Summary
Dit protocol biedt een snelle methode voor het bepalen van stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit in citruscultivars.
Abstract
Citrus maakt gebruik van op S-RNase gebaseerde zelfincompatibiliteit om zelfpollen af te wijzen en vereist daarom nabijgelegen bestuiverbomen voor succesvolle bestuiving en bevruchting. Het identificeren van geschikte variëteiten om als bestuivers te dienen, is echter een tijdrovend proces. Om dit probleem op te lossen, hebben we een snelle methode ontwikkeld voor het identificeren van bestuivingscompatibele citruscultivars die gebruik maakt van agarose-gel-elektroforese en anilineblauwe kleuring. Pollencompatibiliteit wordt bepaald op basis van de identificatie van S-genotypen door het totale DNA te extraheren en PCR-gebaseerde genotyperingstests uit te voeren met specifieke primers. Bovendien worden stijlen 3-4 dagen na handmatige bestuiving verzameld en wordt anilineblauwe kleuring uitgevoerd. Ten slotte wordt de groeistatus van de pollenbuizen waargenomen met een fluorescentiemicroscoop. Pollencompatibiliteit en -incompatibiliteit kunnen worden vastgesteld door te observeren of de groei van de stuifmeelbuis respectievelijk normaal of onderdrukt is. Vanwege zijn eenvoud en kosteneffectiviteit is deze methode een effectief hulpmiddel voor het bepalen van de stuifmeelcompatibiliteit en incompatibiliteit van verschillende citrusvariëteiten om incompatibiliteitsgroepen en incompatibiliteitsrelaties tussen verschillende cultivars vast te stellen. Deze methode levert informatie die essentieel is voor de succesvolle selectie van geschikte bestuiverbomen en vergemakkelijkt zo de oprichting van nieuwe boomgaarden en de selectie van geschikte ouders voor fokprogramma's.
Introduction
Zelfincompatibiliteit (SI) is een genetisch gecontroleerd mechanisme dat aanwezig is in ongeveer 40% van de angiospermsoorten. In dit proces stoot de stamper stuifmeel af van een plant met hetzelfde SI-genotype en voorkomt zo zelfbevruchting 1,2. Ma jia pummelo is een lokale variëteit in de provincie Jinagsu, China, met de uitstekende kwaliteiten van groot, roze fruit, een rijk sapgehalte, een zoetzure smaak en een dikke schil3. Hoewel SI outcrossing bevordert, heeft het een negatieve invloed op de opbrengst en kwaliteit van fruit4 en vereist het geschikte bestuiverbomen met verschillende SI-genotypen voor betrouwbare vruchtzettingssnelheden en hoge opbrengsten. Op dit moment zijn er twee hoofdtypen SI, sporofytische zelfincompatibiliteit (SSI), vertegenwoordigd door Brassicaceae, en gametofytische zelfincompatibiliteit (GSI), vertegenwoordigd door Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae en Solanaceae 5,6,7,8.
Citrus is een van de belangrijkste fruitgewassen ter wereld. Het op S-RNase gebaseerde GSI-systeem is te vinden in veel citrustoetredingen en heeft een negatieve invloed op de vruchtzettingssnelheid9. In dit systeem wordt SI gecontroleerd door de S-locus, een enkele polymorfe locus met twee complexe allelen die stamper S-determinanten en stuifmeel S-determinanten 7 dragen. De vrouwelijke determinant is de S ribonuclease (S-RNase), en de mannelijke determinant is de S locus F-box (SLF)7. De cellen van de stamper scheiden S-RNase-eiwitten af. De niet-zelf S-RNases worden herkend door de SLF-eiwitten, wat leidt tot de ubiquitinatie en afbraak van de niet-zelf S-RNases door de 26S proteasoomroute. Daarentegen zijn de zelf S-RNases in staat om de groei van stuifmeelbuis (PT) te accumuleren en te remmen omdat ze de SLF-eiwitten ontwijken en daarom worden voorkomen van ubiquitinzatie10,11,12,13.
Hier rapporteren we een in vivo techniek die nuttig is voor het identificeren van S-genotypen en graden van pollencompatibiliteit en incompatibiliteit. Het protocol omvat het extraheren van totaal DNA uit bladeren en het voorspellen van het S-genotype met behulp van S-specifieke primers. Bovendien leveren anilineblauwe kleuring en fluorescentiemicroscopie gevolgd door handbestuiving bewijs voor de mate van compatibiliteit en incompatibiliteit. De semi-in vivo bestuivingsprocedure, waarbij bloemen handmatig worden bestuifd in het laboratorium14,15, is ook aangepast om de mate van zelfcompatibiliteit en incompatibiliteit te beoordelen. We hebben echter ook veldbestuiving gebruikt, gevolgd door het zakken van bloemen om besmetting door ongewenst stuifmeel te voorkomen, zodat de stuifmeelbuizen zich in natuurlijke omstandigheden kunnen ontwikkelen. Dit protocol is eenvoudig en duidelijk en biedt de informatie die nodig is voor de succesvolle selectie van geschikte bestuiverbomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding voor anilineblauwe kleuring
- Bereid de volgende reagentia en hulpmiddelen voor het experiment voor: een bestuiverborstel, een pincet, een potlood, sulfaatpapier, een bestuivingszak, zakken met ritssluiting, paperclips, formaldehyde, ijsazijn, absolute ethanol, centrifugebuizen, tang, lijmdruppels, glasglaasjes, coverslips, scalpels en polyethyleenglycol.
- Bereid in vitro kiemkracht met 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 en 15% sucrose. Stel de pH in op 6,0-6,2 met KOH. Gebruik een magneetroerder omdat PEG-4.000 moeilijk op te lossen is.
- Bereid de fixatieve oplossing van Carnoy, die absolute ethanol en ijsazijn is, gemengd in een verhouding van 3: 1. Bereid FAA-fixatieoplossing, die bestaat uit 40% formaldehyde, 80% ethanol en ijsazijn (1:8:1). Bereid 4 M natriumhydroxide (NaOH) en anilineblauwe oplossing, die 0,1% anilineblauw is in 0,1 M K3PO4. Gebruik een amberkleurige fles om de anilineblauwe oplossing te bewaren omdat deze lichtgevoelig is.
2. Stuifmeel verzamelen
- Ken de bloeiperiode van de experimentele bomen (Ma jia pummelo in deze studie) van tevoren. Verzamel volwassen ongeopende bloemen vanaf het begin van de bloeiperiode tot de piekbloeifase en doe ze in een zak met ritssluiting. De bloemen kunnen 24 uur bij 4 °C in de koelkast bewaard worden.
- Neem de bloemen mee naar het lab. Gebruik een pincet om de helmknoppen te verzamelen en plaats ze in een petrischaaltje met filterpapier. Verzamel helmknoppen van 20 tot 30 bloemen.
- Plaats de petrischaal met de helmknoppen gedurende 24 uur in een oven van 28 °C tot de stuifmeelkorrels droog zijn. Voor de gedetailleerde bloemorganisatie, zie Hu et al.9.
- Doe het gedroogde stuifmeel in een centrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar het stuifmeel in een luchtdichte zak met ritssluiting met kleurveranderende silicagel (droogmiddel). Sluit de zak en label de zak met de naam van de stuifmeelsoort en de datum van opslag. Het gedroogde stuifmeel kan 96 weken in een koelkast van −20 °C worden bewaard16.
3. In vitro stuifmeelkiemingstest
- Giet 300 μL vloeibaar medium in een celkweekschaal of de dop van een centrifugebuis van 2 ml en strooi het stuifmeel gelijkmatig met behulp van een bestuivingsborstel. Incubeer het stuifmeel bij 28 °C in een bevochtigde donkere omgeving gedurende 12 uur.
- Verwijder de bovenste 1 mm van de punt van een pipetpunt van 1.000 μL. Gebruik de pipet om het stuifmeel te absorberen met een kleine hoeveelheid kweekoplossing en verplaats het naar het midden van de microscoopglaas. Bedek het met een coverslip. Observeer het monster met een omgekeerde microscoop met behulp van een 10x objectief.
- Voer drie onafhankelijke replicaties uit met ongeveer dezelfde pollendichtheid voor elke replicatie17. Beheer visueel de hoeveelheid stuifmeel, zorg ervoor dat de hele petrischaal bedekt is met stuifmeel en dat elke petrischaal een bijna gelijke hoeveelheid stuifmeel bevat.
- Het gekiemde stuifmeel produceert een stuifmeelbuis met een lengte van ongeveer twee keer de diameter. Bereken de kiemkracht uit 20 visuele velden, wat het percentage gekiemd stuifmeel in alle stuifmeelvelden geeft.
4. Bestuiving
- Kies een zonnige dag zonder wind voor bestuiving. Selecteer 10 volledig ontwikkelde knoppen die op het punt staan te openen, pel de bloemblaadjes voorzichtig terug en zorg ervoor dat ze niet worden gekneusd.
- Gebruik een bestuivingsborstel om een voldoende hoeveelheid levensvatbaar stuifmeel op het oppervlak van het stigma te verspreiden en zorg ervoor dat u de stamper niet beschadigt. Gebruik voor zelfbestuiving het stuifmeel van dezelfde plant/cultivar. Gebruik voor kruisbestuiving het stuifmeel van een plant met een ander genotype.
- Bedek de bestoven bloemen met een papieren sulfaatzak. Gebruik een paperclip om de zak af te sluiten en bestuiving door genotypisch verschillende pollen te voorkomen.
- Schrijf de naam van de soort en het aantal en het tijdstip van bestuiving op het etiket. Hang het etiket op de takken bij de bestoven bloemen.
5. Bemonstering, fixatie en conservering
- Verwijder de bestuivingszakken ongeveer 3-4 dagen na de bestuiving en verzamel de bestoven bloemen in zakken met ritssluiting.
- Verwijder onmiddellijk de bloemblaadjes, recipiënten en eierstokken van de bloemen en dompel de stigma's die tot stijlen zijn versmolten onder in een centrifugebuis met een vers bereide fixatieve oplossing. Incubeer de stigma's en stijlen in de fixatieve oplossing 's nachts bij 4 °C.
- Gooi de volgende dag de fixatieve oplossing weg en was de stigma's en stijlen twee tot drie keer in 95% ethanol.
- Breng de stijlen over naar een 70% ethanoloplossing. Zorg ervoor dat het monster volledig is ondergedompeld in de oplossing. De stijlen in dit stadium kunnen 1-2 maanden bij 4 °C worden bewaard.
6. Aniline blauwe kleuring
- Was de stijlmonsters die zijn opgeslagen in 70% ethanol met gedestilleerd water drie tot vier keer. Dompel onder in 4 M NaOH-oplossing, sluit af en incubeer gedurende 60 minuten in een waterbad van 65 °C. Tijdens deze stap verandert de kleur van de stijl van geel-wit naar oranje-rood.
- Week de stijlen in gedestilleerd water gedurende 30 minuten. Gooi het gedestilleerde water weg en was de stijlen drie tot vier keer met gedestilleerd water of totdat de kleur van de stijl geel wordt.
- Plaats het monster in een buis van 10 ml, voeg het anilineblauw toe totdat het monster is gedompeld en verf gedurende 12 uur in het donker.
- Observeer de groei van de stuifmeelbuis met een fluorescentiemicroscoop.
7. Fluorescentiemicroscopie
- Voordat u de monsters observeert, plaatst u de dia op een platte tafel en voegt u twee tot drie druppels polyethyleenglycol toe aan het oppervlak van de dia.
- Was de in acht te nemen stijl met gedestilleerd water. Gebruik een scalpel om het in twee helften langs de lengteas te verdelen. Plaats de ene helft van de stijl op de glazen plaat en dek af met een coverslip.
- Plaats de dia op het podium van de microscoop boven het diafragma en visualiseer met behulp van een objectief van 10x. Gebruik het DAPI-filter (excitatie: 325-375 nm; emissie: 435-485 nm). Observeer vijf stijlen voor elk type bestuiving. Observeer de groei van de stuifmeelbuis.
8. PCR-gebaseerde S-genotype-identificatie
- Extraheer het genomische DNA uit het stigmamonster met behulp van de CTAB-methode18.
- Doe de verzamelde bladeren in een centrifugebuis van 2 ml en vries ze in vloeibare stikstof. Bereid HCl:EDTA:NaCl:H2O-buffer in een verhouding van 1:1:3:5 en een chloroform isoamylalcoholmengsel in een verhouding van 24:1
- Voeg 10 ml van de bereide buffer, 0,2 g CTAB en 200 μl mercaptoethanol toe aan een centrifugebuis van 50 ml en doe ze gedurende 5 minuten in een waterbad bij 65 °C totdat de oplossing helder en transparant wordt.
- Doe de messen in een vijzel, voeg de bevroren monsters toe, voeg vloeibare stikstof toe en maal. Doe het gemalen monster in een centrifugebuis van 2 ml, voeg 600 μL CTAB-mengsel toe, doe het gedurende 60 minuten in een waterbad bij 65 °C en meng het elke 30 minuten ondersteboven.
- Voeg 700 μL van het chloroform isoamylalcoholmengsel (24:1) toe en meng ondersteboven gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 24 °C bij 12.000 x g gedurende 10 minuten, pipetteer het supernatant en breng over in een centrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 60 μL 5 M NaCl-oplossing en 1 ml absolute ethanol toe en meng ondersteboven. Invriezen bij −20 °C gedurende 30 minuten en centrifugeren bij 24 °C en 9.000 x g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant weg, voeg 1 ml 70% ethanoloplossing toe en laat 1-2 uur op kamertemperatuur staan. Centrifugeer bij 24 °C, 9.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg, zuig de overtollige ethanoloplossing aan en droog gedurende 5 minuten aan de lucht.
- Voeg 100 μL steriel water toe om op te lossen, meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer en vries in in een vriezer van -4 °C voor langdurige opslag.
- Configureer het RT-PCR-reactiesysteem. Bereid het volgende reactiemengsel voor 10 μL met 5 μL 2x PCRMix, 0,25 μL elk van voorwaartse en omgekeerde primer, 1 μL DNA (100 ng / μL) en 3,5 μL van H2O.
- Stel het PCR-programma in volgens tabel 1. Het PCR-programma voor alle isovormen was 95 °C gedurende 5 min 32x (95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 1 min) en 72 °C gedurende 5 min. Scheid de producten op 1,5% TAE-agarose gels en fotografeer9. Controleer het gespecificeerde S-genotype met behulp van genomisch DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de experimenten die hier werden gedaan, werden volwassen bloemen geselecteerd, de helmknoppen verzameld, gedroogd in een oven en het stuifmeel werd gedurende 12 uur ontkiemd bij 28 °C. De levensvatbaarheid van stuifmeel en de kiemkracht werden gekwantificeerd zoals weergegeven in figuur 1.
Citrus werd handmatig bestoven en de pollencompatibiliteit en incompatibiliteit werden beoordeeld met behulp van anilineblauwe kleuring en fluorescentiemicroscopie. Het compatibele stuifmeel kan ontkiemen op het oppervlak van het stigma en een normale stuifmeelbuis produceren die kan groeien en uiteindelijk kan leiden tot bevruchting in de eierstok. Incompatibele stuifmeelbuizen daarentegen groeiden door ongeveer tweederde van de stijl en stopten vervolgens met groeien (figuur 2).
Om het S-genotype te identificeren, werd totaal DNA uit de plant geëxtraheerd. Op basis van de volgorde van de S-locus werden specifieke primers ontworpen die nuttig waren voor het versterken van een deel van de S-locus in de PCR-reacties. De versterkingsproducten werden geanalyseerd met behulp van agarosegel-elektroforese. De versterkte banden werden gedetecteerd (tussen 500-1.000 bp). Het overeenkomstige S-genotype werd geïdentificeerd (figuur 3). Met deze methode hebben we de S-genotypen van 63 pummelo-kiemplasmabronnen geïdentificeerd7. Onze groep heeft 21 S-haplotypen geïdentificeerd in verschillende citrussoorten met behulp van deze methode19 (tabel 2).
Figuur 1: Verschillende snelheden van stuifmeelkieming. Ontkieming en groei van het stuifmeel. (A) Het levensvatbare stuifmeel heeft een hogere kiemkracht en er kan een normale stuifmeelbuis worden gekweekt. (B) Het niet-levensvatbare of minder levensvatbare stuifmeel heeft een veel lagere kiemkracht en er kunnen weinig stuifmeelbuizen groeien. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentiemicroscopiebeelden van stuifmeelbuizen in stampers na bestuiving. (A) Zelfcompatibele stamper met talrijke groeiende stuifmeelbuizen. (B) Zelfincompatibele stamper met stuifmeelbuisgroei die binnen de stijl is gestopt. Afkortingen: Pt = stuifmeelbuis; VB = vaatbundel. Schaalstaven = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Specifieke amplificatie van het S-RNase gen van Ma jia pummelo. Na PCR-versterking en gel-elektroforese bleek dat de twee versterkte banden S10 en S16 het helderst waren. Deze gegevens geven aan dat het genotype van Ma jia pummelo S10 en S16 was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Het reactiesysteem dat wordt gebruikt voor de pcr-gebaseerde S-genotype-identificatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Lijst van de primers voor 21 S genotypes in citrus geïdentificeerd door onze groep. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In fruitgewassen zijn zowel parthenocarpie als SI belangrijke eigenschappen omdat ze de weg vrijmaken voor pitloos fruit - een eigenschap die zeer wordt gewaardeerd door consumenten. Zelfincompatibiliteit bevordert de afwijzing van zelfpollen en voorkomt zo inteelt20. Onder citrusvruchten is pummelo een zelfincompatibele variëteit7. Bijna 40% van alle angiospermsoorten vertonen SI21. Deze eigenschap voorkomt het zetten van fruit, verlaagt de opbrengst en brengt enorme economische verliezen met zich mee voor telers. Om dit probleem op te lossen, nemen boeren bestuiverbomen op in hun boomgaarden. De selectie van geschikte bestuiverbomen is echter een uitdagende taak die tijdrovende laboratoriumexperimenten vereist. Om deze problemen op te lossen, hebben we een snelle methode ontwikkeld voor het identificeren van SI-genotypen en het bepalen van de pollencompatibiliteit en onverenigbaarheden van verschillende citrusvariëteiten om de nauwkeurige selectie van bestuiverbomen te vergemakkelijken. Bovendien kunnen de levensvatbaarheid van stuifmeel en de kiemkracht ook worden bepaald met behulp van de in vitro methode beschreven in dit protocol.
Er zijn enkele rapporten over de bepaling van SI-genotypen en zelf-(in)compatibiliteit en inter-(in)compatibiliteit met behulp van een combinatie van verschillende methoden in Japanse pruim en abrikoos22,23. De ontwikkeling van S-specifieke primers is gebaseerd op de identificatie van het S-genotype. In citrus heeft de transcriptoomanalyse van stigma en stuifmeel van 64 pummelo-toetredingen negen S-RNases geïdentificeerd die specifiek tot expressie komen in de stijlen en één variant van de S-RNase. Nog eens 12 paar S-specifieke primers werden later ontwikkeld in citrus door Liang et al.7 en Wei et al.19. Ten opzichte van peer en appel zijn er echter minder S-genotypen geïdentificeerd in citrus4. De identificatie van PCR-gebaseerde S-genotypen is een cruciale stap, omdat het een basis biedt voor compatibele/incompatibele combinaties. Er zijn ook enkele beperkingen aan dit protocol. De S-genotypen van sommige citrusvariëteiten kunnen niet met deze methode worden geïdentificeerd. Deze bevinding geeft aan dat verdere uitbreiding van de S-genotypebibliotheek in citrus nodig is. Bovendien kunnen de S-specifieke primers de S-genotypen van cultivars met zeer vergelijkbare S-sequenties niet onderscheiden en dus niet-specifiek vergelijkbare S-sequenties versterken.
Al met al is deze methode, vanwege de kosteneffectiviteit en het gebruiksgemak, een effectief hulpmiddel voor het bepalen van de pollencompatibiliteit en incompatibiliteit voor verschillende citrusvariëteiten. Dit protocol kan worden gebruikt voor de selectie van geschikte bestuiverbomen en in veredelingsonderzoeksprogramma's. Het kan worden toegepast op verschillende soorten uit de Rutaceae-familie (bijv. Citrus trifoliata en Fortunella japonica) voor de selectie van bestuiverbomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.
Acknowledgments
Dit project werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
