg wird eine Grundlage für die Praxis der späteren intrazellulären Färbung legen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
RW wurde unterstützt von der Beijing Natural Science Foundation, China (Nr. 7222059), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82002130), XZ wurde vom CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (Nr. 2019-I2M-5-026) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
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