Summary
Her beskriver vi en proteomics arbejdsgang til karakterisering af celleoverfladeproteomet af forskellige celletyper. Denne arbejdsgang omfatter celleoverfladeproteinberigelse, efterfølgende prøveforberedelse, analyse ved hjælp af en LC-MS / MS-platform og databehandling med specialiseret software.
Abstract
I løbet af det sidste årti har massespektrometribaseret proteomics muliggjort en dybdegående karakterisering af biologiske systemer på tværs af en bred vifte af applikationer. Celleoverfladeproteomet ("overfladeom") i menneskelig sygdom er af væsentlig interesse, da plasmamembranproteiner er det primære mål for de fleste klinisk godkendte lægemidler samt en nøglefunktion til diagnostisk at skelne syge celler fra sunde væv. Imidlertid har fokuseret karakterisering af membran- og overfladeproteiner i cellen været udfordrende, primært på grund af kompleksiteten af cellulære lysater, som maskerer proteiner af interesse for andre proteiner med høj forekomst. For at overvinde denne tekniske barriere og præcist definere celleoverfladeproteomet af forskellige celletyper ved hjælp af massespektrometriproteomik er det nødvendigt at berige cellelysatet for celleoverfladeproteiner inden analyse på massespektrometeret. Dette papir præsenterer en detaljeret arbejdsgang til mærkning af celleoverfladeproteiner fra kræftceller, berigelse af disse proteiner ud af cellelysatet og efterfølgende prøveforberedelse til massespektrometrianalyse.
Introduction
Proteiner tjener som de grundlæggende enheder, hvormed størstedelen af cellulære funktioner udføres. Karakterisering af strukturen og funktionen af relevante proteiner er et vigtigt skridt til at forstå biologiske processer. I løbet af det sidste årti har fremskridt inden for massespektrometriteknologi, analysesoftware og databaser muliggjort nøjagtig detektion og måling af proteiner på en proteom-bred skala1. Massespektrometribaseret proteomics kan anvendes i en bred vifte af applikationer, fra grundlæggende videnskabelig analyse af biokemiske veje til identifikation af nye lægemiddelmål i en translationel indstilling til diagnose og overvågning af sygdomme i klinikken2. Ved screening for nye lægemiddelmål er karakterisering af celleoverfladeproteomet særlig vigtig, idet over 65% af de aktuelt godkendte humane lægemidler er rettet mod celleoverfladeproteiner3. Området for kræftimmunterapi er også helt afhængig af kræftspecifikke celleoverfladeantigener til at målrette og specifikt eliminere tumorceller4. Massespektrometribaseret proteomics kan således tjene som et lovende værktøj til at identificere nye celleoverfladeproteiner mod terapeutiske interventioner.
Der er dog flere begrænsninger ved anvendelse af konventionelle proteomiske metoder til at undersøge tumorceller for nye celleoverfladeproteinmål. En primær bekymring er, at overfladeproteiner udgør en meget lille brøkdel af de samlede proteinmolekyler i en celle. Derfor maskeres fragmenter af disse proteiner af en høj overflod af intracellulære proteiner, når der udføres massespektrometrianalyse af helcellelysatet5. Denne begrænsning gør det udfordrende at karakterisere celleoverfladeproteomet nøjagtigt med en traditionel proteomics-arbejdsgang. For at løse denne udfordring er det nødvendigt at udvikle måder at berige celleoverfladeproteiner ud af helcellelysatet forud for analyse på massespektrometeret. En sådan metode involverer oxidation og biotinmærkning af glycosylerede celleoverfladeproteiner i de intakte celler og efterfølgende berigelse af disse biotinylerede proteiner fra lysatet med en neutravidin-pulldown, en proces, der er blevet kaldt "celleoverfladeindfangning"6. Da ~ 85% af pattedyrs celleoverfladeproteiner menes at være glykosyleret7, tjener dette som en effektiv metode til at berige celleoverfladeproteomet ud af hele cellelysatet. Dette papir beskriver en komplet arbejdsgang, der begynder med dyrkede celler, af celleoverfladebiotinmærkning og efterfølgende prøveforberedelse til massespektrometrianalyse (figur 1). Over flere replikater giver denne metode robust dækning af celleoverfladeproteomet for en bestemt prøve. Brug af denne metode til at karakterisere celleoverfladeproteomet i både tumor og sunde celler kan lette opdagelsen af nye celleoverfladeantigener til at identificere potentielle immunterapeutiske mål8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: AMO1 plasmacytomceller blev anvendt til dette celleoverfladeproteomforsøg. Den samme protokol kunne også bruges til andre celletyper, herunder en bred vifte af suspensions- og klæbende cellelinjer9 samt forskellige typer primære prøver10. Imidlertid skal cellenumre (udgangsmateriale til eksperimentet) typisk optimeres til ækvivalent proteomdækning. For detaljer relateret til materialer og udstyr, se Tabel over materialer. For nærmere oplysninger om buffere og reagensopløsninger og deres sammensætning, se tabel 1.
1. Celleoverflademærkning med biotin
- De dyrkede celler og pellets tælles ca. 3,5 × 107 levende celler ved centrifugering (5 min ved 500 × g, 24 °C).
BEMÆRK: AMO1-plasmacytomccellerne blev passeret med friske medier hver 3. dag før høst. - Supernatanten suges op, og pelletpen opslæmmes igen ved at tilsætte 1 ml koldt (4 °C) Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS) (intet calcium, intet magnesium) og forsigtigt pipettere op og ned.
- Pellet cellerne igen (som i trin 1.1) og gentag vasketrinnet (trin 1.2) endnu en gang (to vaske i alt).
- Efter den anden vask pelletes cellerne (som i trin 1.1) og resuspenderes i 990 μL kold D-PBS ved forsigtigt pipettering.
- Der fremstilles en stamopløsning af 160 mM natriummetaperiodat (NaIO4) på forhånd. Opdeles i 50 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. I trin 1.4 tilsættes 10 μL 160 mM natriummetaperiodatopløsning til cellesuspensionen, blandes grundigt, og der inkuberes på en ende-til-ende-rotor i 20 minutter ved 4 °C.
- Når inkubationen er afsluttet, pelletes cellerne (som i trin 1.1), supernatanten dekanteres, og der resuspenderes i 1 ml kold D-PBS. Gentag dette vasketrin to gange (tre vaske i alt). Efter den tredje vask resuspenderes cellerne i 989 μL D-PBS.
- Forbered en stamopløsning af 100 mM biocytinhydrazid på forhånd. Opdeles i 50 μL delprøver og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. I trin 1.6 tilsættes 1 μL anilin og 10 μL 100 mM biocytinhydrazid til cellesuspensionen, blandes grundigt og inkuberes på en ende-til-ende-rotor i 60 minutter ved 4 °C.
- Når inkubationen er afsluttet, pelletes cellerne (som i trin 1.1), supernatanten dekanteres, og der resuspenderes i 1 ml kold D-PBS. Gentag dette vasketrin to gange (tre vaske i alt).
- Efter den tredje vask suges supernatanten forsigtigt til med en pipet, og cellepillen snapfryses ved at anbringe røret i væske N2. Den frosne pellet anbringes ved -80 °C, indtil den er klar til lysering og nedtrækning.
2. Cellelyse og biotin pulldown
- Optø den frosne cellepille på is.
- Tilsæt 500 μL 2x lysisbuffer til pelleten, bland grundigt og hvirvel i 30 s.
BEMÆRK: Kraftig pipettering og hvirvelstrøm kan være nødvendig for at lyse pillen fuldt ud. Nogle uopløselige rester (dvs. DNA) er acceptabelt, da det fjernes i det efterfølgende sonikeringstrin. - Sonikere cellelysatet på is (tre udbrud, 20 s hver, 60% arbejdscyklus).
- Centrifuger lysatet for at pelletere eventuelt resterende affald (10 min ved 17.200 × g ved 4 °C).
- Mens lysatet centrifugeres, tilsættes 100 μL neutravidin agaroseharpiksperler til en filtreringskolonne. Fastgør søjlen til en vakuummanifold, påfør et forsigtigt vakuum, og vask perlerne ved at strømme 3 ml vaskebuffer 1 over dem.
- Fjern filtreringskolonnen fra vakuummanifolden, dæk bunden, og tilsæt det klarede cellelysat til søjlen med perlerne. Hætten på toppen af søjlen og inkuber lysatet med perlerne på en ende-til-ende-rotor i 120 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Når du lukker toppen af søjlen, skal du holde bundhætten på plads, ellers kan den løsne sig, og cellelysatet kan lække under inkubation. - Vask buffere 1, 2 og 3 (ca. 5 ml af hver vaskebuffer pr. prøve, jf. tabel 1), og anbring dem i et 42 °C vandbad
- Når lysatet er færdig med inkubationen, placeres filtreringskolonnen tilbage på vakuummanifolden, påføres et forsigtigt vakuum og vaskes perlerne ved at strømme 5 ml vaskebuffer 1 over dem.
BEMÆRK: Mere end 5 ml vaskebuffere kan bruges til vask; Ekstra vask kan reducere baggrund, ikke-specifik binding på perlerne. - Gentag vasketrinnet med 5 ml vaskebuffer 2.
- Gentag vasketrinnet med 5 ml vaskebuffer 3.
- Når den endelige vaskebuffer er strømmet helt gennem perlerne, fjernes søjlen fra manifolden. Tilsæt 100 μL "Lyse" opløsning til perlerne og overfør dem til et 1,7 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør med en pipet. Drej kortvarigt røret for at sætte perlerne, og fjern 50 μL af opløsningen uden at forstyrre de bundfældede perler.
BEMÆRK: Reagenserne i dette trin og alle efterfølgende trin bruger et kommercielt tilgængeligt proteomics-prøveforberedelsessæt. Sættet giver en optimeret, forenklet arbejdsgang til prøveforberedelse. Disse trin kan dog også udføres uafhængigt af sættet ved hjælp af en traditionel proteomics-arbejdsgang som beskrevet i Verma et al.9. Hvis perlerne forbliver fast på siden eller bunden af søjlen, skal du lade perlerne, der er overført til røret, sætte sig, og bruge ekstra "Lyse" -opløsning i røret til at overføre de resterende perler. - Anbring røret på en varmeblok/ryster ved 65 °C, og ryst ved 1.000 o/min i 10 minutter.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for reduktion og alkylering af cysteinrester før fordøjelsen.
3. Protein fordøjelse
- Resuspender det tørrede trypsin ("Digest" tube i sættet, opbevaret ved -20 °C) ved at tilsætte 210 μL af "Resuspend" opløsningen. Pipetten opløsningen op og ned flere gange for at sikre, at alt det tørrede trypsin resuspenderes.
- Når inkubationen er afsluttet, tilsættes 50 μL af den resuspenderede trypsinopløsning til perlerne. Der inkuberes tuben ved 37 °C, omrystes ved 500 o/min i mindst 90 minutter for at fordøje proteinet.
- Når fordøjelsen er afsluttet, overføres opløsningen indeholdende perlerne til en centrifugeringskolonne, og søjlen indsættes i et 1,7 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør. Drej røret (500 × g i 5 minutter ved stuetemperatur [RT]) for at adskille den fordøjede peptidopløsning fra perlerne.
BEMÆRK: På dette stadium kan PNGase-behandling udføres på perlerne, når de er adskilt fra peptidopløsningen, for at eluere biotinylerede peptidfragmenter fra streptavidinperlerne. Denne peptidprøve kan derefter føres videre gennem resten af arbejdsgangen som en separat, sekundær peptidprøve, der kan analyseres og sammenlignes med den primære prøve fra per-bead trypsinisering. PNGase-tilgangen vil sandsynligvis give komplementære data til trypsinisering på perler i betragtning af den yderligere specificitet for fangede N-glykosylerede asparaginer baseret på MS-detekterbar sidekædemodifikation12. Ulempen ved denne sekventielle elueringsmetode er imidlertid kravet om to gange massespektrometerinstrumenttiden pr. prøveanalyse. - Tilsæt 100 μL af "Stop" -opløsningen for at stoppe fordøjelsesreaktionen og syrne peptidopløsningen.
4. Afsaltning af peptid
- Brug en røradapter til at placere en afsaltningssøjle i et 1,7 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør. Tilsæt hele den syrnede peptidopløsning til søjlen. Drej kolonnen (3.800 × g i 3 min), så opløsningen flyder gennem søjlen. Peptiderne er nu bundet til søjlen; Kassér gennemstrømningen.
- Der tilsættes 200 μL "Vask 1"-opløsning til kolonnen og centrifugeres (3.800 × g i 3 minutter, RT). Kassér gennemstrømningen.
- Der tilsættes 200 μL "Vask 2"-opløsning til kolonnen og centrifugeres (3.800 × g i 3 min, RT). Kassér gennemstrømningen.
- Overfør søjlen til et nyt, mærket 1,7 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør. Der tilsættes 100 μL "elueringsopløsning" til kolonnen og centrifugeres (3.800 × g i 3 min, RT). Der tilsættes yderligere 100 μL "Elute"-opløsning til kolonnen og centrifugeres (3.800 × g i 3 minutter, RT). Peptiderne elueres nu fra søjlen ind i røret.
- Anbring peptidopløsningen i en vakuumcentrifuge og lad den tørre natten over. De udtørrede peptider anbringes ved -80 °C, indtil de er klar til kvantificering, og der analyseres på massespektrometeret.
5. Peptidresuspension og kvantificering
- De tørrede dunpeptider resuspenderes i 20 μL opløsningsmiddel A (0,1% myresyre, 2% acetonitril).
- De resuspenderede peptider centrifugeres (17.200 × g i 10 min) for at pelletere uopløseligt affald.
- Forbered peptidstandarder til det kolorimetriske peptidkvantificeringsassay.
- 5 μL 1.000 mg/ml peptidstamopløsning anbringes i en brønd i en plade med 96 huller.
- Udfør en syv-trins seriel fortynding i pladen med deioniseret (DI) vand som følger med 5 μL af hver standard pr. hul: 1.000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml og 15,625 mg/ml. Anbring 5 μL DI-vand i en ottende brønd til emnet.
- Anbring 4 μL DI-vand i tre separate brønde på 96-brøndpladen. Der tilsættes 1 μL af den resuspenderede peptidopløsning til hvert hul til et samlet volumen på 5 μL.
BEMÆRK: Når peptidopløsningen pipetteres til kvantificering, pipetteres forsigtigt fra toppen af opløsningen for at forhindre forstyrrelse af bundfældte snavs. - Beregn, hvor meget arbejdsreagens der er behov for (45 μL kræves pr. Brønd). Forbered det krævede volumen af det kolorimetriske assay, der arbejder reagens; Vortex arbejdsreagenset for at sikre korrekt blanding af komponenterne.
- Der tilsættes 45 μL af arbejdsreagenset til hver standard- og prøvebrønd.
BEMÆRK: Lav standarderne i to eksemplarer, og brug en flerkanalpipet for at sikre en minimal forskel i tidspunktet for, hvornår reagenset tilsættes til hullerne. - Pladen dækkes med aluminiumsfolie og inkuberes ved 37 °C i 15 min.
- Analysér pladen på en automatiseret pladelæser. De absorbansværdier, der er registreret for standardprøverne, anvendes til at generere en lineær standardkurve. Bestem ligningen af standardkurven ogR2-værdien . HvisR2-værdien er rimelig (≥0,95), anvendes standardkurven til bestemmelse af koncentrationen af resuspenderede peptider, idet der tages højde for den femdobbelte fortynding i den kolorimetriske analyseplade.
6. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse af de fordøjede peptider
- Peptidprøvernes koncentration justeres til 0,2 μg/μL ved tilsætning af opløsningsmiddel A, og 10 μL overføres til et 0,6 ml lavproteinbindende rør.
- Anbring røret i LC-autosampleren.
- Indstil LC- og MS/MS-parametrene i henhold til figur 2 og figur 3.
- 5 μL (1 μg) af peptidprøven injiceres i LC-MS/MS-opsætningen til analyse.
BEMÆRK: De LC-MS/MS-indstillinger, der vises her, er kun repræsentative for illustrationerne. Afhængigt af tilgængeligheden af LC- og MS-instrumenter kan brugerne ændre indstillingerne for LC-gradienten og MS/MS-parametrene for at opnå dyb proteomdækning. Til dette papir blev MS-dataanalysen udført ved hjælp af MaxQuant https://www.maxquant.org/, sekundær dataanalyse blev udført ved hjælp af Perseus https://maxquant.net/perseus/ og vejanalyse ved hjælp af https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til dette eksperiment karakteriserede vi celleoverfladeproteomet i en tumorcellelinje ved at mærke N-glycosylerede membranproteiner fra intakte celler med biotin og berige disse mærkede proteiner fra hele cellelysatet med en neutravidin-pulldown (figur 1). Desuden udførte vi proteomanalyse ved hjælp af LC-MS / MS for at karakterisere berigede celleoverfladeproteiner. I modsætning til helcelleproteomanalyse var målet her kun at karakterisere celleoverfladeproteiner. Derfor startede vi med et prøveinput på 3,5 × 107 AMO-1 plasmacytomceller. Vi opnåede en endelig peptidkoncentration på ~ 630 ng / μL baseret på det kolorimetriske peptidkvantificeringsassay, og det samlede udbytte var ~ 12,6 μg peptider (i 20 μL) (figur 2A). Derefter injicerede vi 1 μg peptidprøve i LC-MS/MS-systemet og gentog injektionen tre gange for tekniske replikater. De anvendte LC- og MS-parametre blev optimeret baseret på tidligere eksperimenter (figur 2C og figur 3A). Vi brugte en lang LC-gradient på 4 timer for at sikre maksimal dækning.
LC-MS/MS-data blev analyseret ved hjælp af MaxQuant; Vi var i stand til at identificere 2.221 proteiner med mindst et unikt peptid og 1.764 proteiner med mindst to unikke peptider på tværs af alle de tre replikater. I alt blev der identificeret 12.307 unikke peptider. Vi bestemte celleoverfladeproteinberigelse i prøven ved hjælp af et Python-script (det nøjagtige script, vi brugte, findes i supplerende figur S1), der sammenligner resultaterne opnået fra MaxQuant med flere etablerede datasæt af celleoverfladeproteiner. Disse datasæt omfatter det tidligere rapporterede "in silico surfaceome"3 og et datasæt etableret ud fra proteiner annoteret som membranlokaliseret i UniProt13 (datasæt er tilgængelige i supplerende tabel S1). Denne analyse gav 601 overfladeproteiner i vores prøve (ca. 27% af alle de identificerede proteiner) (figur 4A). Genontologisk annotation (http://geneontology.org/) blev udført, hvilket indikerede, at ca. 30% af proteinerne skulle være kanonisk lokaliseret til plasmamembranen. Reaktomvejsanalyse (https://reactome.org/) indikerede også relativ berigelse af membranproteinerne involveret i transmembrantransport og celleoverfladeinteraktioner (figur 5 og supplerende tabel S2).
Figur 1: Workflow til celleoverflademærkning og efterfølgende prøveforberedelse til massespektrometrianalyse. For det første mærkes proteiner på overfladen af den ønskede cellulære prøve med biotin. Disse celler lyseres derefter efterfulgt af inkubation med neutravidinperler, der binder biotinmærkede proteiner. Perlerne vaskes derefter gentagne gange for at fjerne intracellulære proteiner og andre forurenende stoffer. Proteinprøven gennemgår derefter en fordøjelse på perlen med tilsætning af trypsin. Den resulterende prøve af peptidfragmenter gennemgår derefter afsaltning for at fjerne forurenende stoffer fra vaske- og fordøjelsestrinnene. Den endelige peptidprøve tørres derefter ned og er klar til at gennemgå massespektrometrianalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Standardkurve for kolorimetrisk peptidkvantificering og LC-gradient . A) Ottepunktsstandardkurve genereret ved kolorimetrisk peptidkvantificeringsassay, der anvendes til bestemmelse af peptidkoncentration i forarbejdede prøver. B) En illustration af det LC-MS/MS-system, der anvendes til behandling af prøver. C) Væskekromatografigradient og strømningshastighed, der anvendes til injektion af prøver på massespektrometeret. Forkortelser: LC-MS/MS = væskekromatografi-tandem massespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Massespektrometriparametre og repræsentativt kromatogram . (A) Parametre anvendt til dette eksperiment ved hjælp af et Orbitrap-massespektrometer. B) Repræsentativt kromatogram genereret ved massespektrometrianalyse efter "celleoverfladeindfangningsprotokol" for en 4 timers gradient. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af celleoverfladeproteinberigelse og sammenligning af tekniske replikater. Disse datasæt omfatter det tidligere rapporterede "in silico surfaceome"3 og et datasæt etableret ud fra proteiner annoteret som membranlokaliseret i UniProt13. (A) Antallet af proteiner og peptider identificeret med en anden cut-off efter fjernelse af forurenende stoffer, omvendte proteiner og en q-værdi > 0,05. (B) Plottet repræsenterer fordelingen af det identificerede protein og Andromeda score14. (C) Spredningsdiagrammet illustrerer sammenhængen mellem stikprøve og stikprøve. Spydmandens rangkorrelation måler styrken og retningen af sammenhængen mellem to rangerede variabler. D) Boksplot, der viser kørselsvarianten. E) Stikprøvefordelingsplot, der repræsenterer replikaters datakvalitet. Forkortelse: LFQ = etiketfri kvantificering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Analyse af forløb. Pathway analyse blev udført ved hjælp af Reactome version 8222. En illustrativ skildring af celleoverfladeinteraktioner ved vaskulærvæggen, der udviser berigelsen af celleoverfladeproteom for nøgleinteraktioner involveret i blodplade- og leukocytinteraktionen med endotelet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagensnavn | Sammensætning | Oplagring | |||||
| 100 mM biocytinhydrazid | pulverform biocytinhydrazid opløst i DMSO | Opdeles i 50 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. | |||||
| 160 mM natriummetaperiodat (NaIO4) | fast NaIO4 opløst i DI-vand | Opdeles i 50 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. | |||||
| 2x RIPA lysis buffer | 2x RIPA lysisbuffer, 1,25 mM EDTA, proteasehæmmer til engangsbrug | Forbered frisk hver gang, før du bruger 10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| Peptidkolorimetrisk assay Arbejdsreagens | 50% Reagens A, 48% Reagens B, 2% Reagens C | Forbered frisk hver gang før brug. Opbevar komponenterne ved 4 °C. | |||||
| Opløsningsmiddel A | 0,1% myresyre, 2% acetonitril | Kan forberede sig på forhånd og opbevares ved stuetemperatur | |||||
| Vaskebuffer 1 | 1x RIPA lysis buffer, 1 mM EDTA | Kan forberede stor batch på forhånd og opbevares ved stuetemperatur | |||||
| Vaskebuffer 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Kan forberede stor batch på forhånd og opbevares ved stuetemperatur | |||||
| Vaskebuffer 3 | 2 M urinstof, 50 mM ammoniumbicarbonat | Forbered frisk hver gang, da urinstof nedbrydes hurtigt over tid. | |||||
Tabel 1: Buffere og reagensopløsninger, der anvendes i denne protokol.
Supplerende figur S1: Python-script til sammenligning af resultater opnået fra MaxQuant med flere etablerede datasæt af celleoverfladeproteiner. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Datasæt af celleoverfladeproteiner. Disse datasæt omfatter det tidligere rapporterede "in silico surfaceome"3 og et datasæt etableret ud fra proteiner annoteret som membranlokaliseret i UniProt13. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S2: De 10 mest relevante veje (sorteret efter p-værdi ) præsenteres her. Forkortelser: FDR = falsk opdagelsesrate; SLC = fast bærer; TCR = T-cellereceptor. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Massespektrometribaseret proteomics er et kraftfuldt værktøj, der har muliggjort upartisk karakterisering af tusindvis af ukendte proteiner i en tidligere umulig skala. Denne tilgang giver os mulighed for at identificere og kvantificere proteinerne samt indsamle en række indsigter for cellernes og vævets strukturelle og signalkapacitet ved at karakterisere de forskellige proteiner, der er til stede i en bestemt prøve. Ved at bevæge os ud over global proteinprofilering i en prøve giver massespektrometri os mulighed for at karakterisere forskellige posttranslationelle modifikationer (PTM'er) på disse proteiner, hvilket giver et endnu dybere indblik i stadierne af signalveje og proteindynamik, der ikke er tilgængelige, når vi analyserer på DNA- eller RNA-niveau1. Mod udviklingen af nye kræftbehandlinger giver massespektrometribaseret proteomik os mulighed for at sammenligne proteinprofilen for maligne tumorceller versus sunde væv for at identificere potentielle lægemiddelbare mål.
Det hurtigt voksende felt inden for kræftimmunterapi er afhængig af antigener udtrykt på overfladen af maligne celler for at identificere og selektivt ødelægge tumorer. Da udviklingen af nye kræftimmunterapier er begrænset af manglen på unikke kræftspecifikke antigener, som er fraværende i sundt væv, er det afgørende at identificere flere nye antigener, der er specifikke for tumorceller15. Tumorspecifikke antigener behøver ikke at være hele proteiner, der er unikke for tumorcellen, men kan også være specifikke proteinkonformationer eller PTM'er fraværende i sunde væv16,17. Proteomisk analyse af celleoverfladeproteiner på både tumor og raske celler kan give nye kræftspecifikke antigenmål. Celleoverfladeproteomics kræver berigelse af overfladeproteiner fra helcellelysatet forud for massespektrometrianalyse for at reducere prøvens kompleksitet og undgå ionundertrykkelse af de ønskede membranproteiner (ofte lav overflod) af stærkt udtrykte intracellulære proteiner18. Mens celleoverfladeoptagelsesstrategien, der anvendes her, er en af de mest almindeligt anvendte berigelsesmetoder til celleoverfladeproteomik, er der andre metoder til celleoverfladeproteinberigelse, der er integreret med en massespektrometri-arbejdsgang, herunder selektiv ultracentrifugering af cellulære membraner, NHS-biotinmærkning af overfladelysiner og enzymmedieret biotinylering af celleoverfladeproteiner19, 20. Head-to-head sammenligninger tyder på, at celleoverfladeoptagelsesmetoden giver den optimale balance mellem brugervenlighed og vellykket, relativt upartisk berigelse af celleoverfladeproteiner med den laveste baggrundsmærkning af intracellulære proteiner20.
Dette papir præsenterer en effektiv og tidseffektiv protokol til en celleoverfladeproteomics-arbejdsgang ved at integrere celleoverflademærkning og pulldown-procedure med en optimeret proteomics-prøveforberedelsesarbejdsgang (figur 1). Hele proceduren, fra høst af dyrkede celler til analyse på massespektrometeret, kunne opnås i løbet af 3 dage. For at opnå den mest robuste dækning af overfladeproteomet skal det oprindelige input af celler muligvis optimeres baseret på den anvendte celletype. Det anbefales at udføre et pilotforsøg med varierende celleinput, der spænder fra et par millioner celler op til 50 millioner celler, for at sikre maksimal dækning. Hvis der observeres en stor mængde stærkt ekspressive intracellulære proteiner, kan øget vask af neutravidinperlerne efter inkubation med lysatet desuden minimere ikke-specifik binding af proteiner til perlerne.
Vi anbefaler at udføre eksperimentet med mindst tre biologiske replikater og tre tekniske replikater pr. tilstand for at øge tilliden til, at de identificerede celleoverflademarkører faktisk er til stede på størstedelen af cellerne. Når du udfører arbejdsgangen til optagelse af celleoverflade for en ny prøvetype, kan det desuden være nyttigt at analysere et helcellelysat ved hjælp af en konventionel haglgeværproteomics-tilgang21 for at sammenligne med resultaterne af celleoverfladeoptagelse. Analyse af råmassespektrometridata kan udføres ved forskellige databasesøgninger og softwarepakker - her brugte vi MaxQuant - til at give en liste over identificerede proteiner22,23. Denne liste kan filtreres mod forskellige kendte databaser 3,24 af overfladeproteiner for at etablere en liste over celleoverfladeproteiner identificeret i et enkelt eksperiment. Når en liste over celleoverfladeproteiner er blevet etableret, kan de analyseres yderligere for deres rolle i relevante biokemiske veje25 eller lægemiddelmålkandidater26. Denne arbejdsgang kan anvendes på en lang række celletyper, herunder suspension og klæbende cellelinjer (for klæbende celler anbefaler vi at løfte celler uden brug af trypsin før prøveforberedelse for at undgå spaltning af celleoverfladeproteinerne) samt primære prøver.
Ved hjælp af denne arbejdsgang var vi i stand til med sikkerhed at karakterisere celleoverfladeproteomet for en bestemt cellelinje. Ved at sammenligne overfladeproteomet af tumorcellelinjer mod raske celler og krydsreferere med en RNA-sekventeringsdatabase for normalt væv kunne der etableres en liste over potentielle immunterapeutiske mål 8,13. En begrænsning af denne metode er, at på trods af den betydelige berigelse af celleoverfladeproteiner versus et standard helcellelysateksperiment, er størstedelen af proteinerne identificeret ved massespektrometrianalyse i denne arbejdsgang stadig kommenteret som intracellulære. Afhængigt af strengheden af den anvendte overfladeproteindatabase er ca. 25% -30% af de identificerede proteiner fra celleoverfladen. Vi forventer, at en betydelig del af den ikke-overfladebaggrund sandsynligvis stammer fra baggrundsprotein, der ikke er specifikt bundet til perler (for eksempel som karakteriseret ved CRAPome27-analyse), mens andre repræsenterer cellepenetration af mærkningsreagenset for at reagere med N-glycosylerede proteiner i det endoplasmatiske retikulum, Golgi eller andre intracellulære rum.
Mens alternative peptidelueringsmetoder såsom PNGase-behandling resulterer i meget større berigelse af N-glycosites blandt de samlede analyserede peptider, tillader denne tilgang kun identifikation af individuelle glycyosylerede peptider og mister værdifuld information fra den ikke-glykosylerede rest af den nedtrukne proteinsekvens12. Denne ekstra information kan fanges med denne on-bead trypsiniseringsmetode, men ved den potentielle afvejning af reduceret specificitet for N-glycosylerede proteiner analyseret i massespektrometeret. Derudover overvinder selv PNGase-eluering ikke udfordringen med mærkning af intracellulære glycosylerede proteiner, og en PNGase-eluering fører typisk kun til et enkelt peptid pr. Protein; Dette fører til betydelig variation i proteinidentifikation i henhold til vores laboratoriums erfaring, mens fordøjelsen på perlen, der er beskrevet her, fører til flere peptider pr. Indfanget protein. Afhængigt af eksperimentets formål kan man derfor potentielt vælge forskellige strategier til anvendelse af celleoverfladeindfangningsstrategien. Disse strategier omfatter miniaturisering og automatisering af celleoverfladeoptagelsesprotokollen til små prøveindgange28 og anvendelse af streptavidinperler med varierende bindingskapacitet29 afhængigt af applikationen. Den metode og arbejdsgang, der er illustreret her, fungerer som en robust, let at udføre generel strategi for celleoverfladeproteinberigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Kamal Mandal (Institut for Laboratoriemedicin, UCSF) for hjælp med opsætning af LC-MS / MS-kørslen, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) for hjælp med dataanalyse og Dr. Audrey Reeves (Institut for Laboratoriemedicin, UCSF) for hjælp til dataanalyse. Relateret arbejde i APW-laboratoriet understøttes af NIH R01 CA226851 og Chan Zuckerberg Biohub. Figur 1 og figur 2B blev lavet ved hjælp af BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
