Summary
Denne undersøgelse udviklede en ikke-invasiv og realtidsmetode til evaluering af fordelingen af programmeret dødsligand 1 i hele kroppen baseret på positronemissionstomografisk billeddannelse af [68Ga] D-dodecapeptidantagonist. Denne teknik har fordele i forhold til konventionel immunhistokemi og forbedrer effektiviteten af at identificere passende patienter, der vil drage fordel af immunkontrolpunktblokadebehandling.
Abstract
Udviklingen af immuncheckpointblokadeterapi baseret på programmeret celledødsprotein 1 (PD-1)/programmeret dødsligand 1 (PD-L1) har revolutioneret kræftbehandlinger i de senere år. Imidlertid reagerer kun en brøkdel af patienterne på PD-1 / PD-L1-hæmmere på grund af den heterogene ekspression af PD-L1 i tumorceller. Denne heterogenitet udgør en udfordring i den præcise påvisning af tumorceller ved den almindeligt anvendte immunhistokemi (IHC) tilgang. Denne situation kræver bedre metoder til stratificering af patienter, der vil drage fordel af immunkontrolpunktsblokadebehandling, for at forbedre behandlingseffektiviteten. Positronemissionstomografi (PET) muliggør visualisering i realtid af hele kroppen PD-L1-ekspression på en ikke-invasiv måde. Derfor er der behov for udvikling af radioaktivt mærkede sporstoffer til påvisning af PD-L1-fordeling i tumorer gennem PET-billeddannelse.
Sammenlignet med deres L-modstykker har dextrorotære (D)-peptider egenskaber som proteolytisk resistens og bemærkelsesværdigt forlængede metaboliske halveringstider. Denne undersøgelse designede en ny metode til at detektere PD-L1-ekspression baseret på PET-billeddannelse af 68Ga-mærket PD-L1-målrettet D-peptid, en D-dodecapeptidantagonist (DPA), i tumorbærende mus. Resultaterne viste, at [68Ga] DPA specifikt kan binde til PD-L1-overekspressive tumorer in vivo og viste gunstig stabilitet samt fremragende billeddannelsesevne, hvilket tyder på, at [68Ga] DPA-PET er en lovende tilgang til vurdering af PD-L1-status hos tumorer.
Introduction
Opdagelsen af immuncheckpointproteiner var et gennembrud inden for tumorterapi og har ført til store fremskridt i udviklingen af immuncheckpointblokadeterapi1. Programmeret celledødsprotein 1 (PD-1) og programmeret dødsligand 1 (PD-L1) er potentielle lægemiddelmål med flere antistoffer godkendt af Food and Drug Administration (FDA). PD-1 udtrykkes af tumorinfiltrerende immunceller, såsom CD4 +, CD8 + T-celler og regulatoriske T-celler. PD-L1 er en af PD-1-liganderne, som er overudtrykt i en række tumorceller 2,3. Interaktionen mellem PD-1 og PD-L1 inaktiverer PD-1 og undertrykker således antitumorimmunresponset4. Disse resultater tyder på, at hæmning af PD-L1 kan forbedre immuncellernes dræbende virkning og eliminere tumorceller5. I øjeblikket er kromogen immunhistokemi (IHC) den mest almindeligt anvendte tilgang til at identificere patienter, der mest sandsynligt vil reagere på immuncheckpointbehandling 6,7. På grund af den heterogene ekspression af PD-L1 i tumorceller kan IHC-resultater fra biopsier imidlertid ikke give nøjagtige oplysninger om PD-L1-ekspression hos patienter8. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at kun 20% -40% af patienterne får langsigtede fordele ved immunkontrolpunktblokadebehandling 1,9,10. Der er derfor et presserende behov for at udvikle en ny metode til at omgå de falsk-negative resultater forårsaget af den heterogene ekspression af disse immuncheckpoint-proteiner.
Molekylær billeddannelsesteknologi, såsom positronemissionstomografi (PET), muliggør visualisering i realtid af hele kroppen på en ikke-invasiv måde og kan således overgå den konventionelle IHC-metode 11,12,13. Radioaktivt mærkede antistoffer, peptider og små molekyler er lovende sporstoffer til overvågning af PD-L1-ekspression hos kræftpatienter 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . FDA har godkendt tre PD-L1 terapeutiske monoklonale antistoffer: avelumab, atezolizumab og durvalumab26. Immuno-PET-sporstoffer baseret på disse antistoffer er veldokumenterede 27,28,29,30,31,32. Tidlige fase kliniske forsøg har afsløret begrænset værdi for klinisk anvendelse på grund af den ugunstige farmakokinetik30. Sammenlignet med antistoffer udviser peptider hurtigere blod og organclearance fra sunde organer og kan let kemisk modificeres33. Flere peptider med høj affinitet for PD-1/PD-L1 er blevet rapporteret2; WL12 er et rapporteret peptid, der viser specifik binding til PD-L134. Radioaktivt mærkede sporstoffer, [64Cu] WL12, [68Ga] WL12 og [18F] FPyWL12, er rapporteret at vise høj in vivo-specifik tumormålretningsevne, hvilket muliggør høst af billeder af høj kvalitet af PD-L1-ekspression i tumorer 26,35,36,37. Desuden har den første evaluering i mennesker af radioaktivt mærket WL12 vist, at [68Ga] WL12 (chelateret af NOTA) har et sikkert og effektivt potentiale for klinisk tumorbilleddannelse38. På grund af sin høje hydrofobicitet og høje optagelse i den sunde lever har WL12 begrænset klinisk anvendelse. Andre radioaktive mærkningspeptider, såsom TPP1 og SETSKSF, som specifikt binder til PD-L1, har også vist potentiel stabilitet og specificitet til at visualisere helkrops PD-L1-ekspression39,40. Imidlertid nedbrydes umodificerede peptider let af proteaser og metaboliseres hurtigt af nyrerne. Dextrorotary (D) -peptider er blevet anvendt i vid udstrækning som effektive mediatorer på grund af den dårlige stabilitet af venstrehåndede (L)-peptider 41,42,43. D-peptider er hyperresistente over for proteolytisk nedbrydning og har bemærkelsesværdigt forlængede metaboliske halveringstider. Sammenlignet med deres L-modstykker viser D-peptider for det meste specifikke bindingsevner 44,45,46.
Denne undersøgelse designede en ny metode til at detektere PD-L1-ekspression baseret på PET-billeddannelse af en 68Ga-mærket PD-L1-målrettet D-peptid, D-dodecapeptidantagonist (DPA), i en tumorbærende musemodel47. Stabiliteten af [68Ga]DPA blev først undersøgt i fosfatbufret saltvand (PBS) og museserum, hvorefter bindingsaffiniteten af [68Ga]DPA i PD-L1-overekspressive tumorer blev testet. Derefter blev PET-billeddannelse udført i glioblastom-xenograftmodeller for at bekræfte, om [68Ga] DPA var et ideelt PET-sporstof til overvågning af PD-L1-ekspression i tumorer. Kombinationen af PET-billeddannelse og DPA giver ikke kun en ny tilgang til at overvinde udfordringer forbundet med den heterogene ekspression af PD-L1, men danner også grundlag for udviklingen af D-peptidbaserede radiosporstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgsprocedurerne blev godkendt af Animal Ethics Committee of Nanjing Medical University eller National Institutes of Quantum Science and Technology. Museforsøg blev strengt udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra Udvalget for Pleje og Anvendelse af Forsøgsdyr.
1. Peptidsyntese
- Svulme 100 mg 4-methylbenzhydrylamin (MBHA) harpiks (belastningskapacitet på 0,37 mmol / g) i 1 ml N-methyl-2-pyrrolidon (NMP) i 30 minutter undermild N2-boblende.
- Der fremstilles en frisk stambuffer bestående af Fmoc-beskyttede aminosyrer (5,0 ækvivalent), HCTU (4,9 ækvivalent) og DIPEA (10,0 ækvivalent) i 1 ml NMP, og tilsættes harpiksen (100 mg). Lad koblingsreaktionen fortsætte i 1,5-2 timer.
- Forbered debeskyttelsesbuffer bestående af 50% (vol / vol) morpholin i NMP. Harpiksen (100 mg) vaskes 2 x 30 min med 1 ml debeskyttelsesbuffer i hver vask for at fjerne Fmoc-gruppen på amingruppen. Harpiksen vaskes med dichlormethan (DCM; 1 ml) i 1 min, DCM fjernes, og harpiksen vaskes igen med NMP (1 ml) i yderligere 1 min. Fjern derefter NMP og vask harpiksen igen med DCM i 1 min.
BEMÆRK: Alle vaskeprocedurer udføres under mildN2-boblende . Ovennævnte procedurer gentages indtil den sidste aminosyre. - For tilsætning af 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyre (DOTA) til peptidet skal DOTA foraktiveres med N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC· HCI) og N-hydroxysuccinimid (NHS). Inkuber lagerbufferen af DOTA/EDC· HCI/NHS ved et molært forhold på 1:1:1 i dimethylsulfoxid (DMSO) i 3 timer med en endelig DOTA-koncentration på 1 M. Derefter tilsættes stambufferen (1 ml) til harpiksen (100 mg), og reaktionen lades fortsætte i 2 timer med blidN2-boblende.
BEMÆRK: 1,4,7-triazacyclononan-1,4,7-trieddikesyre (NOTA) kan også anvendes som chelator til 68Ga kompleksdannelse. De samme procedurer kan anvendes til NOTA-kobling. - Skyl harpiksen grundigt fra toppen ved hjælp af DCM og påfør et vakuum for at fjerne resterende reaktionsopløsning samtidigt. Skyl harpiksen 3x ved hjælp af DCM (1,5 ml), og skyl derefter med MeOH (1,5 ml) for at krympe harpiksen. Sæt harpiksen under nitrogen natten over eller under højt vakuum i mindst 4 timer, indtil harpiksen bliver tør.
- Anbring den tørrede DPA-peptidholdige harpiks i en 2 ml polypropylenbeholder med et skruelåg. Tilsæt den passende spaltningscocktail (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O i volumen; 1 ml/100 mg harpiks) og forsegl beholderen tæt med et skruelåg. Omrystningen afrystes forsigtigt på en orbitalryster i en stinkhætte ved 20-25 °C i 2 timer.
FORSIGTIG: Forbered trifluoreddikesyre (TFA) i en stinkhætte iført beskyttelsesbeklædning på grund af dens stærkt ætsende karakter. - Det meste af TFA fjernes ved fordampning under nitrogen i stinkdækslet. Peptiderne udfældes ved tilsætning af diethylether (~1,5 ml/100 mg harpiks).
- Vortex blandingen for at triturere peptiderne og centrifugere ved stuetemperatur (10.000 × g, 5 min). Hæld forsigtigt opløsningsmidlet ud af beholderen. Gentag trin 1.7-1.8.
- Lufttør resten i den åbne beholder i 10 min. Tilsæt 50% (vol/vol) vandig acetonitril og hvirvel i 1-2 s for at opløse produkterne (1 ml/100 mg harpiks).
- Fjern harpiksen ved at filtrere blandingen, og vask derefter harpiksen 2x med 0,2 ml 50% (vol / vol) vandig acetonitril. Bland filtraterne til højtydende væskekromatografi (HPLC) rensning. Brug følgende HPLC-betingelser. Søjle: YMC-Triat-C18 (4,6 mm indvendig diameter [id], 150 mm, 5 mm); opløsningsmiddelgradient: opløsningsmiddel A-deioniseret vand; opløsningsmiddel B-acetonitril (0,1% TFA); strømningstid: 20 min, med acetonitril fra 10% til 90%; flowhastighed: 1 ml / min.
- De opsamlede HPLC-elueringsmidler fryses natten over ved -80 °C og frysefryses (-50 °C og <1 pa). Til radioaktiv mærkning opløses det faste peptid i natriumacetatbuffer (100 mM, pH 5,0) i en slutkoncentration på 1 mg/ml som stambuffer.
2. 68Ga radioaktiv mærkning
NOTE 68Ga blev genereret internt på Nanjing First Hospital (Nanjing, Kina) ved hjælp af en 68Ge/68Ga-generator.
- Pipette 5 μL stambuffer i en 1,5 ml polypropylenbeholder med skruelåg. Tilføj 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) til beholderen.
- Vortex blandingen i 5 s. Mål pH-værdien ved hjælp af pH-teststrimler. Juster pH til 4-4,5 med NaOH (0,1 M).
BEMÆRK: En passende pH er kritisk for kompleksdannelse mellem 68Ga og DOTA. - Inkuber opløsningen ved stuetemperatur i 5-10 min. Udsæt reaktionsblandingen for radio-HPLC til analyse af radioaktivt mærkningsudbytte under følgende betingelser: kolonne: YMC-Triat-C18 (4,6 mm id, 150 mm, 5 mm); opløsningsmiddelgradient: opløsningsmiddel A-deioniseret vand; opløsningsmiddel B-acetonitril (0,1% TFA); strømningstid: 20 min, med acetonitril fra 10% til 90%; flowhastighed: 1 ml / min.
BEMÆRK: Radiotyndtlagskromatografi (TLC) kan bruges som en alternativ tilgang til at undersøge radioaktivt mærkningsudbytte. Den foreslåede TLC-elueringsbuffer er 0,1 M,Na3C,6H5O7, pH4.
3. Test af sporstofstabilitet
- Test af sporstabilitet i PBS
- Tilføj [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, i NaOAc) til PBS (990 μL). Der inkuberes ved 37 °C i 1, 2 og 4 timer under let omrøring.
- Der opsamles 200 μL af opløsningen på hvert tidspunkt. Injicer det i radio-HPLC til analyse.
- Sporstofstabilitet i museserum
- Der tilsættes [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, i NaOAc) til museserumet (90 μL, frisklavet). Der inkuberes ved 37 °C i 1, 2 og 4 timer under let omrøring.
- Der opsamles 20 μL af opløsningen på hvert tidspunkt. Tilsæt MeCN og vand (100 μL, 1:1, v/v).
- Centrifuger blandingen i 10 minutter (5.000 × g, 25 °C). Supernatanten analyseres med radio-HPLC.
4. Analyse af PD-L1-ekspression ved flowcytometri
- Forbered dyrkningsmedium ved at supplere RPMI-1640-medium med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (vol / vol). Resuspender U87MG-cellerne i dyrkningsmedium og frø i plader med 12 brønde med en densitet på 105 celler / brønd. Cellerne anbringes i en inkubator (5% CO2, 37 °C), og dyrkningen i mindst 24 timer uden forstyrrelser.
- Vask cellerne med 0,5 ml PBS og tilsæt 250 μL trypsin-EDTA (0,25%). Placer cellerne tilbage i inkubatoren (5% CO2, 37 ° C) i 2 min.
- Tilsæt 1 ml dyrkningsmedium for at stoppe celledissociationen. Tilsæt medium til cellerne for at løsne dem fra skålene ved pipettering op og ned og saml dem i 1,5 ml rør. Centrifuger cellerne i 5 min (100 × g).
- Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 1 ml PBS. Centrifuger cellerne i 5 minutter (100 × g). Gentag dette trin endnu en gang.
- Det fluoresceinisothiocyanatkonjugerede PD-L1-antistof fortyndes med 3 % bovint serumalbumin (BSA) til 20 nmol/l. Der tilsættes til cellerne og inkuberes ved 4 °C i 1 time.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter (100 × g), efterfulgt af vask med kold PBS to gange. Analyser de PD-L1-positive celler ved hjælp af et flowcytometer og analysesoftware.
5. Immuncytokemi
- Frø U87MG-cellerne i glasbundscellekulturskåle (35 mm) med en densitet på 2,5 × 105 celler pr. Brønd. Når 60% sammenløb er nået, aspireres dyrkningsmediet og tilsættes 1 ml PBS. Ryst forsigtigt flere gange og aspirer. Udfør vasketrinnet 3x.
- Tilsæt 500 μL 4% paraformaldehyd til opvasken. Placer cellerne ved stuetemperatur og fastgør i 30 minutter.
- Vask cellerne 3x med PBS. Der tilsættes 1 ml 3% BSA (vægt/vol, i PBS) og bloker de fikserede celler i 2 timer ved stuetemperatur.
- De 3 % BSA fjernes, og cellerne inkuberes direkte med primært anti-PD-L1-antistof (mAb,1:100, fortyndet i 3 % BSA) natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Når cellerne er blokeret med BSA, må du ikke vaske med PBS. - Vask cellerne 3x med 3% BSA-buffer. Inkuber cellerne med FITC-konjugeret anti-humant IgG Fc sekundært antistof (1:500, fortyndet i PBS) i 1 time.
- Vask cellerne 3x med PBS. Der tilsættes 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) til cellerne og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Vask de farvede celler 3x med PBS, og observer ved hjælp af konfokal fluorescensmikroskop.
6. Cellulær optagelse og hæmning eksperiment
- Eksperiment med cellulær optagelse
- Dyrk U87MG-cellerne i plader med 12 brønde, indtil 80% sammenløb er nået. Fjern mediet og vask cellerne med 0,5 ml PBS.
- [68Ga]DPA fortyndes i frisk medium til en koncentration på 74 KBq/ml. Der tilsættes 0,5 ml af den fortyndede [68Ga]DPA-buffer til hvert hul.
- Inkuber cellerne med [68Ga]DPA ved 37 °C i forskellige varigheder (10, 30, 40 og 120 min). Opsug mediet ved hjælp af en pipette. Cellerne vaskes med PBS (0,5 ml) tre gange.
- Tilsæt NaOH-opløsning (0,5 M, 300 μL pr. hul) for at lyse cellerne. Efter 30 s opsamles de viskøse cellelysater i 1,5 ml rør.
- Pladen vaskes to gange med 0,4 ml PBS. Opsaml vaskeopløsningen i ovennævnte 1,5 ml rør.
- Start den indbyggede computer i den automatiske gammatæller; Sæt rørene i den indbyggede hylde. Når du har lagt alle prøverne på transportøren, skal du trykke på START-knappen. Resultaterne beregnes i den interne software. Udlæsningen registrerer de henfaldskorrelerede tællinger pr. minut (CPM) for hvert rør.
- Konkurrencedygtigt bindende assay
- Dyrk U87MG-cellerne i plader med 12 brønde, indtil 80% sammenløb er nået. Fjern mediet og vask cellerne med 0,5 ml PBS.
- [68Ga]DPA fortyndes i frisk substrat til en koncentration på 74 KBq/ml. En passende mængde BMS202-forbindelser opløses i 10% DMSO for at opnå en koncentration på 10 mM (400 μL).
- 4 μL 10 mM BMS202 fortyndes i 396 μL PBS for at opnå en koncentration på 100 μM. Gentag dette trin for at opnå forskellige koncentrationer af BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM og 1 pM).
- Der tilsættes 0,5 ml af den fortyndede [68Ga]DPA-buffer til hvert hul (0,37 MBq pr. hul). Der tilsættes 5 μL BMS202-opløsningerne til hvert hul (tre huller for hver koncentration). Cellerne inkuberes i en celleinkubator ved 37 °C i 120 min.
- Opsug mediet ved hjælp af en pipette. Cellerne vaskes med 3 x 0,5 ml PBS.
- Tilsæt NaOH-opløsningen (0,5 M, 300 μL pr. hul) for at lyse cellerne. Efter 30 s samles de viskøse cellelysater i 1,5 ml rør. Pladen vaskes med 2 x 0,4 ml PBS.
- Opsaml vaskeopløsningen i ovennævnte 1,5 ml rør. Sæt rørene i den indbyggede hylde på den automatiske gammatæller.
- Følg de samme procedurer som trin 6.1.6.
7. PET-billeddannelse
BEMÆRK: Udfør PET-billeddannelse for små dyr ved hjælp af en mikro-PET-scanner, der giver 159 tværgående aksiale sektioner med en afstand på 0,796 mm (center til center) med et vandret synsfelt på 10 cm og et aksialt synsfelt på 12,7 cm. Alle data indsamlet i listetilstand er organiseret i tredimensionelle sinogrammer. Fourieren samles derefter igen i todimensionelle sinogrammer (ramme × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- Brug hanmus, 5-8 uger gamle BALB/C-nøgne mus i denne undersøgelse. Saml U87MG-cellerne ved at følge trin 4.1-4.4 og aspirer cellerne til en 0,5 ml sprøjte. Subkutant injicerer cellerne i musene (1 × 106 celler pr. Tumor, to tumorer pr. Mus). Overvåg tumorvækst efter injektion, indtil tumorvolumenet er 100-300 mm3.
- Bedøv musene med 1% -2% (v / v) isofluran (1 ml / min). Tænd for varmeapparatet, og opbevar PET's dyreleje ved 37 °C.
- Sæt de bedøvede mus i den rigtige position på PET-maskinens dyreseng. Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørhed.
FORSIGTIG: Hold musene i den udsatte position for at undgå død under scanning. Under hele billeddannelsesprocessen administreres isofluranflow (1,0 ml/min) via næsen ved hjælp af et forudinstalleret rør. - Juster dyresengens position via kontrolpanelet. Injicer sporstoffer (10-17 MBq/100-200 μL) intravenøst gennem et forudinstalleret halevenekateter.
- Opret en scanningsarbejdsgang på en værtscomputer ved hjælp af den refererede software (se materialetabel) Opret en studiemappe, og indstil anskaffelsesprotokollen i henhold til producentens protokol. Udfør dynamiske scanninger (60 min for hver mus) på alle mus i 3D-listetilstand.
- Definer en histogramprotokol og en rekonstruktionsprotokol efter producentens protokol. Brug Hannings filter med en Nyquist-afskæring på 0,5 cyklus/pixel til at rekonstruere dynamiske PET-billeder (25-30 min og 55-60 min) gennem filtreret back-projektion. Generer MIP-billeder (Maximum Intensity Projection) for alle mus.
- Kombiner protokollerne i en arbejdsproces, og kør arbejdsprocessen. Analyser de resulterende tredimensionelle billeder ved hjælp af softwaren efter producentens protokol.
BEMÆRK: Brug simuleringssoftwaren til at vælge de mængder, der er interessante. Radioaktiviteten henfaldskorrigeres til injektionstiden og angives som procentdelen af den totale injektionsdosis/pr. gram væv (% ID/g).
8. Ex vivo-biodistribution
- Administrer [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) til de U87MG-bærende BALB/C nøgne mus gennem haleveneinjektion. Bedøv musene med 1% -2% (v / v) isofluran (1 ml / min), og ofr derefter tre mus via cervikal dislokation efter injektion i 5, 30, 60 og 120 minutter.
BEMÆRK: De personer, der demonstrerer denne procedure, bør trænes i de tekniske færdigheder i cervikal dislokation for at sikre, at bevidsthedstabet hurtigt induceres. Dette vil sikre, at eutanasiprocedurerne i dette eksperiment alle udføres humant. - Når døden er bekræftet, skal du åbne musenes brystvæg. Åbn derefter hjertet. Brug en 1 ml sprøjte til at trække blod; Klem blodet fra sprøjten ind i et radioimmunoassay (RIA) rør (13 mm i diameter) til gammatælleren.
- Punktafgifter de vigtigste organer og tumorer og placere dem i RIA-rør (13 mm i diameter) til gammatælleren. Større organer omfatter det samlede blod, hjerte, thymus, lever, milt, knogle, mave, nyrer, muskler, intestinal lymfeknude, tyndtarm, bugspytkirtel, testikler, hjerne og lunger. Væg alle organerne.
- Mål radioaktiviteten i de indsamlede organer ved hjælp af en autogammatæller og henfaldskorriger værdierne. Beregn procentdelen af injiceret dosis pr. gram vådt væv (% ID/g).
9. Immunhistokemi
- Saml gliomvævene og vask dem 3x med PBS. Kom det friske væv i 4% paraformaldehyd og fiks natten over ved 4 °C.
- Integrer det faste væv i paraffin og skær dem til en tykkelse på 10 μm. Sektionerne anbringes i en inkubator (60 °C) og inkuberes i 2 timer. Afvoks og hydrat sektionerne ved at inkubere i 10 minutter hver i følgende: xylen (to gange), absolut alkohol, 95% alkohol, 90% alkohol, 80% alkohol, 75% alkohol.
- Sæt sektionerne i 0,01 M natriumcitrat og opvarm dem til 92-95 °C. Hold temperaturen i 40 minutter for at opnå antigenudtagning.
- Der tilsættes 200 μLH2O2-opløsning(3%) til sektionerne og inaktiveres endoperoxidaserne i 10 minutter ved stuetemperatur. Bloker de ikke-specifikke steder ved behandling med 3% BSA i 2 timer ved stuetemperatur.
- Sektionerne i det primære anti-PD-L1-antistof (mAb, 1:100, fortyndet i 3 % BSA) inkuberes natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Efter blokering med BSA må du ikke vaske med PBS. - Vask sektionerne 3x med PBS. Inkuber sektionerne med HRP-mærket ged anti-kanin sekundært antistof (1:500, fortyndet i PBS) ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask cellerne 3x med PBS. Der tilsættes 200 μL 3,3-diaminobenzidin (DAB) arbejdsopløsning (opløsning A: opløsning B: opløsning C = 1:1:18) til sektionerne og inkuberes i 5 minutter i mørke.
- Vask sektionerne 3x med PBS. Tilsæt 500 μL hæmatoxylinopløsning (100%) og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask sektionerne med vand i 30 s. Sæt sektionerne i differentieringsopløsning (75% alkohol: HCL = 99: 1) i 30 s. Vask sektionerne med vand i 1 min.
- Dehydrer prøverne ved sekventielt at inkubere med 75% alkohol, 80% alkohol, 90% alkohol, 95% alkohol, absolut alkohol og xylen (to gange) (10 min hver). Monter alle sektioner ved hjælp af neutral harpiks og observer dem under et optisk mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga]DPA radiomærkning og stabilitet
Modelpeptidet, DPA, er en effektiv PD-L1-antagonist. DOTA-DPA blev opnået med >95% renhed og et udbytte på 68%. Massen af DOTA-DPA observeres eksperimentelt ved 1.073,3 ([M+2H]2+). 68Gallium betragtes som et egnet radionuklid til mærkning af peptider til PET-billeddannelse og blev derfor valgt til denne undersøgelse. For at radiomærke DPA med 68Ga (halveringstid: 68 min) blev DOTA-PEG3-DPA syntetiseret (figur 1A). DOTA blev brugt som chelator til 68Ga radiomærkning. Til rummet DOTA og DPA blev PEG3 brugt som linker. [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (benævnt [68Ga]DPA i den følgende tekst) viste højt radiokemisk udbytte (>95%) og radiokemisk renhed (>95%) (tabel 1). En sporstabilitetstest blev også udført ved hjælp af HPLC, og resultaterne viste, at [68Ga]DPA havde stor stabilitet både i PBS og museserum. 68Ga-dekomponationen eller peptidhydrolysen blev ikke påvist efter en 4 timers inkubation ved 37 °C (figur 1B).
Ekspression af PD-L1 i U87MG-celler
En tidligere undersøgelse viste, at en øget ekspression af PD-L1 korrelerede med dårlig patientoverlevelse i glioblastomtumorer, hvilket indikerer, at PD-L1 kan være en bemærkelsesværdig prognostisk biomarkør og terapeutisk mål i glioblastom48. Derfor blev en human glioblastomcellelinje, U87MG, brugt til at etablere en tumormodel til bestemmelse af effekten af [68Ga] DPA i PET / CT til PD-L1 tumorbilleddannelse. Resultaterne af flowcytometri antydede, at ca. 60% af U87MG-cellerne var PD-L1-positive (figur 2A). Desuden bekræftede immunofluorescerende farvning den stærke ekspression af PD-L1 i U87MG-cellerne (figur 2B). Sammen viste disse data, at U87MG-cellelinjen var egnet til denne undersøgelse.
Mobiloptagelse og specificitet af [68Ga]DPA
Optagelsen af [68Ga] DPA af U87MG-celler præsenterede et tidsafhængigt mønster. Når en PD-L1-hæmmer, BMS202, blev anvendt som blokeringsmiddel, blev bindingsdelen og optagelsen af [68Ga]DPA signifikant reduceret (figur 3A). Et kompetitivt bindingsassay undersøgte yderligere bindingsaffiniteten (Ki) af BMS202 til U87MG-cellerne. Den estimerede bindingsaffinitet var 43,8 ± 8,6 nmol/l for BMS202, når [68Ga]DPA blev anvendt som konkurrent (figur 3B).
[68Ga] DPA PET-billeddannelse af tumormodeller
PET-billeddannelse af [68Ga] DPA blev udført i U87MG tumorbærende BALB / C nøgne mus. [68Ga] DPA blev administreret gennem intravenøs injektion, indtil U87MG-tumoren voksede til 100 mm3. PET-billeder af hele kroppen afslørede høj [68Ga] DPA-akkumulering i tumoren efter 30 og 60 minutters injektion og viste den højeste ophobning i nyren og blæren (figur 4A). For at bekræfte, om [68Ga] DPA specifikt akkumuleret i PD-L1-positive tumorer, blev en anden musemodel med PanNET-cellelinjen Bon-1 brugt som en negativ kontrol. Et parallelt eksperiment viste ringe [68Ga] DPA-akkumulering i Bon-1-tumorer 60 minutter efter injektion (figur 4B).
For at afklare denne forskel blev immunohistokemisk farvning udført for at analysere PD-L1-ekspression i tumorvæv. Resultaterne afslørede, at U87MG-cellerne præsenterede betydelig PD-L1-ekspression (figur 5A, C), men ikke Bon-1-tumoren (figur 5B, C). Disse data var i overensstemmelse med PET-resultaterne. Derfor er det muligt, at de forskellige tumorcellevækststatusser resulterede i forskellig PD-L1-ekspression (f.eks. Vævsnekrose). For at verificere dette blev hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning udført. Som forventet blev der observeret en lignende cellemorfologi mellem de to tumorvæv (figur 5D).
Ex vivo biodistribution af [68Ga] DPA i U87MG tumorer
Ex vivo-biodistributionsstudiet blev også udført med U87MG-bærende mus (tabel 2). Resultaterne viste en hurtig clearance i blod og de fleste analyserede organer, herunder hjerte, lever, lunge og muskel. Nyren akkumulerede den højeste mængde radioaktivitet og viste en clearance rate på 0,12% ID/(g∙min) fra 5 min til 120 min. Tumoren udviste optagelse af den næsthøjeste sporoptagelse på alle tidspunkter. Derudover præsenterede tumoren fra 5 min til 60 min efter injektion en lavere sporclearance på 0,027% ID / (g ∙min). For blod var clearance raten 0,069% ID/(g∙min), mens clearance for muskler var 0,037% ID/(g∙min).
Figur 1: [68Ga]DPA radiomærkning og stabilitet. (A) Den kemiske struktur af [68Ga]DPA og den skematiske repræsentation af dens binding til PD-L1, der udtrykker tumorceller. B) HPLC-kurver, der viser radioaktiviteten af [68Ga]DPA efter inkubation med PBS eller museserum i 0,5, 2 og 4 timer. Dette tal blev ændret fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodecapeptidantagonist; PD-L1 = programmeret dødsligand 1; PBS = fosfatbufret saltvand HPLC = højtydende væskekromatografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ekspression af PD-L1 i U87MG-cellelinjen. (A) Ekspressionen af PD-L1 i U87MG-cellelinjen blev målt gennem flowcytometrianalyse. (B) Ekspressionen af PD-L1 i U87MG-celler blev målt ved immunofluorescensfarvningsassay. Skalabjælke = 100 μm. Dette tal blev ændret fra Hu et al.47. Forkortelser: PD-L1 = programmeret dødsligand 1; SSC = sidespredning; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cellulær optagelse og hæmning af [68Ga]DPA. (A) Optagelsen af U87MG-celler, når de inkuberes med [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) eller [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) + BMS202 (100 μmol/l) i forskellige varigheder. (B) Kompetitiv binding af [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) til U87MG-cellerne efter inkubation med BMS202. Ki-værdien vises i panelet. Dette tal blev ændret fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodecapeptidantagonist; %AD = administreret dosis (i forhold til bindingsdelen). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: PET-billeddannelse af [68Ga] DPA i PD-L1-overekspression af U87MG-tumorer. (A,B) PET-CT-billeder, der viser fordelingen af [68Ga]DPA i U87MG-bærende mus (A) og Bon-1-bærende mus (negativ kontrol, B) efter intravenøs injektion (~18,5 MBq) i 30 min og 60 min. Repræsentativ maxiumumintensitetsprojektion (MIP) (toppanel) og tværgående PET-CT-billeder (nederste panel) præsenteres. Tumorpositionerne er markeret med hvide stiplede cirkler. Denne figur blev ændret fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodecapeptidantagonist; PD-L1 = programmeret dødsligand 1; PET-CT = positronemissionstomografi-computertomografi; MIP = projektion med maksiumintensitet p.i. = efter injektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Immunohistokemisk analyse af [68Ga]DPA-behandlede tumorer. (A,B) Hele sektion immunhistokemiske billeder af PD-L1 i (A) U87MG og (B) Bon-1 tumorer. (C) Forstørrede billeder af de markerede områder i A og B. (D) H&E-farvning af U87MG og Bon-1 tumor. Skalastænger = 100 μm (C,D). Dette tal blev ændret fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodecapeptidantagonist; PD-L1 = programmeret dødsligand 1; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Røbestoffer | [68Ga] DPA |
| Radiokemisk udbytte (%) | >95 |
| Molær aktivitet (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| Radiokemisk renheda (%) | >95 |
Tabel 1: Radioaktiv mærkning og kvalitetskontrol af [68Ga]DPA. Radiokemisk udbytte, molær aktivitet og radiokemisk renhed af [68Ga] DPA. Data repræsenteres som gennemsnittet ± SD (n = 7). Denne tabel er ændret fra Hu et al.47. Forkortelse: DPA = dodecapeptidantagonist. enRadiokemisk renhed af [68Ga] DPA blev analyseret ved omvendt fase HPLC under en optimeret tilstand: 1) kolonne: YMC-Triat-C18 (4,6 mm i.d., 150 mm, 5 mm); 2) opløsningsmiddelgradient: opløsningsmiddel A-deioniseret vand; opløsningsmiddel B-acetonitril (0,1% trifluoreddikesyre); strømningstid: 20 min, med acetonitril fra 10% til 90%; flowhastighed på 1 ml/min.
| [68Ga] DPA | ||||||||
| 5 minutter | 30 minutter | 60 minutter | 120 minutter | |||||
| blod | 3.89 | ±0,43 | 1.55 | ±1,07 | 0.11 | ±0,02 | 0.05 | ±0,01 |
| hjerte | 1.19 | ±0,39 | 0.52 | ±0,33 | 0.06 | ±0,02 | 0.05 | ±0,02 |
| lever | 1.06 | ±0,26 | 0.59 | ±0,43 | 0.19 | ±0,02 | 0.16 | ±0,04 |
| milt | 0.98 | ±0,14 | 0.68 | ±0,67 | 0.14 | ±0,06 | 0.09 | ±0,03 |
| lunge | 1.64 | ±0,42 | 1.03 | ±0,9 | 0.13 | ±0,05 | 0.09 | ±0,02 |
| nyre | 19.23 | ±1,95 | 16.13 | ±1,51 | 11.5 | ±0,44 | 5.2 | ±0,31 |
| mave | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0,35 | 0.08 | ±0,01 | 0.08 | ±0,03 |
| intestinal | 0.72 | ±0,27 | 0.47 | ±0,35 | 0.08 | ±0,02 | 0.06 | ±0,03 |
| bugspytkirtel | 1.88 | ±0,28 | 0.77 | ±0,75 | 0.16 | ±0,03 | 0.13 | ±0,03 |
| muskel | 2.21 | ±0,27 | 0.71 | ±0,37 | 0.18 | ±0,02 | 0.14 | ±0,04 |
| knogle | 2.18 | ±0,11 | 0.85 | ±0,51 | 0.26 | ±0,09 | 0.14 | ±0,06 |
| hjerne | 0.19 | ±0,04 | 0.11 | ±0,08 | 0.03 | ±0,01 | 0.02 | ±0,01 |
| tumor | 4.5 | ±0,32 | 3.77 | ±0,27 | 2.99 | ±0,03 | 0.89 | ±0,19 |
| fedt | 2.09 | ±0,49 | 0.81 | ±0,12 | 0.27 | ±0,07 | 0.1 | ±0,07 |
Tabel 2: Biodistribution af [68Ga]DPA i U87MG tumorbærende mus efter administration i forskellige varigheder (n = 3 pr. tidspunkt). Denne tabel er ændret fra Hu et al.47. Forkortelse: DPA = dodecapeptidantagonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin beskrevet i denne metode omfatter effektiv mærkning af 68Ga til DPA og valg af et passende tidsvindue til PET-billeddannelse, som perfekt skal matche det farmakodynamiske mønster af DPA i tumoren.
I modsætning til IHC muliggør PET-billeddannelse realtidsdetektion af helkrops PD-L1-ekspression på en ikke-invasiv måde, hvilket muliggør visualisering af hvert positivt område i en heterogen tumor 6,7. Peptider blev valgt som ligander for at undgå ulemperne ved antistoffer og små molekyler. Antistoffer med store molekylvægte har generelt lange cirkulerende halveringstider, hvilket forårsager højere toksicitet for sunde organer. Clearance af små molekyler er normalt for hurtig til at opnå den nødvendige tumorretention. Molekylvægten af peptider varierer mellem antistoffer og små molekyler. Dette gør det muligt for peptidbaserede radiosporstoffer at opnå både langvarig tumorretention og god vævspenetration med minimal toksicitet 13,49,50,51,52,53. Det er vigtigt, at nytten af D-peptid DPA, snarere end de almindeligt rapporterede L-peptider, giver [68Ga] DPA en bemærkelsesværdig forlænget metabolisk halveringstid. Desuden er DPA positivt ladet og hydrofil in vivo og har derfor høj opløselighed og kan undgå uspecifik målretning i blod, hvilket letter genereringen af PET-billeder med høj billedkvalitet.
Især kræver vellykket 68Ga radiomærkning en specifik pH og ingen interferens fra overgangsmetalioner, såsom Cu (II) og Fe (III) kationer. I nogle tilfælde fører Cu2+ kontaminering til lavt radioaktivt udbytte. Derfor er det afgørende at sikre, at alle beholdere og pipettespidser ikke er forurenede. Derudover blev U87MG i denne metode anvendt til tumorinokulation. Selvom PD-L1-ekspression i U87MG-xenotransplantater blev verificeret i tidligere undersøgelser, varierer dets ekspression på tværs af de enkelte dyr. Derfor varierede den absolutte optagelse af sporstoffet i U87MG-tumorerne på tværs af individuelle mus. For at sikre effektiv optagelse af sporstoffer i tumorerne skal dyr med en passende tumorstørrelse (500 mm3 < volumen < 100 mm3) udvælges til PET-scanning.
En af begrænsningerne ved [68Ga]DPA er, at bindingsaffiniteten af DPA til PD-L1 er relativt lav sammenlignet med flere andre PD-L1-målretningspeptider, såsom WL12, hvilket gør den uegnet til tumorer med relativt lav PD-L1-ekspression26,47. Yderligere modifikation af D-peptidet vil forbedre dets specifikke bindingskapacitet. For at forbedre billedeffekten af [68Ga]DPA kan formuleringen af injektionsstrategien optimeres, for eksempel ved samtidig at injicere umærket DPA før [68Ga]DPA for at blokere de uspecifikke bindingssteder 54,55,56.
Afslutningsvis udviklede denne undersøgelse en ikke-invasiv og realtidsmetode til at spore PD-L1-fordeling i hele kroppen af levende dyr ved hjælp af [68Ga] DPA som radiosporer. Resultaterne afslørede en relativt høj, in vivo specifik bindingsaffinitet, gunstig stabilitet og fremragende billeddannelseskapacitet på [68Ga] DPA, hvilket tyder på, at [68Ga] DPA-PET er en lovende tilgang til visualisering af PD-L1-overekspression af tumorer. Desuden kan denne teknik også anvendes til behandling af PD-L1-positive tumorer ved mærkning af DPA med andre radionuklider, såsom 177Lu og 225Ac. Derfor overvinder DPA-radiomærkningsteknikken ikke kun begrænsningen af IHC-afhængig diagnose, men giver også en ny mulighed for behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der erklæres ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Non-profit Central Research Institute Fund of Chinese Academy of Medical Sciences (nr. 2022-RC350-04) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 og 2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
