Summary
Здесь мы представляем общий метод определения эмбриональной жизнеспособности и общего количества эмбрионов, полученных (выводка) с использованием модельного организма C. elegans.
Abstract
Caenorhabditis elegans является отличным модельным организмом для изучения мейоза, оплодотворения и эмбрионального развития. C. elegans существуют как самооплодотворяющиеся гермафродиты, которые производят большие выводки потомства - когда присутствуют самцы, они могут производить еще более крупные выводки перекрестного потомства. Ошибки в мейозе, оплодотворении и эмбриогенезе могут быть быстро оценены как фенотипы бесплодия, снижения фертильности или эмбриональной летальности. В данной статье описан метод определения эмбриональной жизнеспособности и размера выводка у C. elegans. Мы демонстрируем, как настроить этот анализ, выбирая червя на отдельной пластине модифицированного Youngren's, только бакто-пептона (MYOB), устанавливаем соответствующие временные рамки для подсчета жизнеспособного потомства и нежизнеспособных эмбрионов и объясняем, как точно подсчитывать живые образцы червей. Этот метод может быть использован для определения жизнеспособности у самооплодотворяющихся гермафродитов, а также перекрестного опыления спаривающимися парами. Эти относительно простые эксперименты легко адаптируются для новых исследователей, таких как студенты бакалавриата и аспиранты-первокурсники.
Introduction
Половое размножение у эукариотических организмов требует производства функциональных гамет, которые сливаются, образуя эмбрион в процессе оплодотворения. Материнские и отцовские гаметы, яйцеклетки (яйцеклетки) и сперматозоиды создаются посредством специализированных процессов деления и дифференцировки клеток мейоза и гаметогенеза1. Мейоз начинается с одной диплоидной клетки и заканчивается образованием дочерних клеток, которые содержат половину количества хромосом исходной родительской клетки. От уменьшения плоидности до перетасовки генетического материала посредством независимого ассортимента и кроссоверной рекомбинации мейоз выполняет несколько важных функций1. Ошибки в мейозе могут привести к анеуплоидии, при которой в гамете слишком много или слишком мало хромосом. Случаи анеуплоидии оказывают огромное влияние на здоровье человека, поскольку хромосомный дисбаланс является основной причиной выкидышей и нарушений развития, таких как синдром Дауна и синдром Эдвардса2.
Оплодотворение - это процесс, посредством которого материнские и отцовские гаметы сливаются, образуя новый организм3. Распознаванию гамет-гамет способствуют белки на поверхности гаметы3. Ошибки с совместимостью гамет приводят к бесплодию, так как слияние сперматозоидов и яйцеклеток не может продолжаться. Слияние сперматозоида с яйцеклеткой вызывает множество событий, которые приводят к правильному формированию активного эмбриона, который может начать путь развития от одноклеточного эмбриона до полностью функционального многоклеточного организма посредством митотических делений4. На протяжении всего эмбриогенеза молекулярные события, регулирующие развитие, должны быть жестко отрегулированы и точно рассчитаны по времени, чтобы обеспечить надлежащий рост организма5. Правильная клеточная дифференциация во время раннего развития имеет решающее значение, поскольку организм переходит от плюрипотентного эмбриона к полноценному организму. Из-за сложности этих событий нарушения могут привести к дефектам развития, которые приводят к эмбриональной летальности.
Caenorhabditis elegans — отличный модельный организм для изучения мейоза, оплодотворения и эмбрионального развития. C. elegans — прозрачная нематода, имеющая два пола: самцов и гермафродитов. Преобладающим поломявляются гермафродиты C. elegans, способные к самооплодотворению6,7. Гонада гермафродита сначала производит сперматозоиды на четвертой личиночной стадии (L4), которые хранятся в сперматеках. При переходе L4 во взрослую жизнь зародышевая линия переключается на производство ооцитов, которые затем оплодотворяются с помощью сохраненной спермы. Самцы, которые возникают у гермафродитов со скоростью менее 0,2%, производят только сперму и могут спариваться с гермафродитами. При перекрестном оплодотворении мужские сперматозоиды вытесняют сперматозоиды-гермафродиты в оплодотворенииооцитов 8. Это позволяет относительно легко поддерживать гомозиготных мутантов с помощью самооплодотворяющихся запасов и генетических манипуляций с помощью генетических скрещиваний. Два пола позволяют проводить исследования, изучающие различия между мейозом в мужских и женских зародышевых линиях. Кроме того, из-за прозрачной природы C. elegans и его яиц процессы мейоза, гаметогенеза, оплодотворения и эмбриогенеза могут быть изучены на живых, интактных животных с использованием методов флуоресцентной визуализации.
При анализе новых мутаций в генах, которые могут играть роль в мейозе, оплодотворении и/или эмбриональном развитии у C. elegans, важнейшим первым шагом является определение эмбриональной жизнеспособности и размера выводка, поскольку ошибки в этих процессах часто приводят к сбою или сокращению производства жизнеспособного потомства. В этой статье описывается протокол оценки фертильности, эмбриональной жизнеспособности и размера выводка либо самооплодотворяющихся гермафродитов, либо скрещивания гермафродитов с самцами. Хотя этот классический анализ использовался во многих исследованиях C. elegans , мы предоставляем стандартизированный протокол для настройки и точного количественного определения. В этом протоколе отдельные черви или пары самцов / гермафродитов изолируются, чтобы обеспечить спаривание и производство потомства. Производство потомства и жизнеспособность наблюдаются в течение ряда дней, чтобы определить количество жизнеспособного потомства и нежизнеспособных эмбрионов. По завершении эксперимента анализируются отдельные выводки, чтобы рассчитать процент эмбриональной жизнеспособности и общий размер выводка.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе.
1. Подготовка экспериментальных планшетов
- Приготовьте чашки Петри диаметром 35 мм на модифицированной среде Youngren's, только на основе бактопептона (MYOB). Чтобы сделать планшеты MYOB, добавьте 20 г агара Bacto, 2 г NaCl, 0,55 г Trizma-HCl, 0,24 г Trizma-OH, 3,1 г пептона Bacto и 1,6 мл холестерина к 1 л ddH2O и автоклав в течение 40 мин при 121 ° C. Дайте остыть до 55 °C и стерильным способом налейте 4 мл расплавленной среды в каждую 35-миллиметровую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Литр MYOB составляет ~ 250 пластин, которые можно хранить при температуре 4 ° C до 6 месяцев. Мы рекомендуем не менее 10 особей на репликацию с тремя наборами репликации для каждого штамма. - Используя стерильную технику, засейте пластины небольшим пятном (примерно 50 мкл) бактерий OP50 в середине пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие газоны особенно важны для оценки перекрестного оплодотворения, так как меньшее пятно приводит к увеличению встреч между самцами и гермафродитами, тем самым увеличивая вероятность спаривания.
2. Анализы эмбриональной жизнеспособности (гермафродитное самооплодотворение)
- День 1
- Пометьте обратную сторону каждой тарелки. Обязательно следите за каждой тарелкой и соответствующими червями на протяжении всего эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная техника маркировки - День 1: червь 1, День 1: червь 2, ... и так далее. - Перенесите отдельного гермафродита стадии L4 на каждую пластину. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку. Дайте червям развиться во взрослых особей и откладывайте самостоятельное потомство в течение 24 часов при стандартной температуре культивирования 20 °C. Забейте эти тарелки на 3-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура экспериментов может быть изменена в случае температурно-чувствительных мутаций. Для температурно-чувствительных мутаций анализы эмбриональной жизнеспособности следует проводить как при разрешающей (15-16 ° C), так и при неразрешающей температуре (24-26 ° C).
- Пометьте обратную сторону каждой тарелки. Обязательно следите за каждой тарелкой и соответствующими червями на протяжении всего эксперимента.
- День 2
- Пометьте набор новых тарелок - День 2: червь 1, День 2: червь 2, ... и так далее.
- Перенесите на 1 день отдельных червей на новые пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти черви должны были достичь взрослого возраста, а черви дикого типа уже должны были начать откладывать эмбрионы. - Дайте червям отложить эмбрионы в течение 24 часов при температуре 20 °C или другой подходящей температуре. Забейте эти тарелки на 4-й день.
- День 3
- Пометьте набор новых табличек. День 3: червь 1, День 3: червь 2, ... и так далее.
- Перенесите на 2 день отдельных червей на новые пластины. Дайте им отложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 °C или другой подходящей температуре. Забейте эти тарелки на 5-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае более низких температур время вылупления будет увеличено. Отрегулируйте соответствующим образом. - Нарисуйте узор сетки на крышке диаметром 35 мм мелким маркером. Поместите решетчатую крышку под испытательную пластину для подсчета, чтобы отслеживать ранее подсчитанных червей (рис. 1A-B).
- Используя дифференциальный счетчик клеток, оцените планшеты 1-го дня на наличие или отсутствие потомства. Подсчитайте живых личинок и невылупившиеся зародыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент прошло достаточно времени, чтобы вылупились жизнеспособные эмбрионы. Любые невылупившиеся эмбрионы считаются мертвыми. - В пределах отдельного квадрата подсчитайте невылупившиеся эмбрионы и живых личинок, которые полностью находятся в квадрате (рис. 1C-F).
- Для червей, которые находятся на квадратных границах, подсчитайте на основе расположения головы червя. Подсчитайте червей с головами, касающимися верхнего и левого краев квадрата (не считайте тех, кто касается нижнего или правого краев; Рисунок 1D). Не подсчитывайте неоплодотворенные ооциты для этого анализа (рис. 1F).
- Используя дифференциальный счетчик клеток, оцените планшеты 1-го дня на наличие или отсутствие потомства. Подсчитайте живых личинок и невылупившиеся зародыши.
- Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь.
- День 4
- Оцените таблички 2-го дня, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, как описано в шаге 2.3.3.1. Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь.
- День 5
- Оцените 3-й день, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, как описано в шаге 2.3.3.1. Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь. Проанализируйте полученные данные с помощью метода, описанного в анализе данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые генетические мутанты могут иметь либо отсроченный, либо расширенный репродуктивный цикл. Контролируйте отдельные штаммы на предмет продолжения кладки эмбрионов после 3-го дня планшетов. Если производство эмбрионов не прекратилось к 4 дню, продолжайте пересаживать взрослых особей на новые пластины.
- Оцените 3-й день, подсчитав живых личинок и невылупившиеся эмбрионы, как описано в шаге 2.3.3.1. Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь. Проанализируйте полученные данные с помощью метода, описанного в анализе данных.
3. Анализы эмбриональной жизнеспособности (перекрестное оплодотворение самца/гермафродита)
- День 1
- Пометьте обратную сторону каждой тарелки. Обязательно следите за каждой тарелкой и соответствующими червями на протяжении всего эксперимента.
- Перенесите отдельного червя-гермафродита L4 на каждую пластину. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Феминизированные штаммы, такие как мутанты с потерей функции тумана-2 , которые не производят сперму, могут быть использованы вместо гермафродитов. - Перенесите одного червя-самца L4 на каждую меченую пластину, содержащую гермафродита L4. Убедитесь, что эмбрионы или другие черви не переносятся на тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такие штаммы, как самцы варианта plg-1 , могут быть использованы для определения того, произошло ли спаривание, поскольку эти самцы откладывают копулятивную пробку на вульве гермафродита после спаривания. - Дайте червям спариться и отложить потомство в течение 24 часов при 20 ° C или другой подходящей температуре. Оцените эти планшеты на наличие живых личинок по сравнению с невылупившимися эмбрионами на 3-й день.
- День 2
- Пометьте набор новыми пластинами и перенесите червей, как на 2-й день выше. В этом случае обязательно перенесите и гермафродита, и самца на новые пластины. Следите за тем, чтобы гермафродит достиг совершеннолетия.
- Дайте гермафродитам отложить потомство в течение 24 часов при 20 ° C или другой подходящей температуре. Оцените эти планшеты на наличие живых личинок по сравнению с невылупившимися эмбрионами на 4-й день.
- День 3
- Пометьте набор новыми пластинками и перенесите червей, как в 3-й день выше. Обязательно перенесите гермафродита и самца на новые тарелки.
- Дайте потомству заложить потомство в течение 24 часов при температуре 20 °C или другой подходящей температуре. Оцените эти планшеты на живые и невылупившиеся эмбрионы на 5-й день.
- Используя дифференциальный счетчик клеток, подсчитайте живых личинок и невылупившихся эмбрионов из планшетов 1-го дня, как описано в шаге 2.3.3.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте тарелки, так как они необходимы на 4 день. - Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь.
- День 4
- Подсчитайте живое потомство и невылупившиеся эмбрионы из планшетов 2-го дня, как описано в шаге 2.3.3.1. Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь.
- Проверьте 1 день тарелки для мужчин. Если спаривание произошло, ожидаемое генетическое соотношение гермафродитов и самцов должно быть 50:50. Если на пластинах 1-го дня нет самцов, спаривания между самцом и гермафродитом не происходило. Отбросьте эту брачную пару и запишите это наблюдение в лабораторную тетрадь.
- День 5
- Подсчитайте живых личинок и невылупившихся эмбрионов с планшетов 3-го дня, как описано в шаге 2.3.3.1. Запишите количество живых личинок и невылупившихся эмбрионов в лабораторную тетрадь. Проанализируйте полученные данные, используя методы, описанные в анализе данных.
4. Анализ данных
- Рассчитайте процент эмбриональной жизнеспособности данной биологической реплики штамма, используя уравнение (1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество живого потомства и невылупившихся эмбрионов получено путем суммирования ежедневного подсчета в течение экспериментального периода.
(1) - Рассчитайте размер расплода на одного червя данного штамма, суммировав количество потомства (невылупившихся эмбрионов и личинок), произведенных родительским гермафродитом. Рассчитайте средний размер выводка с помощью уравнения (2).
(2) - Сообщайте о проценте эмбриональной жизнеспособности и среднем размере расплода со средним и стандартным отклонением между биологическими репликами. Выполните t-критерий Стьюдента, сравнив контрольные и экспериментальные данные.
(1)
(2)Representative Results
Мы провели анализы эмбриональной жизнеспособности и размеров выводка на N2 (дикий тип) и на двух штаммах, содержащих мутации в генах, участвующих в мейозе, him-5 (e1490) и spo-11 (ok79). Поскольку и him-5, и spo-11 играют роль в формировании мейотического кроссовера, мутации в этих двух генах приводят к образованию анеуплоидных гамет. Этот анализ эмбриональной жизнеспособности для N2 дал процент жизнеспособности 98,9%, в то время как him-5 (e1490) и spo-11 (ok79) показали снижение жизнеспособности потомства с процентом 74,9% и 0,8% соответственно (рис. 2A; p < 0,0005). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными результатами 7,9. Средний размер выводка N2, him-5 (e1490) и spo-11 (ok79) был определен как 217, 105 и 219 соответственно (рис. 2B). Как и в предыдущих публикациях, him-5(e1490) имеет значительно уменьшенный размер выводка по сравнению с диким типом, тогда как spo-11(ok79) неимеет 7,9.
Рисунок 1: Демонстрация настройки счета и морфологии эмбриона на планшетах . (A) Изображение крышки с заштрихованным сетчатым рисунком, нарисованным с помощью тонкого шарпи. (B) Пластина MYOB диаметром 35 мм с узорчатой крышкой внизу для подсчета. (C) Изображение, демонстрирующее поле зрения с малым увеличением (10x), на котором видно несколько прямоугольников сетки. Белые наконечники стрел указывают на несколько личинок в этом поле зрения. Подсчет следует проводить при большем увеличении (всего один квадрат в поле), чтобы наблюдать как за личинками, так и за эмбрионами. Масштабная линейка = 1 000 мкм. (D) Карикатура крышки с рисунком сетки, помещенной под пластиной диаметром 35 мм. Врезка обозначает надлежащую технику определения того, какие личинки подсчитываются в данном квадрате. Считайте сверху вниз, слева направо. Подсчитайте всех червей, которые полностью находятся в квадрате. Червей, соприкасающихся с границей, следует подсчитывать по положению головы червя, а не хвоста. Подсчитайте червей, обращенных к текущей сетке или сеткам, которые были подсчитаны ранее (т. е. верхний и левый края). Не считайте червей с головами, касающимися нижнего или правого края. На врезке будут учитываться синие черви, а красные - нет. (E) Репрезентативное изображение здоровых вылупившихся личинок N2 L1 (белый наконечник стрелы). (F) Репрезентативное изображение неоплодотворенного ооцита (черный наконечник стрелы) и невылупившегося эмбриона (красный наконечник стрелки). Неоплодотворенные ооциты не должны учитываться для этого анализа. Масштабные линейки (E, F) = (100 мкм). Примечание: Изображения в C, E и F были сделаны с помощью микроскопа Zeiss AxioZoom с прикрепленной камерой с целью демонстрации внешнего вида личинок, эмбрионов и ооцитов на червячных пластинах. Для анализов эмбриональной жизнеспособности подсчет проводится во время наблюдения за планшетами с использованием стереомикроскопа (без камеры). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные графики, показывающие результаты анализов эмбриональной жизнеспособности и размеров расплода. (A) Процент эмбриональной жизнеспособности N2, him-5 (e1490) и spo-11 (ok79) при 20 ° C. (B) Размеры выводка N2, him-5 (e1490) и spo-11 (ok79) при 20 ° C . Потомство не менее 28 гермафродитов было оценено для каждого штамма. Общее количество невылупившихся эмбрионов плюс личинок составило N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2,945 и spo-11 (ok79) = 7,230. Полосы погрешности указывают стандартное отклонение по трем отдельным репликам. Статистика рассчитана с использованием t-критерия Стьюдента, н.с. = не значимый, *p < 0,0005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Размножение видов, размножающихся половым путем, требует образования гаплоидных гамет (т.е. яйцеклеток и сперматозоидов) посредством мейоза, которые затем объединяются при оплодотворении, восстанавливая число диплоидных хромосом и инициируя эмбриональное развитие. Ошибки в любом из этих процессов могут привести к бесплодию, эмбриональной летальности и/или врожденным дефектам. C. elegans является мощной модельной системой для изучения полового размножения. Эффекты генных мутаций или нокдауна экспрессии генов (например, РНК-интерференция) могут быть оценены относительно быстро и легко с помощью анализов эмбриональной жизнеспособности и размеров выводка, описанных выше. Мы использовали эти методы для первоначальной характеристики генов, участвующих в мейотической сегрегации хромосом и оплодотворении/активации яйцеклеток10,11,12. Наблюдаемое снижение эмбриональной жизнеспособности или размера расплода указывает на нарушение мейоза, гаметогенеза, оплодотворения или эмбриогенеза.
Поскольку эмбриональная жизнеспособность и размер расплода оцениваются относительно легко с помощью подсчета потомства и простого математического расчета, это оптимальные вводные эксперименты для новичков в исследованиях как в лаборатории, так и в классе. Легкость содержания C. elegans и экономические преимущества делают их особенно подходящими для экспериментальных уроков биологии. Студенты получают ценный исследовательский опыт в разведении C. elegans , учатся использовать препарирующие микроскопы и могут задавать биологические вопросы в системе развития, на которые можно ответить за относительно короткий промежуток времени (примерно 5 дней с протоколом, описанным в этой статье).
Сроки подсчета потомства очень важны для анализов эмбриональной жизнеспособности. При 20 ° C эмбриогенез занимает примерно 16 часов, а репродуктивно зрелые взрослые особи начинают откладывать яйца примерно через 60 часов после вылупления в виде личинок L1. Поскольку жизненный цикл быстрый, важно подсчитывать потомство в пределах соответствующего окна, оставляя достаточно времени для вылупления эмбрионов, но до того, как само потомство начнет откладывать яйца. Также важно отметить, что периоды роста варьируются в зависимости от температуры. Рост примерно в 2,1 раза быстрее при 24-25 ° C, чем 15-16 ° C, и примерно в 1,3 раза быстрее при 20 ° C, чем 15-16 ° C13. В этом протоколе мы рекомендуем, чтобы подсчет происходил через 48 часов после того, как взрослые были помещены на свежую тарелку. Этот срок гарантирует, что все эмбрионы с развитием дикого типа имеют достаточно времени для вылупления (>16 ч), но не стареют до точки репродуктивной способности. Анализы, проводимые при температурах ниже 20 ° C, возможно, потребуется продлить (перенос животных на 4 дня) для вылупления эмбрионов и для вылупленного потомства, чтобы достичь личиночной стадии, которую легче наблюдать среди бактерий на планшетах MYOB (стадии L3-L4).
Ограничением анализов эмбриональной жизнеспособности и определения размеров выводка является то, что специфический процесс развития, который нарушается, не так очевиден. Тем не менее, эти первоначальные анализы могут сопровождаться цитологическими методами, чтобы определить, какой процесс затронут. Например, вскрытие взрослых червей для высвобождения гонады с последующим окрашиванием 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и тщательный анализ морфологии ДНК внутри зародышевой линии могут выявить, нарушены ли мейотические процессы. Кроме того, окрашивание эмбрионов DAPI может выявить, на какой стадии останавливается эмбриогенез.
В заключение мы описали протокол анализа количества произведенных эмбрионов (выводка) и процента эмбрионов, жизнеспособных для различных мутантов C. elegans. Этот анализ может быть использован как для самооплодотворяющихся гермафродитов, так и для скрещивания самцов и гермафродитов. Благодаря короткому жизненному циклу C. elegans этот протокол может быть завершен менее чем за 1 неделю. Анализы эмбриональной жизнеспособности и размеры расплода могут быть использованы в качестве первого анализа генов, участвующих в мейозе, оплодотворении или эмбриональном развитии, и являются подходящими протоколами как для более продвинутых исследователей, так и для новичков в исследованиях (студентов и аспирантов первого курса).
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Работа в лаборатории Харамильо-Ламберта поддерживается Национальным институтом здравоохранения NIGMS R35GM142524. Все штаммы C. elegans были предоставлены Генетическим центром Caenorhabditis , который финансируется Национальным институтом здравоохранения, P40 OD010440. Рисунок 1D был создан с помощью Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
- Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J.
- O'Connor, C.
- Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A.
- Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
- Robertson, S., Lin, R.
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Chu, D. S., Shakes, D. C.
- Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
- Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
- Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
- Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
- Stiernagle, T.
