Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה לקביעת תאימות אבקה ואי התאמה בזני הדרים.
Abstract
הדר משתמש באי-תאימות עצמית מבוססת S-RNase כדי לדחות אבקה עצמית, ולכן זקוק לעצי האבקה סמוכים לצורך האבקה ודישון מוצלחים. עם זאת, איתור זנים מתאימים שישמשו כמאביקים הוא תהליך שלוקח זמן. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה מהירה לזיהוי זני הדרים תואמי האבקה המשתמשת באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ובכתמים כחולים אנילין. תאימות האבקה נקבעת על סמך זיהוי גנוטיפים מסוג S על ידי חילוץ DNA כולל וביצוע בדיקות גנוטיפ מבוססות PCR עם פריימרים ספציפיים. בנוסף, סגנונות נאספים 3-4 ימים לאחר האבקה ידנית, וצביעת כחול אנילין מבוצעת. לבסוף, מצב הצמיחה של צינורות האבקה נצפה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאימות אבקה וחוסר תאימות ניתן לקבוע על ידי התבוננות אם צמיחת צינור אבקה הוא נורמלי או מדוכא, בהתאמה. בשל פשטותה ועלות-תועלתה, שיטה זו היא כלי יעיל לקביעת תאימות האבקה ואי התאימות של זני הדרים שונים כדי ליצור קבוצות אי-התאמה ויחסי אי-התאמה בין זנים שונים. שיטה זו מספקת מידע חיוני לבחירה מוצלחת של עצים מאביקים מתאימים, ובכך מאפשרת הקמת בוסתנים חדשים ובחירת הורים מתאימים לתוכניות רבייה.
Introduction
אי-תאימות עצמית (SI) היא מנגנון מבוקר גנטית הקיים בכ-40% ממיני האנגיוספרם. בתהליך זה, הפיסטיל דוחה אבקה מצמח בעל אותו גנוטיפ SI, ובכך מונע הפריה עצמית 1,2. Ma jia pummelo הוא זן מקומי במחוז ג'ינגסו שבסין, עם איכויות מצוינות של פירות גדולים ורודים, תכולת מיץ עשירה, טעם מתוק וחמוץ, וקליפה עבה3. למרות ש-SI מקדם יציאה החוצה, הוא משפיע לרעה על היבול והאיכות של פירות4 ומחייב עצים מאביקים מתאימים עם גנוטיפים SI מובהקים לשיעורי קיבוע פירות אמינים ותשואות גבוהות. כיום, ישנם שני סוגים עיקריים של SI, אי-תאימות עצמית ספורופיטית (SSI), המיוצגת על-ידי Brassicaceae, ואי-תאימות עצמית גמטופיטית (GSI), המיוצגת על-ידי Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae ו-Solanaceae 5,6,7,8.
פרי הדר הוא אחד מגידולי הפרי החשובים בעולם. מערכת GSI מבוססת S-RNase נמצאת בהדרים רבים ומשפיעה לרעה על קצב קיבוע הפירות9. במערכת זו, SI נשלט על ידי מוקד S, מוקד פולימורפי יחיד עם שני אללים מורכבים הנושאים דטרמיננטים פיסטיל S ודטרמיננטים אבקה S 7. הדטרמיננטה הנקבית היא S ribonuclease (S-RNase), והדטרמיננטה הגברית היא S locus F-box (SLF)7. תאי הפיסטיל מפרישים חלבוני S-RNase. חלבוני ה-S-RNases שאינם עצמיים מוכרים על ידי חלבוני SLF, מה שמוביל ליוביקוויטינציה ולפירוק של ה-S-RNases הלא-עצמיים על ידי מסלול פרוטאזום 26S. לעומת זאת, ה-S-RNases העצמיים מסוגלים לצבור ולעכב את צמיחת צינור האבקה (PT) מכיוון שהם חומקים מחלבוני SLF, ולכן נמנעים מהם יוביקוויטינציה10,11,12,13.
כאן, אנו מדווחים על טכניקת in vivo השימושית לזיהוי גנוטיפים מסוג S ודרגות של תאימות וחוסר תאימות אבקה. הפרוטוקול כולל חילוץ DNA כולל מעלים וחיזוי גנוטיפ S באמצעות פריימרים ספציפיים ל-S. יתר על כן, צביעה כחולה אנילין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי ואחריו האבקה ידנית מספקים ראיות למידת התאימות וחוסר ההתאמה. הליך האבקה Semi in vivo, הכולל האבקה ידנית של פרחים במעבדה14,15, הותאם גם הוא להערכת דרגות התאימות העצמית ואי ההתאמה. עם זאת, השתמשנו גם בהאבקה בשדה ואחריה בשקיעת פרחים כדי למנוע זיהום מאבקה לא רצויה כדי לאפשר לצינורות האבקה להתפתח בתנאים טבעיים. פרוטוקול זה פשוט ופשוט ומספק את המידע הדרוש לבחירה מוצלחת של עצי מאביקים מתאימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לצביעת כחול אנילין
- הכינו את הריאגנטים והכלים הבאים לניסוי: מברשת מאביקים, פינצטה, עיפרון, נייר סולפט, שקית האבקה, שקיות נעילת רוכסן, אטבי נייר, פורמלדהיד, חומצה אצטית קרחונית, אתנול מוחלט, צינורות צנטריפוגה, מלקחיים, טפטפות דבק, שקופיות זכוכית, כיסויים, אזמלים ופוליאתילן גליקול.
- יש להכין אמצעי נביטה במבחנה המכיל 0.02% MgSO4, 0.01% KNO 3, 0.03% Ca(NO 3)2, 0.01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 ו-15% סוכרוז. התאם את ה- pH ל- 6.0-6.2 עם KOH. השתמשו במערבל מגנטי מכיוון שקשה להמיס PEG-4,000.
- הכינו את התמיסה המקבעת של קרנוי, שהיא אתנול מוחלט וחומצה אצטית קרחונית מעורבבים ביחס של 3:1. הכינו תמיסת קיבוע FAA, שהיא 40% פורמלדהיד, 80% אתנול וחומצה אצטית קרחונית (1:8:1). הכינו 4 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) ותמיסה כחולה אנילין, שהיא 0.1% כחול אנילין ב 0.1 M K3PO4. השתמש בבקבוק ענבר כדי לאחסן את תמיסת כחול אנילין מכיוון שהיא רגישה לאור.
2. איסוף אבקה
- דע מראש את תקופת הפריחה של עצי הניסוי (Ma jia pummelo במחקר זה). אספו פרחים בוגרים שלא נפתחו מתחילת תקופת הפריחה ועד לשלב שיא הפריחה, והכניסו אותם לשקית עם רוכסן. את הפרחים ניתן לאחסן ב 4 ° C במקרר במשך 24 שעות.
- קחו את הפרחים למעבדה. השתמשו בפינצטה כדי לאסוף את האנתרים, והניחו אותם בכלי פטרי המכיל נייר פילטר. לאסוף anthers מ 20 עד 30 פרחים.
- הכניסו את צלחת הפטרי המכילה את האנתרים לתנור בטמפרטורה של 28 מעלות למשך 24 שעות עד שגרגרי האבקה יתייבשו. על ארגון הפרחים המפורט, ראו Hu et al.9.
- הכניסו את האבקה המיובשת לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. שמור את האבקה בשקית נעילת רוכסן אטומה המכילה ג'ל סיליקה משנה צבע (חומר מייבש). סגרו את השקית ותייגו את השקית בשם זן האבקה ותאריך האחסון. את האבקה המיובשת ניתן לאחסן במקרר בטמפרטורה של 20°C למשך 96 שבועות16.
3. בדיקת נביטת אבקה חוץ גופית
- יוצקים 300 μL של מדיום נוזלי לתוך צלחת תרבית תאים או מכסה של צינור צנטריפוגה 2 מ"ל, ומפזרים את האבקה באופן שווה בעזרת מברשת האבקה. לדגור את האבקה ב 28 ° C בסביבה חשוכה לח במשך 12 שעות.
- הסר את 1 המ"מ העליונים של קצה פיפטה 1,000 μL. השתמש פיפטה כדי לספוג את האבקה עם כמות קטנה של תמיסת תרבית ולהעביר אותו למרכז שקופית המיקרוסקופ. כסו אותו בכיסוי. התבונן בדגימה במיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרה של 10x.
- בצע שלושה שכפולים עצמאיים תוך שימוש בערך באותה צפיפות אבקה עבור כל שכפול17. נהלו ויזואלית את כמות האבקה, וודאו שכל צלחת הפטרי מכוסה באבקה ושבכל צלחת פטרי יש כמות כמעט שווה של אבקה.
- האבקה הנבטה מייצרת צינור אבקה שאורכו ככפול מקוטרו. חשב את קצב הנביטה מ -20 שדות חזותיים, אשר נותן את אחוז האבקה הנבטה בכל שדות האבקה.
4. האבקה
- בחרו יום שמש ללא רוח להאבקה. בחרו 10 ניצנים מפותחים שעומדים להיפתח, קלפו את עלי הכותרת בזהירות והקפידו לא לחבול בהם.
- השתמשו במברשת האבקה כדי לפזר כמות מספקת של אבקה בת קיימא על פני השטח של הצלקת, והיזהרו לא לפגוע בפיסטיל. להאבקה עצמית, השתמשו באבקה מאותו צמח/זן. לצורך האבקה צולבת, השתמשו באבקה מצמח בעל גנוטיפ שונה.
- מכסים את הפרחים המואבקים בשקית נייר סולפט. השתמשו באטב נייר כדי לאטום את השקית ולמנוע האבקה על ידי אבקנים מובחנים מבחינה גנוטיפית.
- כתוב את שם המין ואת מספר וזמן ההאבקה על התווית. תלו את התווית על הענפים ליד הפרחים המואבקים.
5. דגימה, קיבוע ושימור
- מוציאים את שקיות ההאבקה כ-3-4 ימים לאחר ההאבקה, ואוספים את הפרחים המואבקים בשקיות רוכסן.
- הסירו מיד את עלי הכותרת, כלי הקיבול והשחלות מהפרחים, וטבלו את הצלקות המאוחות לסגנונות בצינור צנטריפוגה המכיל תמיסה מקובעת שזה עתה הוכנה. לדגור את הסטיגמות והסגנונות בתמיסה המקובעת לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- למחרת, השליכו את התמיסה המקבעת, ושטפו את הסטיגמות והסגנונות פעמיים-שלוש באתנול 95%.
- העבירו את הסגנונות לתמיסת אתנול 70%. ודא כי הדגימה שקועה לחלוטין בתמיסה. הסגנונות בשלב זה ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 1-2 חודשים.
6. כתם כחול אנילין
- שטפו את דגימות הסגנון המאוחסנות באתנול 70% במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים. יש לטבול בתמיסת NaOH באורך 4 מ', לאטום ולדגור באמבט מים בטמפרטורה של 65°C למשך 60 דקות. במהלך שלב זה, צבע הסגנון משתנה מצהוב-לבן לכתום-אדום.
- משרים את הסגנונות במים מזוקקים למשך 30 דקות. השליכו את המים המזוקקים, ושטפו את הסגנונות במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים או עד שצבע הסגנון הופך לצהוב.
- מניחים את הדגימה בצינור של 10 מ"ל, מוסיפים את כחול האנילין עד לטבילה של הדגימה, וצובעים במשך 12 שעות בחושך.
- התבונן בצמיחת צינור האבקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
7. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- לפני התבוננות בדגימות, הניחו את השקופית על שולחן שטוח והוסיפו שתיים עד שלוש טיפות פוליאתילן גליקול לפני השטח של השקופית.
- לשטוף את הסגנון כדי להיות נצפה עם מים מזוקקים. השתמש באזמל כדי לחלק אותו לשני חצאים לאורך ציר האורך. הניחו מחצית מהסגנון על מגלשת הזכוכית, וכסו בכיסוי.
- הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ מעל הצמצם, ודמיינו באמצעות מטרה של 10x. השתמש במסנן DAPI (עירור: 325-375 ננומטר; פליטה: 435-485 ננומטר). שימו לב לחמישה סגנונות לכל סוג האבקה. שימו לב לצמיחת צינור האבקה.
8. זיהוי גנוטיפ S מבוסס PCR
- חלצו את הדנ"א הגנומי מדגימת הסטיגמה בשיטת CTAB18.
- הכניסו את העלים שנאספו לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל, והקפיאו בחנקן נוזלי. הכינו HCl:EDTA:NaCl:H2O חוצץ ביחס של 1:1:3:5 ותערובת אלכוהול איזואמיל כלורופורם ביחס של 24:1
- הוסף 10 מ"ל של חיץ מוכן, 0.2 גרם של CTAB, ו 200 μL של mercaptoethanol צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולשים אותם באמבט מים ב 65 ° C במשך 5 דקות עד הפתרון הופך ברור ושקוף.
- מכניסים את הלהבים למכתש, מוסיפים את הדגימות הקפואות, מוסיפים חנקן נוזלי וטוחנים. הכניסו את דגימת הקרקע לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל, הוסיפו 600 מיקרוליטר של תערובת CTAB, הכניסו אותה לאמבט מים בטמפרטורה של 65°C למשך 60 דקות, וערבבו אותה הפוכה כל 30 דקות.
- מוסיפים 700 μL של תערובת אלכוהול איזואמיל כלורופורם (24:1), ומערבבים הפוך במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-24°C ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות, פיפטה הסופר-נטנט והעברה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
- מוסיפים 60 μL של תמיסת NaCl 5 M ו-1 מ"ל אתנול מוחלט, ומערבבים הפוך. יש להקפיא בטמפרטורה של -20°C למשך 30 דקות, ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 24°C ו-9,000 x g למשך 5 דקות.
- יש להשליך את הסופרנטנט, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת אתנול 70% ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 24°C, 9,000 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט, שאפו את תמיסת האתנול העודפת וייבשו באוויר למשך 5 דקות.
- הוסיפו 100 מיקרוליטר מים סטריליים להתמוססות, מדדו את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר והקפיאו במקפיא של -4°C לאחסון לטווח ארוך.
- הגדר את מערכת התגובה RT-PCR. הכינו את תערובת התגובה הבאה עבור 10 μL המכיל 5 μL של 2x PCRMix, 0.25 μL כל אחד של פריימר קדימה ואחורה, 1 μL של DNA (100 ng/ μL), ו 3.5 μL של H2O.
- הגדר את תוכנית ה- PCR לפי טבלה 1. תוכנית ה- PCR עבור כל האיזופורמים הייתה 95 ° C במשך 5 דקות 32x (95 ° C עבור 30 שניות, 55 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 1 דקה) ו 72 ° C במשך 5 דקות. יש להפריד את המוצרים על 1.5% ג'ל TAE-agarose ולצלם9. אמת את גנוטיפ S שצוין באמצעות DNA גנומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לניסויים שנעשו כאן נבחרו פרחים בוגרים, האנתרים נאספו, יובשו בתנור והאבקה נבטה ב-28 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. כדאיות האבקה ושיעורי הנביטה כומתו כפי שניתן לראות באיור 1.
ההדרים עברו האבקה ידנית, והתאימות וחוסר התאימות של האבקה הוערכו באמצעות צביעה כחולה אנילין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. האבקה התואמת יכולה לנבוט על פני הצלקת ולייצר צינור אבקה רגיל שיכול לגדול ובסופו של דבר להוביל להפריה בשחלה. לעומת זאת, צינורות אבקה לא תואמים גדלו דרך כשני שלישים מהסגנון ואז הפסיקו לגדול (איור 2).
כדי לזהות את הגנוטיפ S, הופק הדנ"א הכולל מהצמח. פריימרים ספציפיים תוכננו בהתבסס על רצף לוקוס S שהיו שימושיים להגברת חלק מלוקוס S בתגובות PCR. מוצרי ההגברה נותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. התגלו הפסים המוגברים (בין 500-1,000 bp). זוהה גנוטיפ S מתאים (איור 3). בשיטה זו, זיהינו את הגנוטיפים S של 63 משאבי נבט פומלו7. הקבוצה שלנו זיהתה 21 S-haplotypes בזני הדרים שונים בשיטה זו19 (טבלה 2).
איור 1: שיעורים שונים של נביטת אבקה. נביטה וצמיחה של אבקה. (A) לאבקה בת קיימא יש קצב נביטה גבוה יותר, וניתן לגדל צינור אבקה רגיל. (B) לאבקה שאינה בת קיימא או פחות בת קיימא יש שיעור נביטה נמוך בהרבה, ומעט צינורות אבקה יכולים לגדול. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של צינורות אבקה בכלונסאות לאחר האבקה. (A) פיסטיל תואם עצמי עם צינורות אבקה רבים הגדלים. (B) פיסטיל שאינו תואם את עצמו עם צמיחת צינור אבקה נעצר בתוך הסגנון. קיצורים: Pt = צינור אבקה; vb = צרור כלי דם. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגברה ספציפית של הגן S-RNase מ-Ma jia pummelo. לאחר הגברה PCR ואלקטרופורזה בג'ל, נמצא כי שני הפסים המוגברים S10 ו- S16 היו הבהירים ביותר. נתונים אלה מצביעים על כך שהגנוטיפ של Ma jia pummelo היה S10 ו-S16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מערכת התגובה המשמשת לזיהוי גנוטיפ S מבוסס PCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: רשימת הפריימרים לגנוטיפים של 21 S בהדרים שזוהו על ידי הקבוצה שלנו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בגידולי פירות, הן parthenocarpy ו SI הן תכונות חשובות כי הם סוללים את הדרך פירות ללא זרעים - תכונה כי הוא מוערך מאוד על ידי הצרכנים. חוסר תאימות עצמית מקדם את דחיית האבקה העצמית, ובכך מונע רבייה20. בין הדרים, פומלו הוא זן שאינו תואם את עצמו7. כמעט 40% מכל מיני האנגיוספרם מציגים ת"י21. תכונה זו מונעת קיבוע פירות, מורידה את היבול ומביאה הפסדים כלכליים עצומים למגדלים. כדי לפתור בעיה זו, חקלאים כוללים עצים מאביקים ברחבי המטעים שלהם. עם זאת, בחירת עצים מאביקים מתאימים היא משימה מאתגרת הדורשת ניסויי מעבדה הגוזלים זמן. כדי לפתור בעיות אלה, פיתחנו שיטה מהירה לזיהוי גנוטיפים של SI ולקביעת תאימות האבקה ואי התאימות של זני הדרים שונים כדי להקל על הבחירה המדויקת של עצי המאביקים. יתר על כן, ניתן לקבוע את כדאיות האבקה ואת שיעורי הנביטה גם באמצעות שיטת המבחנה המתוארת בפרוטוקול זה.
ישנם כמה דיווחים על קביעת גנוטיפים של SI ותאימות עצמית (in) ותאימות בין (in) באמצעות שילוב של שיטות שונות בשזיף יפני משמש22,23. הפיתוח של פריימרים ספציפיים ל-S מסתמך על זיהוי הגנוטיפ S. בהדרים, ניתוח התעתיק של סטיגמה ואבקה מ-64 כניסות פומלו זיהה תשעה S-RNases המתבטאים באופן ספציפי בסגנונות וגרסה אחת של S-RNase. 12 זוגות נוספים של פריימרים ספציפיים ל-S פותחו מאוחר יותר בהדרים על ידי Liang et al.7 ו-Wei et al.19. עם זאת, יחסית לאגס ולתפוח, פחות גנוטיפים של S זוהו בהדרים4. זיהוי גנוטיפים מבוססי PCR S הוא שלב קריטי, שכן הוא מספק בסיס לשילובים תואמים/לא תואמים. יש גם כמה מגבלות לפרוטוקול זה. לא ניתן לזהות את גנוטיפ S של זני הדרים מסוימים בשיטה זו. ממצא זה מצביע על כך שנדרשת הרחבה נוספת של ספריית הגנוטיפ S בהדרים. בנוסף, הפריימרים הספציפיים ל-S אינם יכולים להבחין בגנוטיפים S של זנים בעלי רצפי S דומים מאוד, ולכן מגבירים באופן לא ספציפי רצפי S דומים.
בסך הכל, בשל עלות-תועלת וקלות השימוש בה, שיטה זו היא כלי יעיל לקביעת תאימות אבקה וחוסר התאמה לזני הדרים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש לבחירת עצים מאביקים מתאימים ובתוכניות מחקר רבייה. ניתן ליישם אותו על מספר מינים ממשפחת Rutaceae (למשל, Citrus trifoliata ו - Fortunella japonica) לבחירת עצי מאביקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
