Summary
在这里，我们提出了一种通用方法，用于确定使用模式生物秀 丽隐杆线虫产生的胚胎活力和产生的胚胎总数（育雏）。
Abstract
秀丽隐杆线虫 是研究减数分裂、受精和胚胎发育的优秀模式生物。 秀丽隐杆线虫 作为自受精雌雄同体存在，产生大量的后代——当雄性存在时，它们可以产生更大的杂交后代。减数分裂、受精和胚胎发生的错误可以快速评估为不育、生育能力降低或胚胎致死的表型。本文介绍了一种确定 秀丽隐杆线虫胚胎活力和育雏大小的方法。我们演示了如何通过在单个改良的Youngren's，仅杆菌蛋白胨（MYOB）平板上挑选蠕虫来设置该测定，建立适当的时间范围来计数活的后代和不可存活的胚胎，并解释如何准确计数活蠕虫标本。该技术可用于确定自受精雌雄同体的生存能力以及交配对的交叉受精。这些相对简单的实验很容易被新研究人员采用，例如本科生和一年级研究生。
Introduction
真核生物的有性生殖需要产生功能性配子，这些配子通过受精过程合并形成胚胎。母系和父系配子、卵子（卵子）和精子是通过减数分裂和配子发生的特殊细胞分裂和分化过程产生的1.减数分裂从单个二倍体细胞开始，以子细胞的形成结束，子细胞的染色体数量是原始亲本细胞的一半。从倍性的减少到通过独立分类和交叉重组 对 遗传物质进行洗牌，减数分裂具有多种重要功能1。减数分裂中的错误可导致非整倍性，其中配子内的染色体过多或过少。非整倍体的发病率对人类健康有巨大影响，因为染色体失衡是流产和发育障碍（如唐氏综合症和爱德华兹综合症）的主要原因2。
受精是母系和父系配子融合产生新生物体的过程3.配子-配子识别由配子表面的蛋白质促进3.配子相容性错误导致不育，因为精子和卵子融合无法进行。精子与卵母细胞的融合触发了许多事件，导致活性胚胎的适当形成，该胚胎可以通过有丝分裂 开始 从单细胞胚胎到功能齐全的多细胞生物的发育之旅4。在整个胚胎发生过程中，调节发育的分子事件必须受到严格调节和精确计时，以使生物体正常生长5。在早期发育过程中适当的细胞分化至关重要，因为生物体从多能胚胎过渡到成熟的生物体。由于这些事件的复杂性，中断可能导致发育缺陷，从而导致胚胎致死。
秀丽隐杆线虫 是研究减数分裂、受精和胚胎发育的优秀模式生物。 秀丽隐杆线 虫是一种透明的线虫，有两种性别，雄性和雌雄同体。 秀丽隐杆线虫 雌雄同体能够自我受精，是主要性别6，7。雌雄同体性腺首先在第四幼虫（L4）阶段产生精子，这些精子储存在精子中。在L4到成年期的过渡期，生殖系切换到产生卵母细胞，然后通过储存的精子 受 精。雄性以低于0.2%的速度出现在雌雄同体中，只产生精子并且可以与雌雄同体交配。在交叉受精后，雄性精子在卵母细胞受精中胜过雌雄同体精子8。这允许通过自育种来相对容易地维持纯合突变体，并通过遗传杂交进行遗传操作。这两种性别允许研究探索雄性和雌性生殖系减数分裂之间的差异。此外，由于 秀丽隐杆线虫 及其卵的透明性质， 可以使用荧光成像技术在活的、完整的动物中研究减数分裂、配子发生、受精和胚胎发生的过程。
在分析可能在 秀丽隐杆线虫减数分裂、受精和/或胚胎发育中起作用的基因新突变时，关键的第一步是确定胚胎活力和育雏大小，因为这些过程中的错误通常会导致存活后代的产生失败或减少。本文描述了一种评估自受精雌雄同体或雌雄同体杂交的生育能力、胚胎活力和育雏大小的方案。虽然这种经典的检测方法已用于许多 秀丽隐杆线虫 研究，但我们提供了用于设置和准确定量的标准化方案。在该协议中，分离单个蠕虫或雄性/雌雄同体对以允许交配和后代产生。在一系列天内观察后代的产生和活力，以确定可存活的后代和不可存活胚胎的数量。在实验结束时，分析单个育雏以计算胚胎活力百分比和总育雏大小。
Protocol
注意：有关此协议中使用的所有材料的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 准备实验板
- 用改良的杨仁，仅杆菌蛋白胨（MYOB）培养基准备直径为35毫米的培养皿。要制作MYOB板，将20gBacto琼脂，2gNaCl，0.55gTrizma-HCl，0.24gTrizma-OH，3.1g杆菌蛋白胨和1.6mL胆固醇加入1L ddH2O中，并在121°C高压灭菌40分钟。 使其冷却至55°C并使用无菌技术，将4mL熔融介质倒入每个35mm培养皿中。
注意：一升MYOB制作~250板，可在4°C下储存长达6个月。我们建议每个重复至少10个个体，每个菌株有三个重复集。 - 使用无菌技术，在平板中间接种一个小斑点（约 50 μL）的 OP50 细菌。
注意：小草坪对于评估交叉受精尤为重要，因为较小的斑点会导致雄性和雌雄同体之间的相遇增加，从而增加交配的机会。
2. 胚胎活力测定（雌雄同体自受精）
- 第一天
- 标记每个盘子的背面。确保在整个实验过程中跟踪每个板及其各自的蠕虫。
注意：首选标记技术 - 第 1 天：蠕虫 1，第 1 天：蠕虫 2，...等。 - 将单个L4阶段雌雄同体转移到每个板上。确保没有胚胎或其他蠕虫转移到平板上。让蠕虫发育成成虫并在20°C的标准培养温度下产下自生24小时。 在第 3 天对这些盘子进行评分。
注意：在温度敏感突变的情况下，可以改变实验的温度。对于温度敏感突变，胚胎活力测定应在允许温度（15-16°C）和非允许温度（24-26°C）下进行。
- 标记每个盘子的背面。确保在整个实验过程中跟踪每个板及其各自的蠕虫。
- 第二天
- 标记一组新板 - 第 2 天：蠕虫 1，第 2 天：蠕虫 2，...等。
- 将第 1 天的单个蠕虫转移到新板上。
注意：这些蠕虫应该已经成年，野生型蠕虫应该已经开始产卵。 - 让蠕虫在20°C或其他适当的温度下产下胚胎24小时。在第 4 天对这些盘子进行评分。
- 第三天
- 标记一组新板。第 3 天：蠕虫 1，第 3 天：蠕虫 2，...等。
- 将第 2 天的单个蠕虫转移到新板上。让它们在20°C或其他适当的温度下产下后代24小时。在第 5 天对这些盘子进行评分。
注意：在温度较低的情况下，孵化时间将增加。相应地调整。 - 使用精细记号笔在 35 毫米盖子上绘制网格图案。将网格盖放在测试板下方进行计数，以跟踪先前计数的蠕虫（图1A-B）。
- 使用差异细胞计数器，对第 1 天平板进行评分，以确定是否存在后代。计算活的幼虫和未孵化的胚胎。
注意：在这一点上，已经过去了足够的时间，以至于任何可行的胚胎都应该已经孵化。任何未孵化的胚胎都被推定死亡。 - 在单个正方形内，计算完全在正方形内的未孵化胚胎和活幼虫（图1C-F）。
- 对于位于方形边框上的蠕虫，根据蠕虫头的位置进行计数。计算头部接触正方形顶部和左侧边缘的蠕虫（不要计算接触底部或右侧边缘的蠕虫; 图 1D）。不要计算该测定的未受精卵母细胞（图1F）。
- 使用差异细胞计数器，对第 1 天平板进行评分，以确定是否存在后代。计算活的幼虫和未孵化的胚胎。
- 在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。
- 第四天
- 通过计数活幼虫和未孵化的胚胎对第 2 天平板进行评分，如步骤 2.3.3.1 中所述。在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。
- 第五天
- 通过计数活幼虫和未孵化的胚胎对第 3 天平板进行评分，如步骤 2.3.3.1 中所述。在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。分析使用数据分析中描述的方法获得的数据。
注意：一些遗传突变体可能有延迟或延长的生殖周期。监测单个菌株是否在第3天平板之后继续产下胚胎。如果胚胎生产在第4天没有停止，继续将成虫转移到新的平板上。
- 通过计数活幼虫和未孵化的胚胎对第 3 天平板进行评分，如步骤 2.3.3.1 中所述。在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。分析使用数据分析中描述的方法获得的数据。
3. 胚胎活力测定（雄性/雌雄同体交叉受精）
- 第一天
- 标记每个盘子的背面。确保在整个实验过程中跟踪每个板及其各自的蠕虫。
- 将单个L4雌雄同体蠕虫转移到每个板上。确保没有胚胎或其他蠕虫转移到平板上。
注意：女性化菌株，例如不产生精子的 fog-2 功能丧失突变体，可用于代替雌雄同体。 - 将单个L4雄虫转移到每个含有L4雌雄同体的标记板上。确保没有胚胎或其他蠕虫转移到平板上。
注意：诸如 plg-1 变体雄性之类的菌株可用于确定是否发生了交配，因为这些雄性在交配后在雌雄同体外阴上沉积了一个交配塞。 - 让蠕虫交配并在20°C或其他适当的温度下产下后代24小时。在第 3 天对这些板进行活幼虫与未孵化胚胎的评分。
- 第二天
- 标记一组新板并转移蠕虫，如上述第 2 天所示。在这种情况下，请确保将雌雄同体和雄性转移到新板上。确保雌雄同体已成年。
- 允许雌雄同体在20°C或其他适当的温度下产下后代24小时。在第 4 天对这些板进行活幼虫与未孵化胚胎的评分。
- 第三天
- 标记一组新板并转移蠕虫，如上述第 3 天所示。确保将雌雄同体和雄性转移到新盘子上。
- 允许在20°C或其他适当的温度下产下后代24小时。在第5天对这些板进行活胚胎与未孵化胚胎的评分。
- 使用差异细胞计数器，计数第1天平板上的活幼虫和未孵化的胚胎，如步骤2.3.3.1中所述。
注意：不要丢弃盘子，因为它们是第 4 天所必需的。 - 在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。
- 第四天
- 计数第2天平板上的活后代和未孵化的胚胎，如步骤2.3.3.1中所述。在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。
- 检查男性的第 1 天盘子。如果已经交配，雌雄同体与雄性的预期遗传比例应为50：50。如果第1天的板不包含任何雄性，则雄性和雌雄同体之间不会发生交配。丢弃这对交配对并将此观察结果记录在实验室笔记本中。
- 第五天
- 如步骤2.3.3.1中所述，计数第3天平板上的活幼虫和未孵化的胚胎。在实验室笔记本中记录活幼虫和未孵化胚胎的数量。分析使用数据分析中描述的方法获得的数据。
4. 数据分析
- 使用公式（1）计算菌株的给定生物重复的胚胎活力百分比。
注意：活后代和未孵化胚胎的数量是通过对整个实验期间的每日计数相加获得的。
（1） - 通过对亲本雌雄同体产生的后代（未孵化的胚胎和幼虫）的数量求和来计算给定菌株的每条蠕虫的育雏大小。使用公式（2）计算平均育雏大小。
（二） - 报告胚胎活力百分比和平均育雏大小以及生物重复之间的平均和标准偏差。执行学生t检验，比较对照数据和实验数据。
（1）
（二）Representative Results
我们对N2（野生型）和两种携带减数分裂相关基因突变的菌株 him-5（e1490 ）和 spo-11（ok79）进行了胚胎活力和育雏大小测定。由于 him-5 和 spo-11 都在减数分裂交叉形成中发挥作用，这两个基因的突变导致非整倍体配子的形成。N2的胚胎活力测定产生了98.9%的活力百分比，而 him-5（e1490 ）和 spo-11（ok79） 都显示出后代活力降低，百分比分别为74.9%和0.8%（图2A; p < 0.0005）。这些结果与之前发表的结果7，9一致。N2、 him-5（e1490 ）和 spo-11（ok79） 的平均育雏大小分别为217、105和219（图2B）。与以前的出版物一致，与野生型相比， him-5（e1490） 的育雏大小显着减小，而 spo-11（ok79） 则没有7，9。
图1：平板上的计数设置和胚胎形态的演示 。 （A） 使用精细锐器绘制的带有交叉阴影网格图案的盖子图像。（B） 一个 35 毫米 MYOB 板，下面有图案盖子用于计数。（C） 显示低放大倍率 （10x） 视野的图像，显示网格的多个框。白色箭头指出了这个视野内的几只幼虫。计数应在更高的放大倍数下进行（田野中只有一个正方形），以观察幼虫和胚胎。比例尺 = 1，000 μm。 （D） 盖子的卡通，网格图案放置在 35 毫米板下方。插图表示确定在给定正方形中计数哪些幼虫的正确技术。从上到下，从左到右计数。计算完全在正方形内的任何蠕虫。接触边界的蠕虫应根据蠕虫头部的位置而不是尾部的位置进行计数。对当前网格或先前已计数的网格（即顶部和左侧边缘）的蠕虫进行计数。不要计算头部接触底部或右侧边缘的蠕虫。从插图中，蓝色蠕虫将被计数，而红色蠕虫不会被计算在内。 （E）健康N2 L1孵化幼虫（白色箭头）的代表图像。（F）未受精卵母细胞（黑色箭头）和未孵化胚胎（红色箭头）的代表性图像。未受精的卵母细胞不应计入该测定。比例尺 （E，F） = （100 μm）。注意： C， E和 F 中的图像是用蔡司AxioZoom显微镜拍摄的，并附有相机，目的是展示蠕虫板上幼虫，胚胎和卵母细胞的外观。对于胚胎活力测定，在使用体视显微镜（无相机）观察平板的同时进行计数。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：描述胚胎活力测定结果和育雏大小的代表性图表。 （A）20°C时N2、him-5（e1490）和spo-11（ok79）的胚胎活力百分比。 （B）20°C下N2，him-5（e1490）和spo-11（ok79） 的育雏大小。 每个菌株至少对28个雌雄同体的后代进行评分。未孵化胚胎和幼虫的总数为N2 = 6302，him-5（e1490）= 2，945，spo-11（ok79）= 7，230。误差线表示三个单独的重复的标准偏差。使用学生 t 检验计算的统计量，n.s. = 不显著，*p < 0.0005。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
有性繁殖物种的繁殖需要通过减数分裂形成单倍体配子（即卵子和精子），然后在受精时统一，恢复二倍体染色体数并启动胚胎发育。任何这些过程中的错误都可能导致不孕症、胚胎致死率和/或出生缺陷。秀丽隐杆线虫是研究有性生殖的强大模型系统。使用上述胚胎活力和育雏大小测定可以相对快速和容易地评估基因突变或基因表达敲低（例如，RNA干扰）的影响。我们已经使用这些方法对参与减数分裂染色体分离和受精/卵子活化的基因进行了初步表征10，11，12。观察到的胚胎活力或育雏大小的降低表明减数分裂、配子发生、受精或胚胎发生受到破坏。
由于通过计算后代和简单的数学计算相对容易地评估胚胎活力和育雏大小，因此这些是实验室或课堂上研究新手的最佳入门实验。 秀丽隐杆线虫 饲养的便利性和经济优势使它们特别适合实验生物学课程。学生通过秀 丽隐杆线虫 饲养获得宝贵的研究经验，学习使用解剖显微镜，并且可以在发育系统中提出生物学问题，这些问题可以在相对较短的时间内回答（本文描述的方案大约5天）。
后代计数的时间对于胚胎活力测定非常重要。在20°C下，胚胎发生大约需要16小时，生殖成熟的成虫在孵化为L1幼虫后约60小时开始产卵。由于生命周期很快，重要的是在适当的窗口内计算后代，让胚胎有足够的时间孵化，但在后代自己开始产卵之前。同样重要的是要注意，生长期因温度而异。24-25 °C 下的生长速度比 15-16 °C 快约 2.1 倍，20 °C 下的生长速度比 15-16 °C 快约 1.3 倍13。在该方案中，我们建议在将成虫放在新鲜盘子上48小时后进行计数。这个时间范围确保所有具有野生型发育的胚胎都有足够的时间孵化（>16小时），但不会衰老到繁殖能力的程度。在低于20°C的温度下进行的测定可能需要延长（转移动物4天），以使胚胎孵化和孵化的后代达到在MYOB板上的细菌中更容易观察到的幼虫阶段（L3-L4阶段）。
胚胎活力测定和育雏大小的局限性在于，受到干扰的特定发育过程并不明显。然而，这些初始测定可以用细胞学技术跟进，以确定哪个过程受到影响。例如，解剖成虫以释放性腺，然后进行4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并仔细分析种系内的DNA形态，可以揭示减数分裂过程是否被破坏。此外，胚胎的DAPI染色可以揭示胚胎发生停滞的哪个阶段。
总之，我们已经描述了一种方案，用于测定产生的胚胎数量（育雏）和对各种 秀丽隐杆线虫 突变体可行的胚胎百分比。该测定可用于自受精雌雄同体和雄性/雌雄同体杂交。由于 秀丽隐杆线虫 的生命周期较短，该协议可以在不到1周的时间内完成。胚胎活力测定和育雏大小可用作参与减数分裂、受精或胚胎发育的基因的首次分析，并且是更高级研究人员和研究新手（本科生和一年级研究生）的合适方案。
Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
Jaramillo-Lambert实验室的工作得到了美国国立卫生研究院NIGMS R35GM142524的支持。所有 秀丽隐杆线虫 菌株均由 Caenorhabditis 遗传学中心提供，该中心由美国国立卫生研究院资助，P40 OD010440。 图 1D 是使用 Biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
| Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
| Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
| Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
| Strains | |||
| C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
| spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
| Equipment/software | |||
| Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
| MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
| platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
| worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |
References
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