Summary
Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.
Abstract
Os citros usam a autoincompatibilidade baseada em S-RNase para rejeitar o autopólen e, portanto, requer árvores polinizadoras próximas para o sucesso da polinização e fertilização. No entanto, identificar variedades adequadas para servir como polinizadores é um processo demorado. Para resolver este problema, desenvolvemos um método rápido para identificar cultivares de citros compatíveis com polinização que utiliza eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de anilina. A compatibilidade polínica é determinada com base na identificação de genótipos S por meio da extração de DNA total e da realização de ensaios de genotipagem baseados em PCR com primers específicos. Além disso, os estilos são coletados 3-4 dias após a polinização manual, e a coloração com azul de anilina é realizada. Finalmente, o estado de crescimento dos tubos polínicos é observado com um microscópio de fluorescência. A compatibilidade e a incompatibilidade polínica podem ser estabelecidas observando-se se o crescimento do tubo polínico é normal ou suprimido, respectivamente. Devido à sua simplicidade e custo-efetividade, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica de diferentes variedades de citros para estabelecer grupos de incompatibilidade e relações de incompatibilidade entre diferentes cultivares. Este método fornece informações essenciais para o sucesso da seleção de polinizadores adequados e, assim, facilita o estabelecimento de novos pomares e a seleção de genitores apropriados para programas de melhoramento.
Introduction
A autoincompatibilidade (IE) é um mecanismo geneticamente controlado presente em aproximadamente 40% das espécies de angiospermas. Nesse processo, o pistilo rejeita o pólen de uma planta com o mesmo genótipo SI e, assim, impede a autofecundação 1,2. Ma jia pummelo é uma variedade local na província de Jinagsu, China, com as excelentes qualidades de frutas grandes e cor-de-rosa, um rico teor de suco, um sabor doce e azedo e uma casca grossa3. Embora o SI promova o cruzamento, ele impacta negativamente a produtividade e a qualidade dos frutos4 e necessita de árvores polinizadoras adequadas com genótipos distintos de SI para taxas de frutificação confiáveis e altas produtividades. Atualmente, existem dois tipos principais de SI, a autoincompatibilidade esporofítica (ISC), representada por Brassicaceae, e a autoincompatibilidade gametofítica (IGS), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
A citricultura é uma das culturas frutíferas mais importantes do mundo. O sistema GSI à base de S-RNase é encontrado em muitos acessos de citros e influencia negativamente a taxa de frutificação9. Nesse sistema, o SI é controlado pelo locus S, um único locus polimórfico com dois alelos complexos que carregam determinantes do pistilo S e determinantes do pólen S 7. O determinante feminino é a ribonuclease S (S-RNase), e o masculino é o locus S F-box (SLF)7. As células do pistilo secretam proteínas S-RNase. As RNAs-S não-auto são reconhecidas pelas proteínas SLF, o que leva à ubiquitinação e degradação das S-RNases não-auto pela via do proteassoma 26S. Em contrapartida, as auto-S-RNases são capazes de acumular e inibir o crescimento do tubo polínico (TP), pois escapam das proteínas SLF e, portanto, são impedidas de ubiquitinzação10,11,12,13.
Aqui, relatamos uma técnica in vivo que é útil para identificar genótipos S e graus de compatibilidade e incompatibilidade polínica. O protocolo envolve a extração de DNA total das folhas e a predição do genótipo S por meio de primers S-específicos. Além disso, a coloração com azul de anilina e a microscopia de fluorescência seguida de polinização manual fornecem evidências do grau de compatibilidade e incompatibilidade. O procedimento de polinização semi in vivo, que envolve a polinização manual das flores em laboratório14,15, também foi adaptado para avaliar os graus de autocompatibilidade e incompatibilidade. No entanto, também utilizamos a polinização a campo seguida do ensacamento das flores para evitar a contaminação por pólen indesejado para permitir que os tubos polínicos se desenvolvam em condições naturais. Este protocolo é simples e direto e fornece as informações necessárias para a seleção bem-sucedida de árvores polinizadoras adequadas.
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Protocol
1. Preparação para coloração de azul de anilina
- Prepare os seguintes reagentes e ferramentas para o experimento: escova polinizadora, pinça, lápis, papel sulfato, saco de polinização, sacos zip lock, clipes de papel, formaldeído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinças, conta-gotas de cola, lâminas de vidro, lamínulas, bisturis e polietilenoglicol.
- Preparar meio de germinação in vitro contendo 0,02% de MgSO4, 0,01% de KNO 3, 0,03% de Ca(NO 3)2, 0,01% de H 3 de BO 3, 20% de PEG-4000 e 15% de sacarose. Ajuste o pH para 6,0-6,2 com KOH. Use um agitador magnético, pois o PEG-4.000 é difícil de dissolver.
- Prepare a solução fixadora de Carnoy, que é etanol absoluto e ácido acético glacial misturados na proporção de 3:1. Preparar solução de fixação de FAA, que é formaldeído a 40%, etanol a 80% e ácido acético glacial (1:8:1). Preparar solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4 M e azul de anilina, que é 0,1% de azul de anilina em 0,1 M K3PO4. Use um frasco de âmbar para armazenar a solução de azul de anilina porque é sensível à luz.
2. Coleta de pólen
- Conhecer antecipadamente o período de floração das árvores experimentais (Ma jia pummelo neste estudo). Colete flores maduras fechadas desde o início do período de floração até o estágio de pico de floração e coloque-as em um saco zip lock. As flores podem ser armazenadas a 4 °C na geladeira por 24 h.
- Leve as flores para o laboratório. Use uma pinça para coletar as anteras e coloque-as em uma placa de Petri contendo papel de filtro. Colete anteras de 20 a 30 flores.
- Colocar a placa de Petri contendo as anteras em estufa a 28 °C durante 24 h até os grãos de pólen secarem. Para a organização detalhada das flores, ver Hu et al.9.
- Coloque o pólen seco em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Guarde o pólen em um saco zip lock hermético contendo sílica gel (dessecante) que muda de cor. Feche o saco e rotule-o com o nome da variedade de pólen e a data de armazenamento. O pólen seco pode ser armazenado em geladeira a −20 °C por 96 semanas16.
3. Teste de germinação in vitro de pólen
- Despeje 300 μL de meio líquido em uma placa de cultura celular ou na tampa de um tubo de centrífuga de 2 mL e polvilhe o pólen uniformemente com a ajuda de uma escova de polinização. Incubar o pólen a 28 °C em ambiente escuro umedecido por 12 h.
- Remova o 1 mm superior da ponta de uma pipeta de 1.000 μL. Use a pipeta para absorver o pólen com uma pequena quantidade de solução de cultura e mova-o para o centro da lâmina do microscópio. Cubra-o com uma lamínula. Observe o espécime com microscópio invertido com objetiva de 10x.
- Realizar três réplicas independentes usando aproximadamente a mesma densidade polínica para cada réplica17. Gerencie visualmente a quantidade de pólen, certificando-se de que toda a placa de Petri esteja coberta com pólen e que cada placa de Petri tenha uma quantidade quase igual de pólen.
- O pólen germinado produz um tubo polínico com comprimento aproximadamente duas vezes maior que o seu diâmetro. Calcular a taxa de germinação a partir de 20 campos visuais, que dá a porcentagem de pólen germinado em todos os campos de pólen.
4. Polinização
- Escolha um dia ensolarado sem vento para polinização. Selecione 10 botões totalmente desenvolvidos prestes a abrir, descasque as pétalas com cuidado e tome cuidado para não machucá-las.
- Use uma escova de polinização para espalhar uma quantidade suficiente de pólen viável na superfície do estigma e tome cuidado para não danificar o pistilo. Para a autopolinização, utilizar o pólen da mesma planta/cultivar. Para a polinização cruzada, utilizar o pólen de uma planta com genótipo diferente.
- Cubra as flores polinizadas com um saco de papel sulfato. Use um clipe de papel para selar o saco e evitar a polinização por pólenes genotipicamente distintos.
- Escreva o nome da espécie e o número e o tempo de polinização no rótulo. Pendure o rótulo nos galhos próximos às flores polinizadas.
5. Amostragem, fixação e preservação
- Retirar os sacos de polinização aproximadamente 3-4 dias após a polinização e coletar as flores polinizadas em sacos zip lock.
- Remova imediatamente as pétalas, recipientes e ovários das flores e mergulhe os estigmas fundidos em um tubo de centrífuga contendo uma solução fixadora recém-preparada. Incubar os estigmas e estilos na solução fixadora durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, descarte a solução fixadora e lave os estigmas e estilos de duas a três vezes em etanol 95%.
- Transfira os estilos para uma solução de etanol a 70%. Certifique-se de que a amostra esteja completamente imersa na solução. Os estilos nesta fase podem ser armazenados a 4 °C por 1-2 meses.
6. Coloração azul de anilina
- Lavar as amostras de estilo armazenadas em etanol 70% com água destilada três a quatro vezes. Imergir em solução de NaOH 4 M, selar e incubar em banho-maria a 65 °C por 60 min. Durante esta etapa, a cor do estilo muda de amarelo-branco para laranja-vermelho.
- Mergulhe os estilos em água destilada por 30 min. Descarte a água destilada e lave os estilos com água destilada de três a quatro vezes ou até que a cor do estilo fique amarela.
- Colocar a amostra num tubo de 10 ml, adicionar o azul de anilina até à imersão da amostra e corar durante 12 h no escuro.
- Observe o crescimento do tubo polínico com um microscópio de fluorescência.
7. Microscopia de fluorescência
- Antes de observar os espécimes, coloque a lâmina sobre uma mesa plana e adicione duas a três gotas de polietilenoglicol à superfície da lâmina.
- Lave o estilo a ser observado com água destilada. Use um bisturi para dividi-lo em duas metades ao longo do eixo longitudinal. Coloque metade do estilo na lâmina de vidro e cubra com uma tampa.
- Coloque a lâmina no palco do microscópio acima da abertura e visualize usando uma objetiva de 10x. Use o filtro DAPI (excitação: 325-375 nm; emissão: 435-485 nm). Observe cinco estilos para cada tipo de polinização. Observe o crescimento do tubo polínico.
8. Identificação do genótipo S baseada em PCR
- Extrair o DNA genômico da amostra de estigma usando o método CTAB18.
- Coloque as folhas coletadas em um tubo de centrífuga de 2 mL e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Preparar HCl:EDTA:NaCl:H2O tampão na proporção de 1:1:3:5 e uma mistura de clorofórmio isoamílico na proporção de 24:1
- Adicionar 10 ml do tampão preparado, 0,2 g de CTAB e 200 μL de mercaptoetanol a um tubo de centrífuga de 50 ml e colocá-los em banho-maria a 65 °C durante 5 minutos até que a solução se torne límpida e transparente.
- Coloque as lâminas em uma argamassa, adicione as amostras congeladas, adicione nitrogênio líquido e triture. Colocar a amostra moída num tubo de centrifugação de 2 ml, adicionar 600 μL de mistura de CTAB, colocá-la em banho-maria a 65 °C durante 60 minutos e misturá-la de cabeça para baixo a cada 30 minutos.
- Adicionar 700 μL da mistura de álcool clorofórmio isoamílico (24:1) e misturar de cabeça para baixo durante 10 minutos. Centrifugar a 24 °C a 12.000 x g por 10 min, pipetar o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 60 μL de solução de NaCl 5 M e 1 mL de etanol absoluto e misturar de cabeça para baixo. Congelar a -20 °C por 30 min e centrifugar a 24 °C e 9.000 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL de solução de etanol a 70% e deixe em temperatura ambiente por 1-2 h. Centrifugar a 24 °C, 9.000 x g por 5 min, descartar o sobrenadante, aspirar o excesso de solução de etanol e secar ao ar por 5 min.
- Adicionar 100 μL de água estéril para dissolver, medir a concentração de ADN com um espectrofotómetro e congelar num congelador a -4 °C para armazenamento a longo prazo.
- Configure o sistema de reação RT-PCR. Preparar a seguinte mistura de reacção para 10 μL contendo 5 μL de 2x PCRMix, 0,25 μL cada de primer para a frente e para a reviravolta, 1 μL de ADN (100 ng/ μL) e 3,5 μL de H2O.
- Configure o programa PCR de acordo com a Tabela 1. O programa de PCR para todas as isoformas foi de 95 °C por 5 min 32x (95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 1 min) e 72 °C por 5 min. Separe os produtos em géis TAE-agarose 1,5% e fotografe9. Verifique o genótipo S especificado usando DNA genômico.
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Representative Results
Para os experimentos realizados foram selecionadas flores maduras, coletadas as anteras, secas em estufa e o pólen germinado a 28°C por 12 h. A viabilidade polínica e as taxas de germinação foram quantificadas como mostra a Figura 1.
Os citros foram polinizados manualmente, e a compatibilidade e incompatibilidade polínica foram avaliadas pela coloração com azul de anilina e microscopia de fluorescência. O pólen compatível poderia germinar na superfície do estigma e produzir um tubo polínico normal que poderia crescer e, finalmente, levar à fecundação no ovário. Em contraste, tubos polínicos incompatíveis cresceram através de aproximadamente dois terços do estilo e depois pararam de crescer (Figura 2).
Para a identificação do genótipo S, foi extraído DNA total da planta. Primers específicos foram projetados com base na sequência do locus S que foram úteis para amplificar parte do locus S nas reações de PCR. Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose. As bandas amplificadas foram detectadas (entre 500-1.000 pb). O genótipo S correspondente foi identificado (Figura 3). Por esse método, foram identificados os genótipos S de 63recursos de germoplasma de pummelo7. Nosso grupo identificou 21 haplótipos S em diferentes espécies de citros usando este método19 (Tabela 2).
Figura 1: Diferentes taxas de germinação de pólen. Germinação e crescimento do pólen. (A) O pólen viável tem maior taxa de germinação, podendo ser cultivado um tubo polínico normal. (B) O pólen inviável ou menos viável tem uma taxa de germinação muito menor, e poucos tubos polínicos podem crescer. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de microscopia de fluorescência de tubos polínicos em pistilos após polinização. (A) Pistilo autocompatível com numerosos tubos polínicos em crescimento. (B) Pistilo auto-incompatível com o crescimento do tubo polínico preso dentro do estilo. Abreviações: Pt = tubo polínico; vb = feixe vascular. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Amplificação específica do gene S-RNase de Ma jia pummelo. Após amplificação por PCR e eletroforese em gel, verificou-se que as duas bandas amplificadas S10 e S16 foram as mais brilhantes. Esses dados indicam que o genótipo de Ma jia pummelo foi S10 e S16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Sistema reacional utilizado para identificação do genótipo S baseado em PCR. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Lista dos primers para 21 genótipos de S em citros identificados pelo nosso grupo. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Em fruticulturas, tanto a partenocarpia quanto o SI são características importantes, pois abrem caminho para frutos sem sementes - uma característica muito apreciada pelos consumidores. A autoincompatibilidade promove a rejeição do autopólen e, assim, previne a endogamia20. Entre os citros, o pummelo é uma variedade auto-incompatível7. Quase 40% de todas as espécies de angiospermas apresentam SI21. Essa característica impede a frutificação, diminui a produtividade e traz enormes perdas econômicas aos produtores. Para resolver esse problema, os agricultores incluem árvores polinizadoras em todos os seus pomares. No entanto, a seleção de árvores polinizadoras adequadas é uma tarefa desafiadora que requer experimentos de laboratório demorados. Para resolver essas questões, desenvolvemos um método rápido para identificar genótipos SI e determinar as compatibilidades e incompatibilidades polínicas de diferentes variedades de citros para facilitar a seleção precisa de árvores polinizadoras. Além disso, a viabilidade polínica e as taxas de germinação também podem ser determinadas pelo método in vitro descrito neste protocolo.
Existem alguns relatos sobre a determinação de genótipos de SI e auto-(in)compatibilidade e inter-(in)compatibilidade utilizando uma combinação de diferentes métodos em ameixa e damasco japoneses22,23. O desenvolvimento de primers S-específicos depende da identificação do genótipo S. Em citros, a análise do transcriptoma do estigma e pólen de 64 acessos de pummelo identificou nove S-RNases especificamente expressas nos estilos e uma variante da S-RNase. Outros 12 pares de primers específicos para S foram desenvolvidos posteriormente em citros por Liang et al.7 e Wei et al.19. No entanto, em relação à pera e maçã, menos genótipos de S foram identificados nos citros4. A identificação de genótipos S baseados em PCR é uma etapa crítica, pois fornece uma base para combinações compatíveis/incompatíveis. Há também algumas limitações para este protocolo. Os genótipos S de algumas variedades de citros não podem ser identificados por este método. Esse achado indica que uma maior expansão da biblioteca de genótipos S em citros é necessária. Além disso, os primers específicos do S não conseguem distinguir os genótipos S de cultivares com sequências S altamente semelhantes e, portanto, amplificam sequências S não específicas.
Em conjunto, devido ao seu custo-benefício e facilidade de uso, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade de pólen para diferentes variedades de citros. Este protocolo pode ser utilizado na seleção de polinizadores adequados e em programas de pesquisa de melhoramento. Pode ser aplicado a várias espécies da família Rutaceae (e.g., Citrus trifoliata e Fortunella japonica) para a seleção de árvores polinizadoras.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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