Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة لتحديد توافق حبوب اللقاح وعدم التوافق في أصناف الحمضيات.
Abstract
تستخدم الحمضيات عدم التوافق الذاتي القائم على S-RNase لرفض حبوب اللقاح الذاتية ، وبالتالي تتطلب أشجار الملقحات القريبة للتلقيح والتسميد الناجحين. ومع ذلك ، فإن تحديد الأصناف المناسبة لتكون بمثابة ملقحات عملية تستغرق وقتا طويلا. لحل هذه المشكلة ، قمنا بتطوير طريقة سريعة لتحديد أصناف الحمضيات المتوافقة مع التلقيح والتي تستخدم الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز وتلطيخ الأنيلين الأزرق. يتم تحديد توافق حبوب اللقاح بناء على تحديد الأنماط الجينية S عن طريق استخراج الحمض النووي الكلي وإجراء فحوصات التنميط الجيني القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية محددة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم جمع الأنماط بعد 3-4 أيام من التلقيح اليدوي ، ويتم إجراء تلطيخ أزرق الأنيلين. أخيرا ، يتم ملاحظة حالة نمو أنابيب حبوب اللقاح باستخدام مجهر مضان. يمكن إثبات توافق حبوب اللقاح وعدم توافقها من خلال ملاحظة ما إذا كان نمو أنبوب حبوب اللقاح طبيعيا أم مكبوتا ، على التوالي. نظرا لبساطتها وفعاليتها من حيث التكلفة ، تعد هذه الطريقة أداة فعالة لتحديد توافق حبوب اللقاح وعدم توافق أصناف الحمضيات المختلفة لإنشاء مجموعات عدم التوافق وعلاقات عدم التوافق بين الأصناف المختلفة. توفر هذه الطريقة معلومات أساسية للاختيار الناجح لأشجار الملقحات المناسبة ، وبالتالي تسهل إنشاء بساتين جديدة واختيار الآباء المناسبين لبرامج التربية.
Introduction
عدم التوافق الذاتي (SI) هو آلية يتم التحكم فيها وراثيا موجودة في حوالي 40٪ من أنواع كاسيات البذور. في هذه العملية ، ترفض المدقة حبوب اللقاح من نبات له نفس النمط الوراثي SI ، وبالتالي تمنع الإخصاب الذاتي 1,2. Ma jia pummelo هو نوع محلي في مقاطعة Jinagsu ، الصين ، مع الصفات الممتازة للفاكهة الوردية الكبيرة ، ومحتوى العصير الغني ، والطعم الحلو والحامض ، وقشر سميك3. على الرغم من أن SI يعزز التهجين ، إلا أنه يؤثر سلبا على محصول وجودة الثمار4 ويتطلب أشجار ملقحات مناسبة ذات أنماط وراثية مميزة من SI للحصول على معدلات موثوقة لتحديد الفاكهة وإنتاجية عالية. في الوقت الحاضر ، هناك نوعان رئيسيان من SI ، عدم التوافق الذاتي البوغي (SSI) ، ويمثله Brassicaceae ، وعدم التوافق الذاتي المشيجي (GSI) ، ويمثله Rosaceae و Papaveraceae و Rutaceae و Solanaceae5،6،7،8.
الحمضيات هي واحدة من أهم محاصيل الفاكهة في العالم. تم العثور على نظام GSI القائم على S-RNase في العديد من مدخلات الحمضيات ويؤثر سلبا على معدل تكوين الفاكهة9. في هذا النظام ، يتم التحكم في SI بواسطة موضع S ، وهو موضع واحد متعدد الأشكال مع أليلين معقدين يحملان محددات المدقة S ومحددات حبوب اللقاحS 7. المحدد الأنثوي هو S ribonuclease (S-RNase) ، والمحدد الذكري هو S locus F-box (SLF) 7. تفرز خلايا المدقة بروتينات S-RNase. يتم التعرف على S-RNases غير الذاتية بواسطة بروتينات SLF ، مما يؤدي إلى انتشار وتدهور S-RNases غير الذاتي بواسطة مسار البروتيازوم 26S. في المقابل ، فإن S-RNases الذاتية قادرة على تجميع وتثبيط نمو أنبوب حبوب اللقاح (PT) لأنها تتهرب من بروتينات SLF ، وبالتالي ، يتم منعها من الانتشار في كل مكان10،11،12،13.
هنا ، نبلغ عن تقنية في الجسم الحي مفيدة لتحديد الأنماط الجينية S ودرجات توافق حبوب اللقاح وعدم توافقها. يتضمن البروتوكول استخراج الحمض النووي الكلي من الأوراق والتنبؤ بالنمط الجيني S باستخدام الاشعال الخاصة ب S. علاوة على ذلك ، يوفر تلطيخ الأنيلين الأزرق والفحص المجهري الفلوري متبوعا بالتلقيح اليدوي دليلا على درجة التوافق وعدم التوافق. كما تم تكييف إجراء التلقيح شبه في الجسم الحي ، والذي يتضمن التلقيح اليدوي للزهور في المختبر14,15 ، لتقييم درجات التوافق الذاتي وعدم التوافق. ومع ذلك ، فقد استخدمنا أيضا التلقيح الميداني متبوعا بتعبئة الزهور لتجنب التلوث من حبوب اللقاح غير المرغوب فيها للسماح لأنابيب حبوب اللقاح بالتطور في الظروف الطبيعية. هذا البروتوكول بسيط ومباشر ويوفر المعلومات اللازمة للاختيار الناجح لأشجار الملقحات المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير لتلطيخ الأنيلين الأزرق
- قم بإعداد الكواشف والأدوات التالية للتجربة: فرشاة الملقحات ، وملاقط ، وقلم رصاص ، وورق كبريتات ، وكيس تلقيح ، وأكياس قفل مضغوط ، ومشابك ورق ، وفورمالديهايد ، وحمض الخليك الجليدي ، وإيثانول مطلق ، وأنابيب طرد مركزي ، وملقط ، وقطارات غراء ، وشرائح زجاجية ، وأغطية ، ومشارط ، وبولي إيثيلين جلايكول.
- تحضير وسط إنبات في المختبر يحتوي على 0.02٪ MgSO4 ، 0.01٪ KNO 3 ، 0.03٪ Ca(NO 3)2 ، 0.01٪ H 3 BO 3 ، 20٪ PEG-4000 ، و 15٪ سكروز. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.0-6.2 باستخدام KOH. استخدم محرك مغناطيسي حيث يصعب إذابة PEG-4,000.
- تحضير محلول Carnoy المثبت ، وهو الإيثانول المطلق وحمض الخليك الجليدي الممزوج بنسبة 3: 1. قم بإعداد محلول تثبيت FAA ، وهو 40٪ فورمالديهايد ، 80٪ إيثانول ، وحمض الخليك الجليدي (1: 8: 1). تحضير 4 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ومحلول أزرق الأنيلين ، وهو 0.1٪ أزرق أنيلين في 0.1 M K3PO4. استخدم زجاجة كهرمانية لتخزين محلول الأنيلين الأزرق لأنه حساس للضوء.
2. جمع حبوب اللقاح
- تعرف على فترة ازدهار الأشجار التجريبية (Ma jia pummelo في هذه الدراسة) مسبقا. اجمع الزهور الناضجة غير المفتوحة من بداية فترة الإزهار إلى مرحلة الذروة المزهرة ، وضعها في كيس بسحاب. يمكن تخزين الزهور في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة 24 ساعة.
- خذ الزهور إلى المختبر. استخدم الملقط لجمع الأنثرات ، وضعها في طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح. جمع anthers من 20 إلى 30 زهرة.
- ضع طبق بتري الذي يحتوي على الأنثرات في فرن على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة حتى تجف حبوب اللقاح. للاطلاع على تنظيم الزهور المفصل ، انظر Hu et al.9.
- ضع حبوب اللقاح المجففة في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. احفظ حبوب اللقاح في كيس بسحاب محكم الغلق يحتوي على هلام السيليكا المتغير اللون (مجفف). أغلق الكيس ، وقم بتسمية الكيس باسم صنف حبوب اللقاح وتاريخ التخزين. يمكن تخزين حبوب اللقاح المجففة في ثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 96 أسبوعا16.
3. اختبار إنبات حبوب اللقاح في المختبر
- صب 300 ميكرولتر من الوسط السائل في طبق زراعة الخلايا أو غطاء أنبوب الطرد المركزي 2 مل ، ورش حبوب اللقاح بالتساوي بمساعدة فرشاة التلقيح. احتضان حبوب اللقاح عند 28 درجة مئوية في بيئة مظلمة رطبة لمدة 12 ساعة.
- قم بإزالة الجزء العلوي 1 مم من طرف طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر. استخدم الماصة لامتصاص حبوب اللقاح بكمية صغيرة من محلول الاستزراع ونقلها إلى مركز شريحة المجهر. قم بتغطيتها بغطاء غطاء. راقب العينة بمجهر مقلوب باستخدام هدف 10x.
- قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة مستقلة باستخدام نفس كثافة حبوب اللقاح تقريبا لكل نسخةمتماثلة 17. قم بإدارة كمية حبوب اللقاح بصريا ، وتأكد من أن طبق بتري بأكمله مغطى بحبوب اللقاح وأن كل طبق بتري يحتوي على كمية متساوية تقريبا من حبوب اللقاح.
- تنتج حبوب اللقاح المنبتة أنبوب حبوب اللقاح بطول ضعف قطره تقريبا. احسب معدل الإنبات من 20 مجالا مرئيا ، وهو ما يعطي النسبة المئوية لحبوب اللقاح النابتة في جميع حقول حبوب اللقاح.
4. التلقيح
- اختيار يوم مشمس دون الرياح للتلقيح. حدد 10 براعم مكتملة النمو على وشك الفتح ، وقشر البتلات بعناية ، واحرص على عدم إصابتها بكدمات.
- استخدم فرشاة التلقيح لنشر كمية كافية من حبوب اللقاح القابلة للحياة على سطح وصمة العار ، واحرص على عدم إتلاف المدقة. للتلقيح الذاتي ، استخدم حبوب اللقاح من نفس النبات / الصنف. للتلقيح المتبادل ، استخدم حبوب اللقاح من نبات ذي نمط وراثي مختلف.
- غطي الزهور الملقحة بكيس ورقي كبريتات. استخدم مشبك ورق لإغلاق الكيس ولمنع التلقيح عن طريق حبوب اللقاح المميزة وراثيا.
- اكتب اسم النوع وعدد ووقت التلقيح على الملصق. الملصق على الفروع القريبة من الزهور الملقحة.
5. أخذ العينات والتثبيت والحفظ
- قم بإزالة أكياس التلقيح بعد حوالي 3-4 أيام من التلقيح ، واجمع الزهور الملقحة في أكياس بسحاب.
- قم بإزالة البتلات والأوعية والمبيضين على الفور من الزهور ، واغمر الوصمات المنصهرة في الأنماط في أنبوب طرد مركزي يحتوي على محلول مثبت طازج. احتضن الوصمات والأنماط في المحلول المثبت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- في اليوم التالي ، تخلص من المحلول المثبت ، واغسل الوصمات والأنماط مرتين إلى ثلاث مرات في 95٪ من الإيثانول.
- نقل الأنماط إلى محلول الإيثانول 70 ٪. تأكد من أن العينة مغمورة تماما في المحلول. يمكن تخزين الأنماط في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أشهر.
6. تلطيخ الأنيلين الأزرق
- اغسل عينات النمط المخزنة في 70٪ من الإيثانول بالماء المقطر ثلاث إلى أربع مرات. اغمر في محلول هيدروكسيد الصوديوم بطول 4 أمتار ، وأغلقه ، واحتضنه في حمام مائي على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. خلال هذه الخطوة ، يتغير لون النمط من الأصفر والأبيض إلى البرتقالي والأحمر.
- انقعي الأنماط في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة. تخلصي من الماء المقطر ، واغسلي الأنماط بالماء المقطر ثلاث إلى أربع مرات أو حتى يصبح لون النمط أصفر.
- ضع العينة في أنبوب سعة 10 مل ، وأضف الأنيلين الأزرق حتى يتم غمس العينة ، واصبغها لمدة 12 ساعة في الظلام.
- راقب نمو أنبوب حبوب اللقاح باستخدام مجهر مضان.
7. المجهر الفلوري
- قبل مراقبة العينات ، ضع الشريحة على طاولة مسطحة ، وأضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من البولي إيثيلين جلايكول إلى سطح الشريحة.
- اغسل النمط المراد ملاحظته بالماء المقطر. استخدم مشرطا لتقسيمه إلى نصفين على طول المحور الطولي. ضع نصف النمط على الشريحة الزجاجية ، وقم بتغطيتها بغطاء غطاء.
- ضع الشريحة على مسرح المجهر فوق الفتحة ، وتصور باستخدام هدف 10x. استخدم مرشح DAPI (الإثارة: 325-375 نانومتر ؛ الانبعاثات: 435-485 نانومتر). لاحظ خمسة أنماط لكل نوع من أنواع التلقيح. مراقبة نمو أنبوب حبوب اللقاح.
8. تحديد النمط الجيني S القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل
- استخرج الحمض النووي الجينومي من عينة وصمة العار باستخدام طريقة CTAB18.
- ضع الأوراق المجمعة في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل. تحضير HCl:EDTA:NaCl:H2O عازلة بنسبة 1:1:3:5 وخليط كحول كلوروفورم إيزو أميل بنسبة 24:1
- أضف 10 مل من المخزن المؤقت المحضر ، و 0.2 جم من CTAB ، و 200 ميكرولتر من ميركابتوفوإيثانول إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وضعها في حمام مائي عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا وشفافا.
- ضع الشفرات في ملاط ، وأضف العينات المجمدة ، وأضف النيتروجين السائل ، وطحنها. ضع العينة الأرضية في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل ، وأضف 600 ميكرولتر من خليط CTAB ، وضعها في حمام مائي عند 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، واخلطها رأسا على عقب كل 30 دقيقة.
- أضف 700 ميكرولتر من خليط كحول كلوروفورم إيزو أميل (24: 1) ، واخلطه رأسا على عقب لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي عند 24 درجة مئوية عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق ، ماصة المادة الطافية ، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
- أضف 60 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 5 M و 1 مل من الإيثانول المطلق ، واخلطه رأسا على عقب. تجمد عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 24 درجة مئوية و 9000 × جم لمدة 5 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 مل من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ ، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. أجهزة الطرد المركزي عند 24 درجة مئوية ، 9000 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، واستنشق محلول الإيثانول الزائد ، وجفف في الهواء لمدة 5 دقائق.
- أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم ليذوب ، وقم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وقم بتجميده في مجمد -4 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
- تكوين نظام تفاعل RT-PCR. قم بإعداد مزيج التفاعل التالي ل 10 ميكرولتر يحتوي على 5 ميكرولتر من 2x PCRMix ، و 0.25 ميكرولتر لكل من التمهيدي الأمامي والخلفي ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي (100 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 3.5 ميكرولتر من H2O.
- قم بإعداد برنامج PCR حسب الجدول 1. كان برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل لجميع الأشكال المتساوية 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق 32x (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. افصل المنتجات على 1.5٪ من المواد الهلامية TAE-agarose والصورة9. تحقق من النمط الجيني S المحدد باستخدام الحمض النووي الجينومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بالنسبة للتجارب التي أجريت هنا ، تم اختيار الزهور الناضجة ، وتم جمع الأنثرات وتجفيفها في فرن ، ونبت حبوب اللقاح عند 28 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. تم تحديد صلاحية حبوب اللقاح ومعدلات إنباتها كما هو موضح في الشكل 1.
تم تلقيح الحمضيات يدويا ، وتم تقييم توافق حبوب اللقاح وعدم توافقها باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق والفحص المجهري الفلوري. يمكن أن تنبت حبوب اللقاح المتوافقة على سطح وصمة العار وتنتج أنبوب حبوب اللقاح الطبيعي الذي يمكن أن ينمو ويؤدي في النهاية إلى الإخصاب في المبيض. في المقابل ، نمت أنابيب حبوب اللقاح غير المتوافقة خلال ما يقرب من ثلثي النمط ثم توقفت عن النمو (الشكل 2).
لتحديد النمط الجيني S ، تم استخراج الحمض النووي الكلي من النبات. تم تصميم بادئات محددة بناء على تسلسل موضع S التي كانت مفيدة لتضخيم جزء من موضع S في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم تحليل منتجات التضخيم باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. تم الكشف عن النطاقات المضخمة (بين 500-1000 نقطة أساس). تم تحديد النمط الجيني S المقابل (الشكل 3). بهذه الطريقة ، حددنا الأنماط الجينية S ل 63 موردا للأصول الوراثيةpummelo 7. حددت مجموعتنا 21 نمطا فرديا على شكل حرف S في أنواع مختلفة من الحمضيات باستخدام هذه الطريقة19 (الجدول 2).
الشكل 1: معدلات مختلفة لإنبات حبوب اللقاح. إنبات ونمو حبوب اللقاح. (أ) حبوب اللقاح القابلة للحياة لها معدل إنبات أعلى، ويمكن زراعة أنبوب حبوب اللقاح الطبيعي. (ب) معدل إنبات حبوب اللقاح غير القابلة للحياة أو الأقل قابلية للحياة أقل بكثير، ويمكن أن ينمو عدد قليل من أنابيب حبوب اللقاح. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور مجهرية مضان لأنابيب حبوب اللقاح في المدقات بعد التلقيح. أ: مدقة متوافقة ذاتيا مع العديد من أنابيب حبوب اللقاح النامية. (ب) المدقة غير المتوافقة ذاتيا مع توقف نمو أنبوب حبوب اللقاح داخل النمط. الاختصارات: Pt = أنبوب حبوب اللقاح. VB = حزمة الأوعية الدموية. قضبان المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التضخيم النوعي لجين S-RNase من Ma jia pummelo. بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي الهلامي ، وجد أن النطاقين المضخمين S10 و S16 كانا الأكثر سطوعا. تشير هذه البيانات إلى أن النمط الجيني ل Ma jia pummelo كان S10 و S16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: نظام التفاعل المستخدم لتحديد النمط الجيني S القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: قائمة البادئات للأنماط الوراثية 21 S في الحمضيات التي حددتها مجموعتنا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في محاصيل الفاكهة ، يعتبر كل من البارثينوكاربي و SI من السمات المهمة لأنهما يمهدان الطريق للفواكه الخالية من البذور - وهي سمة تحظى بتقدير كبير من قبل المستهلكين. عدم التوافق الذاتي يعزز رفض حبوب اللقاح الذاتية ، وبالتالي يمنع زواج الأقارب20. بين الحمضيات ، pummelo هو نوع غير متوافق ذاتيا7. ما يقرب من 40 ٪ من جميع أنواع كاسيات البذور تظهر SI21. هذه السمة تمنع تكوين الفاكهة ، وتقلل من المحصول ، وتسبب خسائر اقتصادية فادحة للمزارعين. لحل هذه المشكلة ، يشمل المزارعون أشجار الملقحات في جميع أنحاء بساتينهم. ومع ذلك ، فإن اختيار أشجار الملقحات المناسبة مهمة صعبة تتطلب تجارب معملية تستغرق وقتا طويلا. لحل هذه المشكلات ، قمنا بتطوير طريقة سريعة لتحديد الأنماط الجينية للنظام الدولي لتحديد الأنماط الوراثية SI وتحديد توافق حبوب اللقاح وعدم توافقها لأنواع الحمضيات المختلفة لتسهيل الاختيار الدقيق لأشجار الملقحات. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحديد صلاحية حبوب اللقاح ومعدلات إنباتها باستخدام الطريقة في المختبر الموضحة في هذا البروتوكول.
هناك بعض التقارير حول تحديد الأنماط الجينية للنظام الدولي للوحدات والتوافق الذاتي (في) والتوافق بين (في) باستخدام مزيج من الطرق المختلفة في البرقوق الياباني والمشمش22,23. يعتمد تطوير البادئات الخاصة ب S على تحديد النمط الجيني S. في الحمضيات ، حدد تحليل النسخ للوصمة وحبوب اللقاح من 64 مدخلا من pummelo تسعة S-RNases تم التعبير عنها على وجه التحديد في الأنماط ومتغير واحد من S-RNase. تم تطوير 12 زوجا آخر من البادئات الخاصة ب S لاحقا في الحمضيات بواسطة Liang et al.7 و Wei et al.19. ومع ذلك ، بالنسبة إلى الكمثرى والتفاح ، تم تحديد عدد أقل من الأنماط الوراثية S في الحمضيات4. يعد تحديد الأنماط الجينية S القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل خطوة حاسمة ، لأنه يوفر أساسا للتركيبات المتوافقة / غير المتوافقة. هناك أيضا بعض القيود على هذا البروتوكول. لا يمكن تحديد الأنماط الوراثية S لبعض أصناف الحمضيات باستخدام هذه الطريقة. تشير هذه النتيجة إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من التوسع في مكتبة النمط الوراثي S في الحمضيات. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للبادئات الخاصة ب S التمييز بين الأنماط الجينية S للأصناف ذات تسلسلات S المتشابهة للغاية ، وبالتالي تضخيم تسلسلات S المتشابهة بشكل غير محدد.
إجمالا ، نظرا لفعاليتها من حيث التكلفة وسهولة الاستخدام ، تعد هذه الطريقة أداة فعالة لتحديد توافق حبوب اللقاح وعدم التوافق مع أنواع الحمضيات المختلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لاختيار أشجار الملقحات المناسبة وفي برامج أبحاث التربية. يمكن تطبيقه على عدة أنواع من عائلة Rutaceae (على سبيل المثال ، Citrus trifoliata و Fortunella japonica) لاختيار أشجار الملقحات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا المشروع ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32122075 ، 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
