Summary
Denne studien utviklet en ikke-invasiv og sanntidsmetode for å evaluere fordelingen av programmert dødsligand 1 i hele kroppen, basert på positronemisjons tomografisk avbildning av [68Ga] D-dodekapeptidantagonist. Denne teknikken har fordeler i forhold til konvensjonell immunhistokjemi og forbedrer effektiviteten ved å identifisere passende pasienter som vil ha nytte av immunkontrollpunktblokkadebehandling.
Abstract
Utviklingen av immunsjekkpunktblokkadebehandling basert på programmert celledødsprotein 1 (PD-1)/programmert dødsligand 1 (PD-L1) har revolusjonert kreftbehandlingen de siste årene. Imidlertid reagerer bare en brøkdel av pasientene på PD-1 / PD-L1-hemmere, på grunn av det heterogene uttrykket av PD-L1 i tumorceller. Denne heterogeniteten gir en utfordring i presis påvisning av tumorceller ved den vanlige immunhistokjemi (IHC) tilnærmingen. Denne situasjonen krever bedre metoder for å stratifisere pasienter som vil ha nytte av immunkontrollpunktblokkadebehandling, for å forbedre behandlingseffekten. Positronutslippstomografi (PET) muliggjør sanntidsvisualisering av hele kroppens PD-L1-uttrykk på en ikke-invasiv måte. Derfor er det behov for utvikling av radiomerkede sporstoffer for å oppdage PD-L1-distribusjon i svulster gjennom PET-avbildning.
Sammenlignet med deres L-kolleger har dextrorotære (D) -peptider egenskaper som proteolytisk motstand og bemerkelsesverdig forlengede metabolske halveringstider. Denne studien designet en ny metode for å oppdage PD-L1-uttrykk basert på PET-avbildning av 68Ga-merket PD-L1-målrettet D-peptid, en D-dodekapeptidantagonist (DPA), i tumorbærende mus. Resultatene viste at [68Ga] DPA spesifikt kan binde seg til PD-L1-overuttrykkende svulster in vivo, og viste gunstig stabilitet samt utmerket bildebehandlingsevne, noe som tyder på at [68Ga] DPA-PET er en lovende tilnærming for vurdering av PD-L1-status i svulster.
Introduction
Oppdagelsen av immunsjekkpunktproteiner var et gjennombrudd i tumorterapi, og har ført til store fremskritt i utviklingen av immunkontrollpunktblokkadebehandling1. Programmert celledød-protein 1 (PD-1) og programmert død-ligand 1 (PD-L1) er potensielle legemiddelmål med flere antistoffer godkjent av Food and Drug Administration (FDA). PD-1 uttrykkes av tumorinfiltrerende immunceller, slik som CD4+, CD8+ T-celler og regulatoriske T-celler. PD-L1 er en av PD-1-ligandene, som overuttrykkes i en rekke tumorceller 2,3. Samspillet mellom PD-1 og PD-L1 inaktiverer PD-1, og undertrykker dermed antitumorimmunresponsen4. Disse funnene tyder på at hemming av PD-L1 kan forbedre drapseffekten av immunceller og eliminere tumorceller5. For tiden er kromogen immunhistokjemi (IHC) den mest brukte tilnærmingen for å identifisere pasienter som mest sannsynlig vil reagere på immunkontrollpunktbehandling 6,7. På grunn av det heterogene uttrykket av PD-L1 i tumorceller kan imidlertid ikke IHC-resultater fra biopsier gi nøyaktig informasjon om PD-L1-uttrykk hos pasienter8. Tidligere studier har rapportert at bare 20% -40% av pasientene får langsiktige fordeler fra immunkontrollpunktblokkadebehandling 1,9,10. Det er derfor et presserende behov for å utvikle en ny metode for å omgå de falske negative resultatene forårsaket av det heterogene uttrykket av disse immunkontrollpunktproteinene.
Molekylær avbildningsteknologi, som positronemisjonstomografi (PET), muliggjør sanntidsvisualisering av hele kroppen på en ikke-invasiv måte, og kan dermed overgå den konvensjonelle IHC-metoden 11,12,13. Radiomerkede antistoffer, peptider og små molekyler er lovende sporstoffer for overvåking av PD-L1-ekspresjon hos kreftpasienter 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. FDA har godkjent tre PD-L1 terapeutiske monoklonale antistoffer: avelumab, atezolizumab og durvalumab26. Immuno-PET-sporstoffer basert på disse antistoffene er godt dokumentert 27,28,29,30,31,32. Kliniske studier i tidlig fase har vist begrenset verdi for klinisk anvendelse på grunn av ugunstig farmakokinetikk30. Sammenlignet med antistoffer viser peptider raskere blod- og organclearance fra friske organer, og kan lett modifiseres kjemisk33. Flere peptider med høy affinitet til PD-1/PD-L1 er rapportert2; WL12 er et rapportert peptid som viser spesifikk binding til PD-L134. Radiomerkede sporstoffer, [64Cu] WL12, [68Ga] WL12 og [18F] FPyWL12, har blitt rapportert å vise høy in vivo spesifikk tumormålrettingsevne, noe som muliggjør høsting av høykvalitetsbilder av PD-L1-uttrykk i svulster 26,35,36,37. Videre har den første in-human evalueringen av radiomerket WL12 vist at [68Ga] WL12 (chelatert av NOTA) har et trygt og effektivt potensial for klinisk tumoravbildning38. På grunn av sin høye hydrofobisitet og høye opptak i den sunne leveren, har WL12 begrenset klinisk bruk. Andre radiolabeling peptider, som TPP1 og SETSKSF, som spesifikt binder seg til PD-L1, har også vist potensiell stabilitet og spesifisitet for å visualisere hele kroppen PD-L1 uttrykk39,40. Imidlertid blir umodifiserte peptider lett nedbrutt av proteaser, og metaboliseres raskt av nyrene. Dekstrorotære (D)-peptider har blitt mye brukt som effektive mediatorer, på grunn av den dårlige stabiliteten til venstrehendte (L)-peptider 41,42,43. D-peptider er hyperresistente mot proteolytisk nedbrytning og har bemerkelsesverdig forlenget metabolsk halveringstid. Sammenlignet med sine L-kolleger viser D-peptider for det meste spesifikke bindingsevner 44,45,46.
Denne studien utviklet en ny metode for å oppdage PD-L1-uttrykk, basert på PET-avbildning av en 68Ga-merket PD-L1-målrettet D-peptid, D-dodekapeptidantagonist (DPA), i en tumorbærende musemodell47. Stabiliteten til [68Ga] DPA ble først studert i fosfatbufret saltvann (PBS) og museserum, hvoretter bindingsaffiniteten til [68Ga] DPA i PD-L1-overuttrykkende svulster ble testet. Deretter ble PET-avbildning utført i glioblastom-xenograft-modeller for å bekrefte om [68Ga]DPA var et ideelt PET-tracer for å overvåke PD-L1-ekspresjon i svulster. Kombinasjonen av PET-avbildning og DPA gir ikke bare en ny tilnærming for å overvinne utfordringer knyttet til det heterogene uttrykket av PD-L1, men legger også grunnlaget for utviklingen av D-peptidbaserte radiotracere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøksprosedyrene ble godkjent av Animal Ethics Committee of Nanjing Medical University eller National Institutes of Quantum Science and Technology. Musforsøk ble strengt utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjene til Komiteen for stell og bruk av forsøksdyr.
1. Peptidsyntese
- Svell 100 mg 4-metylbenzhydrylamin (MBHA) harpiks (lastekapasitet på 0,37 mmol / g) i 1 ml N-metyl-2-pyrrolidon (NMP) i 30 minutter under mild N2 boblende.
- Forbered en fersk lagerbuffer bestående av Fmoc-beskyttede aminosyrer (5,0 ekviV), HCTU (4,9 ekviV) og DIPEA (10,0 ekviV) i 1 ml NMP, og tilsett harpiksen (100 mg). La koblingsreaksjonen fortsette i 1,5-2 timer.
- Forbered debeskyttelsesbuffer bestående av 50% (vol / vol) morfolin i NMP. Vask harpiksen (100 mg) 2 x 30 minutter med 1 ml av debeskyttelsesbufferen i hver vask for å fjerne Fmoc gruppen på amingruppen. Vask harpiksen med diklormetan (DCM; 1 ml) i 1 min, fjern DCM og vask harpiksen på nytt med NMP (1 ml) i ytterligere 1 min. Fjern deretter NMP og vask harpiksen på nytt med DCM i 1 min.
NOTAT: Alle vaskeprosedyrer utføres under mild N2 boblende. Ovennevnte prosedyrer gjentas til den siste aminosyren. - For tilsetning av 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraeddiksyre (DOTA) til peptidet, preaktiver DOTA med N-(3-dimetylaminopropyl)-N-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC · HCl) og N-hydroksysuccinimid (NHS). Inkubere stambufferen til DOTA/EDC · HCl / NHS i et molforhold på 1: 1: 1 i dimetylsulfoksid (DMSO) i 3 timer, med en endelig DOTA-konsentrasjon på 1 M. Deretter tilsettes stambufferen (1 ml) til harpiksen (100 mg), og lar reaksjonen fortsette i 2 timer med forsiktigN2-bobler.
MERK: 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-trieddiksyre (NOTA) kan også brukes som en chelator for 68Ga-kompleksasjon. De samme prosedyrene kan brukes for NOTA-kobling. - Skyll harpiksen grundig fra toppen med DCM og påfør et vakuum for å fjerne gjenværende reaksjonsoppløsning samtidig. Skyll harpiksen 3x med DCM (1,5 ml), og skyll deretter med MeOH (1,5 ml) for å krympe harpiksen. Sett harpiksen under nitrogen over natten, eller under høyt vakuum i minst 4 timer, til harpiksen blir tørr.
- Plasser den tørkede DPA-peptidholdige harpiksen i en 2 ml polypropylenbeholder med en skrukork. Tilsett passende spaltningscocktail (95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2Oi volum, 1 ml/100 mg harpiks) og forsegl beholderen godt med en skrukork. Beveg reaksjonen forsiktig på en orbital shaker i en avtrekkshette ved 20-25 °C i 2 timer.
FORSIKTIG: Forbered trifluoreddiksyre (TFA) i en avtrekkshette iført verneutstyr, på grunn av sin svært etsende natur. - Fjern det meste av TFA ved fordampning under nitrogen i avtrekksdekselet. Fell ut peptidene ved å tilsette dietyleter (~1,5 ml/100 mg harpiks).
- Vortex blandingen for å triturere peptidene og sentrifugen ved romtemperatur (10.000 × g, 5 min). Hell oppløsningsvæsken forsiktig ut av beholderen. Gjenta trinn 1.7-1.8.
- Lufttørk resten i åpen beholder i 10 minutter. Tilsett 50 % (vol/vol) vandig acetonitril og virvel i 1-2 s for å løse opp produktene (1 ml/100 mg harpiks).
- Fjern harpiksen ved å filtrere blandingen, og vask deretter harpiksen 2x med 0,2 ml 50% (vol / vol) vandig acetonitril. Bland filtratene for høyytelses væskekromatografi (HPLC) rensing. Bruk følgende HPLC-betingelser. Kolonne: YMC-Triat-C18 (4,6 mm innvendig diameter [i.d.], 150 mm, 5 mm); løsningsmiddelgradient: løsningsmiddel A-avionisert vann; løsningsmiddel B-acetonitril (0,1% TFA); strømningstid: 20 min, med acetonitril fra 10% til 90%; strømningshastighet: 1 ml/min.
- Frys de oppsamlede HPLC-eluentene over natten ved -80 °C og lyofiliser (-50 °C og <1 pa). For radiomerking oppløses det faste peptidet i natriumacetatbuffer (100 mM, pH 5,0) ved en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml som en stambuffer.
2. 68Ga radiomerking
MERK 68Ga ble generert internt på Nanjing First Hospital (Nanjing, Kina) ved hjelp av en 68Ge/68Ga generator.
- Pipette 5 μL stambuffer i en 1,5 ml polypropylenbeholder med skruehett. Tilsett 200 MBq [68GaCl3 (400 μL) i beholderen.
- Vortex blandingen i 5 s. Mål pH ved hjelp av pH-teststrimler. Juster pH til 4-4,5 med NaOH (0,1 M).
MERK: En passende pH er kritisk for kompleksdannelse mellom 68Ga og DOTA. - Inkuber løsningen ved romtemperatur i 5-10 minutter. Utsett reaksjonsblandingen for radio-HPLC for radiomerking av utbytteanalyse under følgende betingelser: kolonne: YMC-Triat-C18 (4,6 mm i.d., 150 mm, 5 mm); løsningsmiddelgradient: løsningsmiddel A-avionisert vann; løsningsmiddel B-acetonitril (0,1% TFA); strømningstid: 20 min, med acetonitril fra 10% til 90%; strømningshastighet: 1 ml/min.
MERK: Radio tynnsjiktskromatografi (TLC) kan brukes som en alternativ tilnærming for å undersøke radiomerkingsutbyttet. Den foreslåtte TLC-elueringsbufferen er 0,1 MNa 3C6H5O7, pH 4.
3. Stabilitetstest av sporstoffer
- Tracer stabilitetstest i PBS
- Legg til [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, i NaOAc) til PBS (990 μL). Inkuber ved 37 °C i 1, 2 og 4 timer ved lett omrøring.
- Samle 200 mikrol av løsningen på hvert tidspunkt. Injiser det i radio-HPLC for analyse.
- Tracerstabilitet i museserum
- Tilsett [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, i NaOAc) i museserumet (90 μL, tilberedt). Inkuber ved 37 °C i 1, 2 og 4 timer ved lett omrøring.
- Samle 20 mikrol av oppløsningen på hvert tidspunkt. Tilsett MeCN og vann (100 μL, 1:1, v/v).
- Sentrifuger blandingen i 10 minutter (5000 × g, 25 °C). Analyser supernatanten ved hjelp av radio-HPLC.
4. Analyse av PD-L1-ekspresjon ved flowcytometri
- Forbered kulturmedium ved å supplere RPMI-1640 medium med 10% (vol / vol) føtal bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (vol / vol). Resuspender U87MG-cellene i kulturmedium, og frø i 12-brønnsplater med en tetthet på 105 celler / brønn. Plasser cellene i en inkubator (5% CO2, 37 ° C) og kultur i minst 24 timer uten å forstyrre.
- Vask cellene med 0,5 ml PBS og tilsett 250 μL trypsin-EDTA (0,25%). Plasser cellene tilbake i inkubatoren (5% CO2, 37 ° C) i 2 minutter.
- Tilsett 1 ml kulturmedium for å stoppe celledissosiasjonen. Tilsett medium i cellene for å løsne dem fra oppvasken ved å pipettere opp og ned og samle dem i 1,5 ml rør. Sentrifuger cellene i 5 minutter (100 × g).
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml PBS. Sentrifuger cellene i 5 minutter (100 × g). Gjenta dette trinnet en gang til.
- Fortynn fluoresceinisotiocyanatet (FITC)-konjugert PD-L1-antistoff med 3 % bovint serumalbumin (BSA) til 20 nmol/L. Legg til cellene og inkuber ved 4 °C i 1 time.
- Sentrifuger cellene i 5 minutter (100 × g), etterfulgt av vask med kald PBS to ganger. Analyser PD-L1-positive celler ved hjelp av et flowcytometer og analyseprogramvare.
5. Immunocytokjemi
- Frø U87MG-cellene i glassbunncellekulturretter (35 mm) med en tetthet på 2,5 × 105 celler per brønn. Når 60% sammenløp er nådd, aspirer kulturmediet og tilsett 1 ml PBS. Rist forsiktig flere ganger og aspirer. Utfør vasketrinn 3x.
- Tilsett 500 μL 4% paraformaldehyd til oppvasken. Plasser cellene i romtemperatur og fiks i 30 minutter.
- Vask cellene 3x med PBS. Tilsett 1 ml 3% BSA (vekt/vol, i PBS) og blokker de faste cellene i 2 timer ved romtemperatur.
- Fjern 3% BSA og inkuber cellene direkte med primært anti-PD-L1 antistoff (mAb, 1:100, fortynnet i 3% BSA) over natten ved 4 ° C.
MERK: Etter å ha blokkert cellene med BSA, må du ikke vaske med PBS. - Vask cellene 3x med 3% BSA-buffer. Inkuber cellene med FITC-konjugert anti-humant IgG Fc sekundært antistoff (1:500, fortynnet i PBS) i 1 time.
- Vask cellene 3x med PBS. Tilsett 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) til cellene og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask de fargede cellene 3x med PBS, og observer ved hjelp av konfokalfluorescensmikroskop.
6. Cellulært opptak og inhiberingseksperiment
- Eksperiment med cellulært opptak
- Dyrk U87MG-cellene i 12-brønnsplater til 80% sammenløp er nådd. Fjern mediet og vask cellene med 0,5 ml PBS.
- Fortynn [68Ga] DPA i fersk medium til en konsentrasjon på 74 KBq / ml. Tilsett 0,5 ml av den fortynnede [68Ga]dpa-bufferen til hver brønn.
- Inkuber cellene med [68Ga]DPA ved 37 °C i forskjellige varigheter (10, 30, 40 og 120 min). Aspirer mediet med en pipette. Vask cellene med PBS (0,5 ml) tre ganger.
- Legg til NaOH-løsning (0,5 M, 300 μL per brønn) for å lyse cellene. Etter 30 s, samle de viskøse cellelysatene i 1,5 ml rør.
- Vask platen med 0,4 ml PBS to ganger. Samle vaskeløsningen i ovennevnte 1,5 ml rør.
- Start den innebygde datamaskinen til den automatiske gamma-telleren; Sett rørene inn i den innebygde hyllen. Etter å ha lastet alle prøvene på transportbåndet, trykk på START-knappen. Resultatene beregnes i den interne programvaren. Avlesningen registrerer forfallskorrelerte antall per minutt (CPM) for hvert rør.
- Konkurransedyktig bindingsanalyse
- Dyrk U87MG-cellene i 12-brønnsplater til 80% sammenløp er nådd. Fjern mediet og vask cellene med 0,5 ml PBS.
- Fortynn [68Ga] DPA i fersk medium til en konsentrasjon på 74 KBq / ml. Løs opp en passende mengde BMS202-forbindelser i 10% DMSO for å gi en konsentrasjon på 10 mM (400 μL).
- Fortynn 4 μL av 10 mM BMS202 i 396 μL PBS for å oppnå en konsentrasjon på 100 μM. Gjenta dette trinnet for å gi forskjellige konsentrasjoner av BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM og 1 pM).
- Tilsett 0,5 ml av den fortynnede [68Ga]DPA bufferen til hver brønn (0,37 MBq per brønn). Legg til 5 μL av BMS202-løsningene til hver brønn (tre brønner for hver konsentrasjon). Inkuber cellene i en celleinkubator ved 37 °C i 120 minutter.
- Aspirer mediet med en pipette. Vask cellene med 3 x 0,5 ml PBS.
- Tilsett NaOH-løsningen (0,5 M, 300 μL per brønn) for å lyse cellene. Etter 30 s, samle de viskøse cellelysatene i 1,5 ml rør. Vask platen med 2 x 0,4 ml PBS.
- Samle vaskeløsningen i ovennevnte 1,5 ml rør. Sett rørene inn i den innebygde hyllen til den automatiske gamma-telleren.
- Følg de samme prosedyrene som trinn 6.1.6.
7. PET-avbildning
MERK: Utfør små dyr PET-avbildning, ved hjelp av en mikro PET-skanner som gir 159 tverrgående aksiale seksjoner fordelt 0,796 mm fra hverandre (senter til sentrum), med et horisontalt synsfelt på 10 cm og et aksialt synsfelt på 12,7 cm. Alle data som samles inn i listemodus er organisert i tredimensjonale sinogrammer. Fourieren settes deretter sammen til todimensjonale sinogrammer (ramme × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- Bruk hann, 5-8 uker gamle BALB/C nakenmus i denne studien. Samle U87MG-cellene etter trinn 4.1-4.4 og aspirer cellene til en 0,5 ml sprøyte. Injiser cellene subkutant i musene (1 × 106 celler per svulst, to svulster per mus). Overvåk tumorvekst etter injeksjon til tumorvolumet er 100-300 mm3.
- Bedøv musene med 1%-2% (v/v) isofluran (1 ml/min). Slå på varmeapparatet og hold dyresengen til PET ved 37 °C.
- Sett de bedøvede musene i riktig posisjon på dyresengen på PET-maskinen. Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre tørrhet.
FORSIKTIG: Hold musene i utsatt stilling for å unngå død under skanning. Under hele avbildningsprosessen administreres isofluran flow (1,0 ml/min) via nesen ved hjelp av et forhåndsinstallert rør. - Juster dyresengens posisjon via kontrollpanelet. Injiser sporstoffene (10-17 MBq/100-200 μL) intravenøst gjennom et forhåndsinstallert halevenekateter.
- Opprette en skannearbeidsflyt på en vertsdatamaskin ved hjelp av den refererte programvaren (se Materialfortegnelse) Opprett en studiemappe og angi anskaffelsesprotokollen i henhold til produsentens protokoll. Utfør dynamiske skanninger (60 min for hver mus) på alle mus i 3D-listemodus.
- Definer en histogramprotokoll og en rekonstruksjonsprotokoll etter produsentens protokoll. Bruk Hannings filter med en Nyquist-avskjæring på 0,5 syklus/piksel for å rekonstruere PET-dynamiske bilder (25-30 min og 55-60 min) gjennom filtrert bakprojeksjon. Generer MIP-bilder (maksimal intensitetsprojeksjon) for alle mus.
- Kombiner protokollene i en arbeidsflyt, og kjør arbeidsflyten. Analyser de resulterende tredimensjonale bildene ved hjelp av programvaren, etter produsentens protokoll.
MERK: Bruk simuleringsprogramvaren til å velge volumene av interesse. Radioaktivitet henfallskorrigeres til injeksjonstiden og presenteres som prosentandel av total injeksjonsdose/per gram vev (% ID/g).
8. Ex vivo biodistribusjon
- Administrer [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) til U87MG-bærende BALB/C nakenmus gjennom injeksjon i halevene. Bedøv musene med 1% -2% (v / v) isofluran (1 ml / min), og ofre deretter tre mus via cervikal dislokasjon etter injeksjon i 5, 30, 60 og 120 minutter.
MERK: Individene som demonstrerer denne prosedyren bør trenes i de tekniske ferdighetene til cervikal dislokasjon for å sikre at bevissthetstapet raskt induseres. Dette vil sikre at eutanasiprosedyrene i dette eksperimentet blir utført på en human måte. - Etter at døden er bekreftet, åpne musens brystvegg. Deretter åpner du hjertet. Bruk en 1 ml sprøyte for å trekke blod; klem blodet fra sprøyten inn i et radioimmunoassay (RIA) rør (13 mm i diameter) for gammatelleren.
- Excise de store organer og svulster og plassere dem i RIA rør (13 mm i diameter) for gamma telleren. Store organer inkluderer totalt blod, hjerte, thymus, lever, milt, bein, mage, nyrer, muskel, intestinal lymfeknute, tynntarm, bukspyttkjertel, testis, hjerne og lunger. Vei alle organene.
- Mål radioaktiviteten i de innsamlede organene ved hjelp av en autogammateller og henfallskorrigere verdiene. Beregn prosentandel injisert dose per gram vått vev (% ID/g).
9. Immunhistokjemi
- Samle gliomvevet og vask dem 3x med PBS. Ha det ferske vevet i 4 % paraformaldehyd og fikser det over natten ved 4 °C.
- Legg de faste vevene i parafin og seksjoner dem til en tykkelse på 10 μm. Plasser seksjonene i en inkubator (60 ° C) og inkuber i 2 timer. Avvoks og hydratiser seksjonene ved å inkubere i 10 minutter hver i følgende: xylen (to ganger), absolutt alkohol, 95% alkohol, 90% alkohol, 80% alkohol, 75% alkohol.
- Sett seksjonene i 0,01 M natriumsitrat og varm dem opp til 92-95 °C. Hold temperaturen i 40 min for å oppnå antigenuthenting.
- Tilsett 200 μLH2O2-løsning(3%) til seksjonene og inaktiver endoperoksidasene i 10 minutter ved romtemperatur. Blokker de ikke-spesifikke stedene ved behandling med 3% BSA i 2 timer ved romtemperatur.
- Inkuber snittene i primært anti-PD-L1 antistoff (mAb, 1:100, fortynnet i 3 % BSA) over natten ved 4 °C.
MERK: Etter blokkering med BSA, må du ikke vaske med PBS. - Vask seksjonene 3x med PBS. Inkuber seksjonene med HRP-merket geit antikanin sekundært antistoff (1:500, fortynnet i PBS) ved romtemperatur i 1 time.
- Vask cellene 3x med PBS. Tilsett 200 μL 3,3-diaminobenzidin (DAB) arbeidsløsning (løsning A: løsning B: løsning C = 1: 1: 18) til seksjonene og inkuber i 5 minutter i mørket.
- Vask seksjonene 3x med PBS. Tilsett 500 μL hematoksylinoppløsning (100%), og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Vask seksjonene med vann i 30 s. Sett seksjonene i differensieringsløsning (75% alkohol: HCL = 99: 1) i 30 s. Vask seksjonene med vann i 1 min.
- Dehydrer prøvene ved sekvensiell inkubering med 75% alkohol, 80% alkohol, 90% alkohol, 95% alkohol, absolutt alkohol og xylen (to ganger) (10 minutter hver). Monter alle seksjonene ved hjelp av nøytral harpiks og observer dem under et optisk mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga]DPA radiomerking og stabilitet
Modellpeptidet, DPA, er en effektiv PD-L1-antagonist. DOTA-DPA ble oppnådd med >95% renhet og et utbytte på 68%. Massen av DOTA-DPA er eksperimentelt observert ved 1 073,3 ([M+2H]2+). 68Gallium regnes som et egnet radionuklid for å merke peptider for PET-avbildning, og ble derfor valgt for denne studien. For radiomerket DPA med 68Ga (halveringstid: 68 min) ble DOTA-PEG3-DPA syntetisert (figur 1A). DOTA ble brukt som chelator for 68Ga radiomerking. Til plass DOTA og DPA ble PEG3 brukt som linker. [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (referert til som [68Ga]DPA i følgende tekst) viste høyt radiokjemisk utbytte (>95%) og radiokjemisk renhet (>95%) (tabell 1). En tracerstabilitetstest ble også utført med HPLC, og resultatene viste at [68Ga]DPA hadde stor stabilitet både i PBS og museserum. 68Ga-dekomponering eller peptidhydrolyse ble ikke påvist etter 4 timers inkubasjon ved 37 °C (figur 1B).
Ekspresjon av PD-L1 i U87MG celler
En tidligere studie viste at et økt uttrykk av PD-L1 korrelerte med dårlig pasientoverlevelse i glioblastomtumorer, noe som indikerer at PD-L1 kan være en bemerkelsesverdig prognostisk biomarkør og terapeutisk mål i glioblastom48. Derfor ble en human glioblastomcellelinje, U87MG, brukt til å etablere en tumormodell for å bestemme effekten av [68Ga] DPA i PET / CT for PD-L1 tumoravbildning. Flowcytometriresultatene antydet at ca. 60 % av U87MG-cellene var PD-L1-positive (figur 2A). Videre bekreftet immunfluorescerende farging det sterke uttrykket av PD-L1 i U87MG-cellene (figur 2B). Sammen viste disse dataene at U87MG-cellelinjen var egnet for denne studien.
Cellulært opptak og spesifisitet av [68Ga]DPA
Opptaket av [68Ga]DPA av U87MG-celler presenterte et tidsavhengig mønster. Når en PD-L1-hemmer, BMS202, ble brukt som blokkeringsmiddel, ble bindingsdelen og opptaket av [68Ga]DPA signifikant redusert (figur 3A). En konkurrerende bindingsanalyse undersøkte videre bindingsaffiniteten (Ki) til BMS202 til U87MG-cellene. Estimert bindingsaffinitet var 43,8 ± 8,6 nmol/l for BMS202 når [68Ga]DPA ble brukt som konkurrent (figur 3B).
[68Ga]DPA PET-avbildning av tumormodeller
PET-avbildning av [68Ga]DPA ble utført i U87MG tumorbærende BALB/C nakenmus. [68Ga] DPA ble gitt ved intravenøs injeksjon til U87MG-svulsten vokste til 100 mm3. Helkropps PET-bilder viste høy [68Ga]DPA akkumulering i svulsten etter 30 og 60 min injeksjon, og viste høyest opphopning i nyre og blære (figur 4A). For å bekrefte om [68Ga]DPA spesifikt akkumulert i PD-L1-positive svulster, ble en annen musemodell med PanNET-cellelinjen Bon-1 brukt som negativ kontroll. Et parallelt eksperiment viste liten [68Ga] DPA-akkumulering i Bon-1-svulster 60 minutter etter injeksjon (figur 4B).
For å klargjøre denne forskjellen ble immunhistokjemisk farging utført for å analysere PD-L1-uttrykk i tumorvev. Resultatene viste at U87MG-cellene hadde betydelig PD-L1-uttrykk (figur 5A,C), men ikke Bon-1-svulsten (figur 5B,C). Disse dataene var konsistente med PET-resultatene. Derfor er det mulig at de forskjellige tumorcellevekststatusene resulterte i forskjellig PD-L1-uttrykk (f.eks. vevnekrose). For å verifisere dette ble det utført farging av hematoksylin og eosin (H&E). Som forventet ble det observert en lignende cellemorfologi mellom de to tumorvevene (figur 5D).
Ex vivo biodistribusjon av [68Ga]DPA i U87MG tumorer
Ex vivo biodistribusjonsstudien ble også utført med U87MG-bærende mus (tabell 2). Resultatene viste en rask clearance i blod og de fleste analyserte organer, inkludert hjerte, lever, lunge og muskel. Nyrene akkumulerte den høyeste mengden radioaktivitet og viste en clearancerate på 0,12 % ID/(g∙min) fra 5 min til 120 min. Svulsten viste opptak av det nest høyeste sporstoffopptaket på alle tidspunkter. I tillegg, fra 5 minutter til 60 minutter etter injeksjon, presenterte svulsten en lavere tracerclearance på 0,027% ID/(g∙min). For blod var clearance rate 0,069 % ID/(g∙min), mens for muskel var clearance rate 0,037 % ID/(g∙min).
Figur 1: [68Ga]DPA radiomerking og stabilitet. (A) Den kjemiske strukturen til [68Ga]DPA og den skjematiske fremstillingen av dens binding til PD-L1 som uttrykker tumorceller. (B) HPLC-kurver som viser radioaktiviteten til [68Ga]DPA etter inkubasjon med PBS eller museserum i 0,5, 2 og 4 timer. Denne figuren ble modifisert fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodekapeptidantagonist; PD-L1 = programmert død-ligand 1; PBS = fosfatbufret saltvann; HPLC = væskekromatografi med høy ytelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekspresjon av PD-L1 i U87MG cellelinje. (A) Ekspresjonen av PD-L1 i U87MG cellelinjen ble målt gjennom flowcytometrianalyse. (B) Ekspresjonen av PD-L1 i U87MG-celler ble målt ved immunfluorescensfargeanalyse. Skala bar = 100 μm. Denne figuren ble modifisert fra Hu et al.47. Forkortelser: PD-L1 = programmert død-ligand 1; SSC = side spredning; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellulært opptak og hemming av [68Ga]DPA. (A) Opptak av U87MG-celler når inkubert med [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) eller [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) + BMS202 (100 μmol/l) i forskjellige varigheter. (B) Konkurransedyktig binding av [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) til U87MG-cellene etter inkubasjon med BMS202. Ki-verdien vises i panelet. Denne figuren ble modifisert fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodekapeptidantagonist; %AD = administrert dose (med hensyn til bindingsdelen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: PET-avbildning av [68Ga]DPA i PD-L1-overuttrykkende U87MG-svulster. (A,B) PET-CT-bilder som viser fordelingen av [68Ga]DPA hos U87MG-bærende mus (A) og Bon-1-bærende mus (negativ kontroll, B) etter intravenøs injeksjon (~18,5 MBq) i 30 minutter og 60 minutter. Representative maksiumintensitetsprojeksjon (MIP) (øverste panel) og tverrgående PET-CT-bilder (nederste panel) presenteres. Tumorposisjonene er preget av hvite stiplede sirkler. Denne figuren er modifisert fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodekapeptidantagonist; PD-L1 = programmert død-ligand 1; PET-CT = positronemisjonstomografi-computertomografi; MIP = maksium-intensitetsprojeksjon; p.i. = etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Immunhistokjemisk analyse av [68Ga]DPA-behandlede svulster. (A,B) Helseksjons immunhistokjemiske bilder av PD-L1 i (A) U87MG og (B) Bon-1 svulster. (C) Forstørrede bilder av de merkede områdene i A og B. (D) H&E-farging av U87MG og Bon-1 tumor. Skalastenger = 100 μm (C,D). Denne figuren ble modifisert fra Hu et al.47. Forkortelser: DPA = dodekapeptidantagonist; PD-L1 = programmert død-ligand 1; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sporstoffer | [68Ga] DPA |
| Radiokjemisk utbytte (%) | >95 |
| Molar aktivitet (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| Radiokjemisk renheta (%) | >95 |
Tabell 1: Radiomerking og kvalitetskontroll av [68Ga]DPA. Radiokjemisk utbytte, molar aktivitet og radiokjemisk renhet på [68Ga] DPA. Data er representert som gjennomsnitt ± SD (n = 7). Denne tabellen ble modifisert fra Hu et al.47. Forkortelse: DPA = dodekapeptidantagonist. enRadiokjemisk renhet på [68Ga]DPA ble analysert ved omvendt fase HPLC under en optimalisert tilstand: 1) kolonne: YMC-Triat-C18 (4,6 mm i.d., 150 mm, 5 mm); 2) løsningsmiddelgradient: løsningsmiddel A-avionisert vann; løsningsmiddel B-acetonitril (0,1% trifluoreddiksyre); strømningstid: 20 min, med acetonitril fra 10% til 90%; strømningshastighet på 1 ml/min.
| [68Ga] DPA | ||||||||
| 5 min | 30 min | 60 min | 120 min | |||||
| blod | 3.89 | ±0,43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0,02 | 0.05 | ±0,01 |
| hjerte | 1.19 | ±0,39 | 0.52 | ±0,33 | 0.06 | ±0,02 | 0.05 | ±0,02 |
| lever | 1.06 | ±0,26 | 0.59 | ±0,43 | 0.19 | ±0,02 | 0.16 | ±0,04 |
| milt | 0.98 | ±0,14 | 0.68 | ±0,67 | 0.14 | ±0,06 | 0.09 | ±0,03 |
| lunge | 1.64 | ±0,42 | 1.03 | ±0.9 | 0.13 | ±0,05 | 0.09 | ±0,02 |
| nyre | 19.23 | ±1,95 | 16.13 | ±1,51 | 11.5 | ±0,44 | 5.2 | ±0,31 |
| mage | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0,35 | 0.08 | ±0,01 | 0.08 | ±0,03 |
| Intestinal | 0.72 | ±0,27 | 0.47 | ±0,35 | 0.08 | ±0,02 | 0.06 | ±0,03 |
| bukspyttkjertel | 1.88 | ±0,28 | 0.77 | ±0,75 | 0.16 | ±0,03 | 0.13 | ±0,03 |
| muskel | 2.21 | ±0,27 | 0.71 | ±0,37 | 0.18 | ±0,02 | 0.14 | ±0,04 |
| bein | 2.18 | ±0.11 | 0.85 | ±0,51 | 0.26 | ±0,09 | 0.14 | ±0,06 |
| hjerne | 0.19 | ±0,04 | 0.11 | ±0,08 | 0.03 | ±0,01 | 0.02 | ±0,01 |
| svulst | 4.5 | ±0,32 | 3.77 | ±0,27 | 2.99 | ±0,03 | 0.89 | ±0,19 |
| fett | 2.09 | ±0,49 | 0.81 | ±0.12 | 0.27 | ±0,07 | 0.1 | ±0,07 |
Tabell 2: Biodistribusjon av [68Ga]DPA hos U87MG tumorbærende mus etter administrering i ulik varighet (n = 3 per tidspunkt). Denne tabellen er modifisert fra Hu et al.47. Forkortelse: DPA = dodekapeptidantagonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinnene beskrevet i denne metoden inkluderer effektiv merking av 68Ga til DPA og valg av et passende tidsvindu for PET-avbildning, som perfekt må samsvare med det farmakodynamiske mønsteret for DPA i svulsten.
I motsetning til IHC muliggjør PET-avbildning sanntidsdeteksjon av PD-L1-uttrykk for hele kroppen på en ikke-invasiv måte, noe som tillater visualisering av hvert positivt område i en heterogen tumor 6,7. Peptider ble valgt som ligander for å unngå ulempene med antistoffer og små molekyler. Antistoffer med store molekylvekter har generelt lange sirkulerende halveringstider, noe som medfører høyere toksisitet for friske organer. Clearance av små molekyler er vanligvis for rask til å oppnå den nødvendige tumorretensjonen. Molekylvekten av peptider varierer mellom antistoffer og små molekyler. Dette gjør det mulig for peptidbaserte radiotracere å oppnå både langvarig tumorretensjon og god vevspenetrasjon med minimal toksisitet 13,49,50,51,52,53. Det er viktig at nytten av D-peptidet DPA, i stedet for de ofte rapporterte L-peptidene, gir [68Ga] DPA en bemerkelsesverdig forlenget metabolsk halveringstid. Videre er DPA positivt ladet og hydrofil in vivo, og har derfor høy oppløselighet og kan unngå uspesifikk målretting i blod, noe som letter genereringen av PET-bilder med høy bildekvalitet.
Spesielt krever vellykket 68Ga radiomerking en spesifikk pH og ingen interferens fra overgangsmetallioner, slik som Cu (II) og Fe (III) kationer. I noen tilfeller fører Cu2+ -forurensningen til lavt radiokjemisk utbytte. Derfor er det viktig å sikre at alle beholdere og pipettespisser ikke er forurenset. I tillegg ble U87MG i denne metoden brukt til tumorinokulering. Selv om PD-L1-uttrykk i U87MG xenotransplantater ble verifisert i tidligere studier, varierer uttrykket mellom individuelle dyr. Derfor varierte det absolutte opptaket av sporstoffet i U87MG-svulstene på tvers av individuelle mus. For å sikre effektivt sporopptak i svulstene må dyr med passende tumorstørrelse (500 mm3 < volum < 100 mm3) velges for PET-skanning.
En av begrensningene til [68Ga] DPA er at bindingsaffiniteten til DPA til PD-L1 er relativt lav sammenlignet med flere andre PD-L1-målrettede peptider, for eksempel WL12, noe som gjør den uegnet for svulster med relativt lavt PD-L1-uttrykk26,47. Videre modifikasjon av D-peptidet vil forbedre dets spesifikke bindingskapasitet. I tillegg, for å forsterke avbildningseffekten av [68Ga]DPA, kan formuleringen av injeksjonsstrategien optimaliseres, for eksempel ved samtidig injeksjon av umerket DPA før [68Ga]DPA for å blokkere de ikke-spesifikke bindingsstedene 54,55,56.
Avslutningsvis utviklet denne studien en ikke-invasiv og sanntidsmetode for å spore PD-L1-distribusjon i hele kroppen av levende dyr ved bruk av [68Ga] DPA som radiotracer. Resultatene viste en relativt høy, in vivo spesifikk bindingsaffinitet, gunstig stabilitet og utmerket bildekapasitet på [68Ga] DPA, noe som tyder på at [68Ga] DPA-PET er en lovende tilnærming for å visualisere PD-L1-overuttrykkende svulster. Videre kan denne teknikken også brukes til behandling av PD-L1 positive svulster ved merking av DPA med andre radionuklider, for eksempel 177Lu og 225Ac. Derfor overvinner DPA-radiomerkingsteknikken ikke bare begrensningen av IHC-avhengig diagnose, men gir også et nytt alternativ for behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende interesser er erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Non-profit Central Research Institute Fund of Chinese Academy of Medical Sciences (nr. 2022-RC350-04) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 og 2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
