Summary
Ce protocole fournit une méthode rapide pour déterminer la compatibilité et l’incompatibilité du pollen chez les cultivars d’agrumes.
Abstract
Citrus utilise l’auto-incompatibilité basée sur la S-RNase pour rejeter l’auto-pollen et, par conséquent, nécessite des arbres pollinisateurs à proximité pour une pollinisation et une fécondation réussies. Cependant, l’identification de variétés appropriées pour servir de pollinisateurs est un processus qui prend beaucoup de temps. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode rapide d’identification des cultivars d’agrumes compatibles avec la pollinisation qui utilise l’électrophorèse sur gel d’agarose et la coloration au bleu d’aniline. La compatibilité du pollen est déterminée en fonction de l’identification des génotypes S en extrayant l’ADN total et en effectuant des tests de génotypage basés sur la PCR avec des amorces spécifiques. De plus, les styles sont collectés 3-4 jours après la pollinisation manuelle et une coloration au bleu aniline est effectuée. Enfin, l’état de croissance des tubes polliniques est observé avec un microscope à fluorescence. La compatibilité et l’incompatibilité du pollen peuvent être établies en observant si la croissance du tube pollinique est normale ou supprimée, respectivement. En raison de sa simplicité et de son rapport coût-efficacité, cette méthode est un outil efficace pour déterminer la compatibilité et l’incompatibilité du pollen de différentes variétés d’agrumes afin d’établir des groupes d’incompatibilité et des relations d’incompatibilité entre différents cultivars. Cette méthode fournit des informations essentielles pour la sélection réussie d’arbres pollinisateurs appropriés et, ainsi, facilite l’établissement de nouveaux vergers et la sélection de parents appropriés pour les programmes de reproduction.
Introduction
L’auto-incompatibilité (SI) est un mécanisme génétiquement contrôlé présent chez environ 40% des espèces d’angiospermes. Dans ce processus, le pistil rejette le pollen d’une plante avec le même génotype SI et, ainsi, empêche l’autofécondation 1,2. Ma jia pummelo est une variété locale de la province de Jinasu, en Chine, avec les excellentes qualités de gros fruits roses, une riche teneur en jus, un goût aigre-doux et une peau épaisse3. Bien que le SI favorise le croisement, il a un impact négatif sur le rendement et la qualité des fruits4 et nécessite des arbres pollinisateurs appropriés avec des génotypes SI distincts pour des taux de nouaison fiables et des rendements élevés. À l’heure actuelle, il existe deux principaux types d’IS, l’auto-incompatibilité sporophytique (SSI), représentée par les Brassicaceae, et l’auto-incompatibilité gamétophytique (GSI), représentée par Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae et Solanaceae 5,6,7,8.
Les agrumes sont l’une des cultures fruitières les plus importantes au monde. Le système GSI basé sur la S-RNase se retrouve dans de nombreuses accessions d’agrumes et influence négativement le taux de nouaison9. Dans ce système, le SI est contrôlé par le locus S, un locus polymorphe unique avec deux allèles complexes qui portent les déterminants du pistil S et les déterminants S du pollen7. Le déterminant féminin est la S ribonucléase (S-RNase), et le déterminant masculin est le locus S F-box (SLF)7. Les cellules du pistil sécrètent des protéines S-RNase. Les S-RNases non-soi sont reconnues par les protéines SLF, ce qui conduit à l’ubiquitination et à la dégradation des S-RNases non-soi par la voie du protéasome 26S. En revanche, les auto-S-RNases sont capables d’accumuler et d’inhiber la croissance du tube pollinique (PT) parce qu’elles échappent aux protéines SLF et, par conséquent, sont empêchées d’ubiquitinzation10,11,12,13.
Ici, nous rapportons une technique in vivo qui est utile pour identifier les génotypes S et les degrés de compatibilité et d’incompatibilité du pollen. Le protocole consiste à extraire l’ADN total des feuilles et à prédire le génotype S à l’aide d’amorces spécifiques S. De plus, la coloration au bleu d’aniline et la microscopie à fluorescence suivie d’une pollinisation manuelle fournissent des preuves du degré de compatibilité et d’incompatibilité. La procédure de pollinisation semi-in vivo, qui implique la pollinisation manuelle des fleurs en laboratoire14,15, a également été adaptée pour évaluer les degrés d’autocompatibilité et d’incompatibilité. Cependant, nous avons également utilisé la pollinisation au champ suivie de l’ensachage des fleurs pour éviter la contamination par du pollen indésirable afin de permettre aux tubes polliniques de se développer dans des conditions naturelles. Ce protocole est simple et direct et fournit les informations nécessaires à la sélection réussie d’arbres pollinisateurs appropriés.
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Protocol
1. Préparation pour la coloration au bleu d’aniline
- Préparez les réactifs et les outils suivants pour l’expérience : une brosse à pollinisateur, une pince à épiler, un crayon, du papier sulfate, un sac de pollinisation, des sacs à fermeture à glissière, des trombones, du formaldéhyde, de l’acide acétique glacial, de l’éthanol absolu, des tubes centrifugeuses, des pinces, des compte-gouttes de colle, des lames de verre, des lames de couverture, des scalpels et du polyéthylène glycol.
- Préparer in vitro le milieu de germination contenant 0,02 % de MgSO4, 0,01 % de KNO 3, 0,03 % de Ca(NO 3)2, 0,01 % deH3BO 3, 20 % de PEG-4000 et 15 % de saccharose. Ajustez le pH à 6,0-6,2 avec KOH. Utilisez un agitateur magnétique car le PEG-4 000 est difficile à dissoudre.
- Préparer la solution fixatrice de Carnoy, qui est de l’éthanol absolu et de l’acide acétique glacial mélangés dans un rapport de 3:1. Préparer la solution de fixation FAA, qui contient 40% de formaldéhyde, 80% d’éthanol et d’acide acétique glacial (1:8:1). Préparer 4 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) et la solution de bleu d’aniline, qui contient 0,1 % de bleu d’aniline dans 0,1 M K3PO4. Utilisez un flacon ambré pour conserver la solution de bleu d’aniline, car elle est sensible à la lumière.
2. Collecte de pollen
- Connaître à l’avance la période de floraison des arbres expérimentaux (Ma jia pummelo dans cette étude). Récoltez les fleurs matures non ouvertes du début de la période de floraison jusqu’au stade de floraison maximale et mettez-les dans un sac à fermeture à glissière. Les fleurs peuvent être conservées à 4 °C au réfrigérateur pendant 24 h.
- Apportez les fleurs au laboratoire. Utilisez une pince à épiler pour recueillir les anthères et placez-les dans une boîte de Petri contenant du papier filtre. Collectez des anthères de 20 à 30 fleurs.
- Placer la boîte de Petri contenant les anthères dans un four à 28 °C pendant 24 h jusqu’à ce que les grains de pollen sèchent. Pour l’organisation détaillée des fleurs, voir Hu et al.9.
- Mettez le pollen séché dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Conservez le pollen dans un sac à fermeture à glissière hermétique contenant du gel de silice à changement de couleur (déshydratant). Fermez le sac et étiquetez-le avec le nom de la variété de pollen et la date de stockage. Le pollen séché peut être conservé dans un réfrigérateur à −20 °C pendant 96 semaines16.
3. Test de germination pollinique in vitro
- Versez 300 μL de milieu liquide dans une boîte de culture cellulaire ou le bouchon d’un tube à centrifuger de 2 mL et saupoudrez le pollen uniformément à l’aide d’une brosse de pollinisation. Incuber le pollen à 28 °C dans un environnement sombre humidifié pendant 12 h.
- Retirez le dessus de 1 mm de l’embout d’une pipette de 1 000 μL. Utilisez la pipette pour absorber le pollen avec une petite quantité de solution de culture et déplacez-le au centre de la lame de microscope. Couvrez-le d’un bordereau. Observez l’échantillon avec un microscope inversé à l’aide d’un objectif 10x.
- Effectuer trois répétitions indépendantes en utilisant approximativement la même densité pollinique pour chaque répétition17. Gérez visuellement la quantité de pollen, en vous assurant que toute la boîte de Petri est recouverte de pollen et que chaque boîte de Petri contient une quantité presque égale de pollen.
- Le pollen germé produit un tube pollinique d’une longueur environ deux fois supérieure à son diamètre. Calculer le taux de germination à partir de 20 champs visuels, ce qui donne le pourcentage de pollen germé dans tous les champs polliniques.
4. Pollinisation
- Choisissez une journée ensoleillée sans vent pour la pollinisation. Sélectionnez 10 bourgeons complètement développés sur le point de s’ouvrir, décollez soigneusement les pétales et veillez à ne pas les meurtrir.
- Utilisez un pinceau de pollinisation pour répandre une quantité suffisante de pollen viable sur la surface du stigmate et veillez à ne pas endommager le pistil. Pour l’autopollinisation, utilisez le pollen du même plant/cultivar. Pour la pollinisation croisée, utilisez le pollen d’une plante avec un génotype différent.
- Couvrir les fleurs pollinisées avec un sac en papier sulfate. Utilisez un trombone pour sceller le sac et empêcher la pollinisation par des pollens génotypiquement distincts.
- Inscrivez le nom de l’espèce ainsi que le nombre et l’heure de la pollinisation sur l’étiquette. Accrochez l’étiquette sur les branches près des fleurs pollinisées.
5. Échantillonnage, fixation et conservation
- Retirez les sacs de pollinisation environ 3-4 jours après la pollinisation et recueillez les fleurs pollinisées dans des sacs à fermeture à glissière.
- Retirez immédiatement les pétales, les récipients et les ovaires des fleurs et plongez les stigmates fusionnés aux styles dans un tube centrifuge contenant une solution fixatrice fraîchement préparée. Incuber les stigmates et les styles dans la solution fixatrice pendant une nuit à 4 °C.
- Le lendemain, jetez la solution fixatrice et lavez les stigmates et les styles deux à trois fois dans de l’éthanol à 95%.
- Transférer les styles dans une solution à 70% d’éthanol. Assurez-vous que l’échantillon est complètement immergé dans la solution. Les styles à ce stade peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1-2 mois.
6. Coloration au bleu aniline
- Lavez les échantillons de style stockés dans de l’éthanol à 70% avec de l’eau distillée trois à quatre fois. Plonger dans une solution de NaOH de 4 M, sceller et incuber dans un bain-marie à 65 °C pendant 60 min. Au cours de cette étape, la couleur du style passe du jaune-blanc au rouge orangé.
- Faire tremper les styles dans de l’eau distillée pendant 30 min. Jetez l’eau distillée et lavez les styles avec de l’eau distillée trois à quatre fois ou jusqu’à ce que la couleur du style devienne jaune.
- Placer l’échantillon dans un tube de 10 mL, ajouter le bleu d’aniline jusqu’à ce que l’échantillon soit trempé et colorer pendant 12 h dans l’obscurité.
- Observez la croissance du tube pollinique avec un microscope à fluorescence.
7. Microscopie à fluorescence
- Avant d’observer les échantillons, placez la lame sur une table plate et ajoutez deux à trois gouttes de polyéthylène glycol à la surface de la lame.
- Lavez le style à observer avec de l’eau distillée. Utilisez un scalpel pour le diviser en deux moitiés le long de l’axe longitudinal. Placez la moitié du style sur la lame de verre et couvrez-la d’un couvercle.
- Placez la lame sur la scène du microscope au-dessus de l’ouverture et visualisez à l’aide d’un objectif 10x. Utilisez le filtre DAPI (excitation : 325-375 nm ; émission : 435-485 nm). Observez cinq styles pour chaque type de pollinisation. Observez la croissance du tube pollinique.
8. Identification du génotype S par PCR
- Extraire l’ADN génomique de l’échantillon de stigmatisation en utilisant la méthode CTAB18.
- Mettez les feuilles recueillies dans un tube à centrifuger de 2 ml et congelez-les dans de l’azote liquide. Préparer le tampon HCl:EDTA:NaCl:H2Odans un rapport de 1:1:3:5 et un mélange d’alcool isoamylique chloroforme dans un rapport de 24:1
- Ajouter 10 mL du tampon préparé, 0,2 g de CTAB et 200 μL de mercaptoéthanol dans un tube à centrifuger de 50 mL et les mettre au bain-marie à 65 °C pendant 5 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire et transparente.
- Mettez les lames dans un mortier, ajoutez les échantillons congelés, ajoutez de l’azote liquide et broyez. Mettez l’échantillon broyé dans un tube à centrifuger de 2 mL, ajoutez 600 μL de mélange CTAB, mettez-le au bain-marie à 65 °C pendant 60 minutes et mélangez-le à l’envers toutes les 30 minutes.
- Ajouter 700 μL du mélange d’alcool isoamylique chloroforme (24:1) et mélanger à l’envers pendant 10 min. Centrifuger à 24 °C à 12 000 x g pendant 10 min, pipeter le surnageant et transférer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
- Ajouter 60 μL de solution de NaCl 5 M et 1 mL d’éthanol absolu, et mélanger à l’envers. Congeler à −20 °C pendant 30 min et centrifuger à 24 °C et 9 000 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de solution d’éthanol à 70 % et laisser à température ambiante pendant 1 à 2 h. Centrifuger à 24 °C, 9 000 x g pendant 5 min, jeter le surnageant, aspirer l’excès de solution d’éthanol et sécher à l’air pendant 5 min.
- Ajouter 100 μL d’eau stérile pour la dissoudre, mesurer la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre et congeler dans un congélateur à -4 °C pour un stockage à long terme.
- Configurez le système de réaction RT-PCR. Préparer le mélange réactionnel suivant pour 10 μL contenant 5 μL de 2x PCRMix, 0,25 μL chacun d’amorce avant et arrière, 1 μL d’ADN (100 ng / μL) et 3,5 μL de H2O.
- Configurez le programme de PCR conformément au tableau 1. Le programme de PCR pour toutes les isoformes était de 95 °C pendant 5 min 32x (95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min) et de 72 °C pendant 5 min. Séparer les produits sur des gels TAE-agarose à 1,5% et photographier9. Vérifier le génotype S spécifié à l’aide de l’ADN génomique.
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Representative Results
Pour les expériences faites ici, des fleurs matures ont été sélectionnées, les anthères ont été collectées, séchées dans un four et le pollen a germé à 28°C pendant 12 h. La viabilité du pollen et les taux de germination ont été quantifiés comme le montre la figure 1.
Les agrumes ont été pollinisés manuellement, et la compatibilité et l’incompatibilité du pollen ont été évaluées à l’aide de la coloration au bleu d’aniline et de la microscopie à fluorescence. Le pollen compatible pourrait germer à la surface du stigmate et produire un tube pollinique normal qui pourrait se développer et finalement conduire à la fécondation dans l’ovaire. En revanche, les tubes polliniques incompatibles se sont développés pendant environ les deux tiers du style, puis ont cessé de croître (Figure 2).
Pour identifier le génotype S, l’ADN total a été extrait de la plante. Des amorces spécifiques ont été conçues sur la base de la séquence du locus S qui ont été utiles pour amplifier une partie du locus S dans les réactions de PCR. Les produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Les bandes amplifiées ont été détectées (entre 500 et 1 000 pb). Le génotype S correspondant a été identifié (figure 3). Par cette méthode, nous avons identifié les génotypes S de 63 ressources de germoplasmepummelo 7. Notre groupe a identifié 21 S-haplotypes chez différentes espèces d’agrumes en utilisant cette méthode19 (tableau 2).
Figure 1 : Différents taux de germination du pollen. Germination et croissance du pollen. (A) Le pollen viable a un taux de germination plus élevé et un tube pollinique normal peut être cultivé. (B) Le pollen non viable ou moins viable a un taux de germination beaucoup plus faible et peu de tubes polliniques peuvent se développer. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images en microscopie à fluorescence des tubes polliniques dans les pistils après la pollinisation. (A) Pistil autocompatible avec de nombreux tubes polliniques en croissance. (B) Pistil auto-incompatible avec croissance du tube pollinique arrêtée dans le style. Abréviations : Pt = tube pollinique; vb = faisceau vasculaire. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Amplification spécifique du gène S-RNase de Ma jia pummelo. Après amplification par PCR et électrophorèse sur gel, il a été constaté que les deux bandes amplifiées S10 et S16 étaient les plus brillantes. Ces données indiquent que le génotype de Ma jia pummelo était S10 et S16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Le système de réaction utilisé pour l’identification du génotype S par PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Liste des amorces de 21 génotypes S chez les agrumes identifiés par notre groupe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Dans les cultures fruitières, la parthénocarpie et le SI sont des caractères importants car ils ouvrent la voie à des fruits sans pépins - un trait très apprécié par les consommateurs. L’auto-incompatibilité favorise le rejet de l’auto-pollen et, ainsi, empêche la consanguinité20. Parmi les agrumes, le pummelo est une variété auto-incompatible7. Près de 40% de toutes les espèces d’angiospermes présentent SI21. Ce trait empêche la nouaison, réduit le rendement et entraîne d’énormes pertes économiques pour les producteurs. Pour résoudre ce problème, les agriculteurs incluent des arbres pollinisateurs dans leurs vergers. Cependant, la sélection d’arbres pollinisateurs appropriés est une tâche difficile qui nécessite des expériences de laboratoire qui prennent beaucoup de temps. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé une méthode rapide pour identifier les génotypes SI et déterminer les compatibilités et incompatibilités polliniques de différentes variétés d’agrumes afin de faciliter la sélection précise des arbres pollinisateurs. De plus, la viabilité du pollen et les taux de germination peuvent également être déterminés à l’aide de la méthode in vitro décrite dans ce protocole.
Il existe quelques rapports sur la détermination des génotypes SI et l’auto-(in)compatibilité et l’inter-(in)compatibilité en utilisant une combinaison de différentes méthodes chez la prune japonaise et l’abricot22,23. Le développement d’amorces spécifiques S repose sur l’identification du génotype S. Chez les agrumes, l’analyse du transcriptome de la stigmatisation et du pollen de 64 accessions de pummelo a identifié neuf S-RNases spécifiquement exprimées dans les styles et une variante de la S-RNase. 12 autres paires d’amorces spécifiques S ont été développées plus tard dans les agrumes par Liang et al.7 et Wei et al.19. Cependant, par rapport à la poire et à la pomme, moins de génotypes S ont été identifiés dans les agrumes4. L’identification des génotypes S basés sur la PCR est une étape critique, car elle fournit une base pour des combinaisons compatibles/incompatibles. Il y a aussi certaines limitations à ce protocole. Les génotypes S de certaines variétés d’agrumes ne peuvent pas être identifiés à l’aide de cette méthode. Cette découverte indique qu’il est nécessaire d’élargir davantage la bibliothèque de génotypes S dans les agrumes. De plus, les amorces spécifiques de S ne peuvent pas distinguer les génotypes S de cultivars avec des séquences S très similaires et, par conséquent, amplifient de manière non spécifique des séquences S similaires.
Dans l’ensemble, en raison de sa rentabilité et de sa facilité d’utilisation, cette méthode est un outil efficace pour déterminer la compatibilité et l’incompatibilité du pollen pour différentes variétés d’agrumes. Ce protocole peut être utilisé pour la sélection d’arbres pollinisateurs appropriés et dans les programmes de recherche en sélection. Il peut être appliqué à plusieurs espèces de la famille des Rutacées (p. ex. Citrus trifoliata et Fortunella japonica) pour la sélection des arbres pollinisateurs.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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