Summary
Detta protokoll ger en snabb metod för att bestämma pollenkompatibilitet och inkompatibilitet i citrussorter.
Abstract
Citrus använder S-RNase-baserad självinkompatibilitet för att avvisa självpollen och kräver därför närliggande pollineringsträd för framgångsrik pollinering och befruktning. Att identifiera lämpliga sorter för att fungera som pollinisatorer är dock en tidskrävande process. För att lösa detta problem har vi utvecklat en snabb metod för att identifiera pollineringskompatibla citrussorter som använder agarosgelelektrofores och anilinblå färgning. Pollenkompatibilitet bestäms baserat på identifieringen av S-genotyper genom att extrahera totalt DNA och utföra PCR-baserade genotypanalyser med specifika primers. Dessutom samlas stilar 3-4 dagar efter manuell pollinering och anilinblå färgning utförs. Slutligen observeras pollenrörens tillväxtstatus med ett fluorescensmikroskop. Pollenkompatibilitet och inkompatibilitet kan fastställas genom att observera om pollenrörets tillväxt är normal respektive undertryckt. På grund av sin enkelhet och kostnadseffektivitet är denna metod ett effektivt verktyg för att bestämma pollenkompatibiliteten och inkompatibiliteten hos olika citrussorter för att fastställa inkompatibilitetsgrupper och inkompatibilitetsförhållanden mellan olika sorter. Denna metod ger information som är nödvändig för ett framgångsrikt urval av lämpliga pollineringsträd och underlättar därmed inrättandet av nya fruktträdgårdar och valet av lämpliga föräldrar för avelsprogram.
Introduction
Självinkompatibilitet (SI) är en genetiskt kontrollerad mekanism som finns i cirka 40% av angiospermarterna. I denna process avvisar pistilen pollen från en växt med samma SI-genotyp och förhindrar därmed självbefruktning 1,2. Ma jia pummelo är en lokal sort i Jinagsu-provinsen, Kina, med de utmärkta egenskaperna hos stor, rosa frukt, ett rikt juiceinnehåll, en söt och sur smak och en tjock skal3. Även om SI främjar utkorsning, påverkar det negativt avkastningen och kvaliteten på frukt4 och kräver lämpliga pollineringsträd med distinkta SI-genotyper för tillförlitliga fruktinställningshastigheter och höga utbyten. För närvarande finns det två huvudtyper av SI, sporofytisk självinkompatibilitet (SSI), representerad av Brassicaceae, och gametofytisk självinkompatibilitet (GSI), representerad av Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae och Solanaceae 5,6,7,8.
Citrus är en av de viktigaste fruktgrödorna i världen. Det S-RNase-baserade GSI-systemet finns i många citrusaccessioner och påverkar fruktsättningshastigheten negativt9. I detta system styrs SI av S-lokus, en enda polymorf plats med två komplexa alleler som bär pistil S-determinanter och pollen S-determinanter 7 . Den kvinnliga determinanten är S-ribonukleas (S-RNase), och den manliga determinanten är S-locus F-box (SLF)7. Pistilens celler utsöndrar S-RNas-proteiner. De icke-själv S-RNaserna känns igen av SLF-proteinerna, vilket leder till ubiquitinering och nedbrytning av icke-själv S-RNaserna av 26S-proteasomvägen. Däremot kan själv-S-RNaserna ackumulera och hämma pollenrörstillväxt (PT) eftersom de undviker SLF-proteinerna och därför förhindras från ubiquitinzation10,11,12,13.
Här rapporterar vi en in vivo-teknik som är användbar för att identifiera S-genotyper och grader av pollenkompatibilitet och inkompatibilitet. Protokollet innebär att extrahera totalt DNA från löv och förutsäga S-genotypen med hjälp av S-specifika primrar. Dessutom ger anilinblå färgning och fluorescensmikroskopi följt av handpollinering bevis för graden av kompatibilitet och inkompatibilitet. Semi in vivo-pollineringsproceduren, som innebär manuell pollinering av blommor i laboratoriet14,15, har också anpassats för att bedöma graden av självkompatibilitet och inkompatibilitet. Men vi har också använt fältpollinering följt av påsning av blommor för att undvika kontaminering från oönskat pollen för att låta pollenrören utvecklas under naturliga förhållanden. Detta protokoll är enkelt och okomplicerat och ger den information som behövs för ett framgångsrikt urval av lämpliga pollineringsträd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse för anilinblå färgning
- Förbered följande reagens och verktyg för experimentet: en pollinatorborste, pincett, en penna, sulfatpapper, en pollineringspåse, blixtlåspåsar, gem, formaldehyd, isättika, absolut etanol, centrifugrör, pincett, limdroppare, glasskivor, täckglas, skalpeller och polyetylenglykol.
- Förbered in vitro-groningsmedium innehållande 0,02%MgSO4, 0,01% KNO3, 0,03% Ca(NO3)2, 0,01%H3BO3, 20% PEG-4000 och 15% sackaros. Justera pH till 6,0-6,2 med KOH. Använd en magnetomrörare eftersom PEG-4 000 är svår att lösa upp.
- Bered Carnoys fixeringslösning, som är absolut etanol och isättika blandad i förhållandet 3:1. Förbered FAA-fixeringslösning, som är 40% formaldehyd, 80% etanol och isättika (1: 8: 1). Bered 4 M natriumhydroxid (NaOH) och anilinblå lösning, som är 0,1% anilinblå i 0,1 M K3PO4. Använd en bärnstensfärgad flaska för att förvara anilinblå lösning eftersom den är ljuskänslig.
2. Polleninsamling
- Känn blomningsperioden för experimentträden (Ma jia pummelo i denna studie) i förväg. Samla mogna oöppnade blommor från början av blomningsperioden till toppblomningsstadiet och lägg dem i en zip-lockpåse. Blommorna kan förvaras vid 4 °C i kylskåp i 24 timmar.
- Ta blommorna till labbet. Använd pincett för att samla ståndarna och placera dem i en petriskål som innehåller filterpapper. Samla strumpor från 20 till 30 blommor.
- Ställ in petriskålen med ståndarna i en ugn på 28 °C i 24 timmar tills pollenkornen har torkat. För den detaljerade blomsterorganisationen, se Hu et al.9.
- Sätt det torkade pollen i ett 1,5 ml centrifugrör. Spara pollen i en lufttät zip-lock-påse som innehåller färgskiftande kiselgel (torkmedel). Stäng påsen och märk påsen med namnet på pollensorten och lagringsdatumet. Det torkade pollen kan förvaras i ett kylskåp på −20 °C i 96 veckor16.
3. Pollengroningstest in vitro
- Häll 300 μL flytande medium i en cellodlingsskål eller locket på ett 2 ml centrifugrör och strö pollen jämnt med hjälp av en pollineringsborste. Inkubera pollen vid 28 °C i en fuktig mörk miljö i 12 timmar.
- Ta bort de övre 1 mm av spetsen på en 1 000 μL pipettspets. Använd pipetten för att absorbera pollen med en liten mängd odlingslösning och flytta den till mitten av mikroskopglaset. Täck den med ett täckglas. Observera provet med ett inverterat mikroskop med ett 10x mål.
- Utför tre oberoende replikat med ungefär samma pollendensitet för varje replikat17. Hantera visuellt mängden pollen, se till att hela petriskålen är täckt med pollen och att varje petriskål har en nästan lika stor mängd pollen.
- Det grodda pollen producerar ett pollenrör med en längd ungefär dubbelt så stor som dess diameter. Beräkna grobarheten från 20 synfält, vilket ger procentandelen grodd pollen i alla pollenfält.
4. Pollinering
- Välj en solig dag utan vind för pollinering. Välj 10 fullt utvecklade knoppar som ska öppnas, dra tillbaka kronbladen försiktigt och var försiktig så att du inte får blåmärken.
- Använd en pollineringsborste för att sprida en tillräcklig mängd livskraftig pollen på ytan av stigmatiseringen och var försiktig så att du inte skadar pistilen. För självpollinering, använd pollen från samma växt / sort. För korsbestämning, använd pollen från en växt med en annan genotyp.
- Täck de pollinerade blommorna med en sulfatpapperspåse. Använd ett gem för att försegla påsen och för att förhindra pollinering av genotypiskt distinkta pollen.
- Skriv artens namn och antal och tid för pollinering på etiketten. Häng etiketten på grenarna nära de pollinerade blommorna.
5. Provtagning, fixering och konservering
- Ta bort pollineringspåsarna ungefär 3-4 dagar efter pollinering och samla de pollinerade blommorna i zip-lockpåsar.
- Ta omedelbart bort kronblad, behållare och äggstockar från blommorna och fördjupa stigmas smält till stilar i ett centrifugrör som innehåller en nyberedd fixeringslösning. Inkubera stigmatiseringen och stilarna i fixeringslösningen över natten vid 4 °C.
- Nästa dag, kassera fixeringslösningen och tvätta stigmas och stilar två till tre gånger i 95% etanol.
- Överför stilarna till en 70% etanollösning. Se till att provet är helt nedsänkt i lösningen. Stilarna i detta skede kan förvaras vid 4 °C i 1-2 månader.
6. Anilinblå färgning
- Tvätta stilproverna lagrade i 70% etanol med destillerat vatten tre till fyra gånger. Sänk ned i 4 M NaOH-lösning, försegla och inkubera i ett 65 °C vattenbad i 60 minuter. Under detta steg ändras stilens färg från gulvit till orange-röd.
- Blötlägg stilarna i destillerat vatten i 30 minuter. Kassera det destillerade vattnet och tvätta stilarna med destillerat vatten tre till fyra gånger eller tills stilens färg blir gul.
- Placera provet i ett 10 ml rör, tillsätt anilinblått tills provet har doppats och färga i 12 timmar i mörkret.
- Observera pollenrörets tillväxt med ett fluorescensmikroskop.
7. Fluorescensmikroskopi
- Innan du observerar proverna, placera bilden på ett plant bord och tillsätt två till tre droppar polyetylenglykol på ytan av bilden.
- Tvätta stilen som ska observeras med destillerat vatten. Använd en skalpell för att dela den i två halvor längs längdaxeln. Placera hälften av stilen på glasskivan och täck med ett täckglas.
- Placera bilden på mikroskopets scen ovanför bländaren och visualisera med ett 10x objektiv. Använd DAPI-filtret (excitation: 325-375 nm; emission: 435-485 nm). Observera fem stilar för varje typ av pollinering. Observera pollenrörets tillväxt.
8. PCR-baserad S-genotypidentifiering
- Extrahera det genomiska DNA:t från stigmaprovet med CTAB-metod18.
- Lägg de uppsamlade bladen i ett 2 ml centrifugrör och snäppfrys i flytande kväve. Bered HCl:EDTA:NaCl:H2O-bufferti förhållandet 1:1:3:5 och en kloroformisoamylalkoholblandning i förhållandet 24:1
- Tillsätt 10 ml av den beredda bufferten, 0,2 g CTAB och 200 μl merkaptoetanol till ett 50 ml centrifugrör och lägg dem i vattenbad vid 65 °C i 5 minuter tills lösningen blir klar och transparent.
- Lägg knivarna i en murbruk, tillsätt de frysta proverna, tillsätt flytande kväve och slipa. Lägg det malda provet i ett 2 ml centrifugrör, tillsätt 600 μl CTAB-blandning, lägg det i ett vattenbad vid 65 °C i 60 minuter och blanda det upp och ner var 30:e minut.
- Tillsätt 700 μl kloroformisoamylalkoholblandning (24:1) och blanda upp och ned i 10 minuter. Centrifugera vid 24 °C vid 12 000 x g i 10 minuter, pipettera supernatanten och överför till ett 1,5 ml centrifugrör.
- Tillsätt 60 μl 5 M NaCl-lösning och 1 ml absolut etanol och blanda upp och ner. Frys vid −20 °C i 30 minuter och centrifugera vid 24 °C och 9 000 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten, tillsätt 1 ml 70% etanollösning och låt stå i rumstemperatur i 1-2 timmar. Centrifugera vid 24 °C, 9 000 x g i 5 minuter, kassera supernatanten, aspirera överflödig etanollösning och lufttorka i 5 minuter.
- Tillsätt 100 μL sterilt vatten för att lösa upp, mät DNA-koncentrationen med en spektrofotometer och frys i en frys på -4 °C för långtidsförvaring.
- Konfigurera RT-PCR-reaktionssystemet. Bered följande reaktionsblandning för 10 μL innehållande 5 μL 2x PCRMix, 0,25 μL vardera av främre och bakåt primer, 1 μL DNA (100 ng/μl) och 3,5 μlH2O.
- Ställ in PCR-programmet enligt tabell 1. PCR-programmet för alla isoformer var 95 °C i 5 min 32x (95 °C i 30 s, 55 °C i 30 s och 72 °C i 1 min) och 72 °C i 5 min. Separera produkterna på 1,5% TAE-agarosgeler och fotografi9. Verifiera den angivna S-genotypen med hjälp av genomiskt DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För de experiment som gjordes här valdes mogna blommor, ståndarna samlades in, torkades i en ugn och pollen grodde vid 28 ° C i 12 timmar. Pollenviabiliteten och grobarheten kvantifierades på det sätt som visas i figur 1.
Citrus pollinerades manuellt och pollenkompatibiliteten och inkompatibiliteten bedömdes med hjälp av anilinblå färgning och fluorescensmikroskopi. Den kompatibla pollen kan gro på ytan av stigmatiseringen och producera ett normalt pollenrör som kan växa och i slutändan leda till befruktning i äggstocken. Däremot växte inkompatibla pollenrör genom ungefär två tredjedelar av stilen och slutade sedan växa (figur 2).
För att identifiera S-genotypen extraherades totalt DNA från växten. Specifika primrar designades baserat på sekvensen av S-lokus som var användbara för att förstärka en del av S-locus i PCR-reaktionerna. Förstärkningsprodukterna analyserades med agarosgelelektrofores. De förstärkta banden detekterades (mellan 500-1 000 bp). Motsvarande S-genotyp identifierades (figur 3). Med denna metod har vi identifierat S-genotyperna av 63 pummelo germplasmresurser7. Vår grupp har identifierat 21 S-haplotyper i olika citrusarter med hjälp av denna metod19 (tabell 2).
Figur 1: Olika hastigheter av pollengroning. Sprängning och tillväxt av pollen. (A) Det livskraftiga pollen har en högre grobarhet, och ett normalt pollenrör kan odlas. (B) Det icke-livskraftiga eller mindre livskraftiga pollen har en mycket lägre grobarhet, och få pollenrör kan växa. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fluorescensmikroskopibilder av pollenrör i pistiller efter pollinering. (A) Självkompatibel pistill med många växande pollenrör. (B) Självinkompatibel pistill med pollenrörstillväxt stoppad inom stilen. Förkortningar: Pt = pollenrör; vb = vaskulär bunt. Skalstänger = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Specifik amplifiering av S-RNas-genen från Ma jia pummelo. Efter PCR-amplifiering och gelelektrofores fann man att de två förstärkta banden S10 och S16 var de ljusaste. Dessa data indikerar att genotypen för Ma jia pummelo var S10 och S16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Det reaktionssystem som används för PCR-baserad S-genotypidentifiering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Lista över primers för 21 S genotyper i citrus identifierade av vår grupp. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I fruktgrödor är både parthenocarpy och SI viktiga egenskaper eftersom de banar väg för fröfria frukter - ett drag som uppskattas mycket av konsumenterna. Självinkompatibilitet främjar avstötningen av självpollen och förhindrar därmed inavel20. Bland citrus är pummelo en självinkompatibel sort7. Nästan 40% av alla angiospermarter uppvisar SI21. Denna egenskap förhindrar fruktsättning, sänker avkastningen och medför stora ekonomiska förluster för odlarna. För att lösa detta problem inkluderar bönder polliniseringsträd i hela sina fruktträdgårdar. Valet av lämpliga pollineringsträd är dock en utmanande uppgift som kräver tidskrävande laboratorieexperiment. För att lösa dessa problem har vi utvecklat en snabb metod för att identifiera SI-genotyper och bestämma pollenkompatibiliteter och inkompatibiliteter hos olika citrussorter för att underlätta det exakta urvalet av pollinerande träd. Dessutom kan pollenviabiliteten och grobarheten också bestämmas med hjälp av in vitro-metoden som beskrivs i detta protokoll.
Det finns några rapporter om bestämning av SI-genotyper och själv-(in)kompatibilitet och inter-(in)kompatibilitet med hjälp av en kombination av olika metoder i japansk plommon och aprikos22,23. Utvecklingen av S-specifika primrar bygger på identifieringen av S-genotypen. I citrus har transkriptomanalysen av stigma och pollen från 64 pummelo-accessioner identifierat nio S-RNaser specifikt uttryckta i stilarna och en variant av S-RNase. Ytterligare 12 par S-specifika primrar utvecklades senare i citrus av Liang et al.7 och Wei et al.19. Men i förhållande till päron och äpple har färre S-genotyper identifierats i citrus4. Identifieringen av PCR-baserade S-genotyper är ett kritiskt steg, eftersom det ger en grund för kompatibla/inkompatibla kombinationer. Det finns också vissa begränsningar för detta protokoll. S-genotyperna för vissa citrussorter kan inte identifieras med denna metod. Detta resultat tyder på att ytterligare utvidgning av S-genotypbiblioteket i citrus krävs. Dessutom kan de S-specifika primrarna inte skilja S-genotyperna av sorter med mycket liknande S-sekvenser och därmed ospecifikt förstärka liknande S-sekvenser.
Sammantaget, på grund av dess kostnadseffektivitet och användarvänlighet, är denna metod ett effektivt verktyg för att bestämma pollenkompatibilitet och inkompatibilitet för olika citrussorter. Detta protokoll kan användas för val av lämpliga pollineringsträd och i avelsforskningsprogram. Det kan appliceras på flera arter från familjen Rutaceae (t.ex. Citrus trifoliata och Fortunella japonica) för val av polliniseringsträd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
