Mesure de la viabilité embryonnaire et de la taille du couvain chez Caenorhabditis elegans

Summary

Nous présentons ici une méthode générale pour déterminer la viabilité embryonnaire et le nombre total d’embryons produits (couvée) à l’aide de l’organisme modèle C. elegans.

Abstract

Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour l’étude de la méiose, de la fécondation et du développement embryonnaire. C. elegans existe en tant qu’hermaphrodite autofécondante, qui produit de grandes couvées de descendance - lorsque les mâles sont présents, ils peuvent produire des couvées encore plus grandes de descendance croisée. Les erreurs de méiose, de fécondation et d’embryogenèse peuvent être rapidement évaluées comme des phénotypes de stérilité, de fertilité réduite ou de létalité embryonnaire. Cet article décrit une méthode pour déterminer la viabilité embryonnaire et la taille du couvain chez C. elegans. Nous montrons comment mettre en place ce test en choisissant un ver sur une plaque individuelle de Modified Youngren, Only Bacto-peptone (MYOB), établissons le délai approprié pour compter les descendants viables et les embryons non viables, et expliquons comment compter avec précision les spécimens de vers vivants. Cette technique peut être utilisée pour déterminer la viabilité des hermaphrodites autofécondants ainsi que la fertilisation croisée par des couples d’accouplement. Ces expériences relativement simples sont facilement adoptables pour les nouveaux chercheurs, tels que les étudiants de premier cycle et les étudiants de première année des cycles supérieurs.

Introduction

La reproduction sexuée dans les organismes eucaryotes nécessite la production de gamètes fonctionnels qui fusionnent pour former un embryon par le processus de fécondation. Les gamètes maternels et paternels, les ovules (ovules) et les spermatozoïdes sont créés par les processus spécialisés de division cellulaire et de différenciation de la méiose et de la gamétogenèse¹. La méiose commence avec une seule cellule diploïde et se termine par la formation de cellules filles qui contiennent la moitié du nombre de chromosomes de la cellule parentale d’origine. De la réduction de la ploïdie au brassage du matériel génétique en passant par l’assortiment indépendant et la recombinaison croisée, la méiose remplit de multiples fonctions importantes¹. Les erreurs dans la méiose peuvent entraîner une aneuploïdie, dans laquelle il y a trop ou trop peu de chromosomes dans un gamète. L’incidence de l’aneuploïdie a des impacts énormes sur la santé humaine, car les déséquilibres chromosomiques sont une cause majeure de fausses couches et de troubles du développement tels que le syndrome de Down et le syndrome d’Edwards².

La fécondation est le processus par lequel les gamètes maternel et paternel fusionnent pour générer un nouvel organisme³. La reconnaissance des gamètes-gamètes est facilitée par des protéines présentes à la surface des gamètes³. Les erreurs de compatibilité des gamètes entraînent l’infertilité car la fusion des spermatozoïdes et des ovules est incapable de se poursuivre. La fusion d’un spermatozoïde avec un ovocyte déclenche une foule d’événements qui conduisent à la formation appropriée d’un embryon actif qui peut commencer le voyage de développement d’un embryon unicellulaire à un organisme multicellulaire pleinement fonctionnel via des divisions mitotiques⁴. Tout au long de l’embryogenèse, les événements moléculaires qui régulent le développement doivent être étroitement régulés et programmés avec précision pour permettre une croissance correcte de l’organisme⁵. Une différenciation cellulaire appropriée au début du développement est cruciale lorsque l’organisme passe d’un embryon pluripotent à un organisme à part entière. En raison de la complexité de ces événements, les perturbations peuvent entraîner des anomalies du développement qui entraînent une létalité embryonnaire.

Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour étudier la méiose, la fécondation et le développement embryonnaire. C. elegans est un nématode transparent qui a deux sexes, mâles et hermaphrodites. C. elegans hermaphrodites, capables de s’autoféconder, sont le sexe prédominant ^6,7. La gonade hermaphrodite produit d’abord des spermatozoïdes au cours du quatrième stade larvaire (L4), qui sont stockés dans la spermathèque. Lors de la transition L4 à l’âge adulte, la lignée germinale passe à la production d’ovocytes, qui sont ensuite fécondés via le sperme stocké. Les mâles, qui apparaissent chez les hermaphrodites à un taux inférieur à 0,2%, ne produisent que des spermatozoïdes et peuvent s’accoupler avec des hermaphrodites. Lors de la fécondation croisée, les spermatozoïdes mâles surpassent les spermatozoïdes hermaphrodites dans la fécondation des ovocytes⁸. Cela permet le maintien relativement facile des mutants homozygotes grâce à des souches autofertilisantes et des manipulations génétiques par croisements génétiques. Les deux sexes permettent des études explorant les différences entre la méiose dans les lignées germinales mâles et femelles. De plus, en raison de la nature transparente de C. elegans et de ses œufs, les processus de méiose, de gamétogenèse, de fécondation et d’embryogenèse peuvent être étudiés chez des animaux vivants et intacts à l’aide de techniques d’imagerie par fluorescence.

Lors de l’analyse de nouvelles mutations dans les gènes qui peuvent jouer un rôle dans la méiose, la fécondation et / ou le développement embryonnaire chez C. elegans, une première étape cruciale consiste à déterminer la viabilité embryonnaire et la taille du couvain, car les erreurs dans ces processus conduisent souvent à un échec ou à une réduction de la production de descendants viables. Cet article décrit un protocole pour évaluer la fertilité, la viabilité embryonnaire et la taille du couvain à partir d’hermaphrodites autofécondants ou de croisements entre hermaphrodites et mâles. Bien que ce test classique ait été utilisé dans de nombreuses études sur C. elegans , nous fournissons un protocole standardisé pour la configuration et la quantification précise. Dans ce protocole, des vers individuels ou des couples mâles/hermaphrodites sont isolés pour permettre l’accouplement et la production de descendance. La production et la viabilité de la descendance sont observées sur une série de jours afin de déterminer le nombre de descendants viables et d’embryons non viables. À la fin de l’expérience, les couvées individuelles sont analysées pour calculer le pourcentage de viabilité embryonnaire et la taille totale de la couvée.

Protocol

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des plaques expérimentales

1. Préparer des boîtes de Petri de 35 mm de diamètre avec des milieux Modified Youngren’s, Only Bacto-peptone (MYOB). Pour faire des plaques MYOB, ajouter 20 g de gélose Botto, 2 g de NaCl, 0,55 g de Trizma-HCl, 0,24 g de Trizma-OH, 3,1 g de peptone de Bacto et 1,6 mL de cholestérol à 1 L de_ddH2Oet autoclave pendant 40 min à 121 °C. Laisser refroidir à 55 °C et, à l’aide d’une technique stérile, verser 4 ml du milieu fondu dans chaque boîte de Petri de 35 mm.
   REMARQUE: Un litre de MYOB fait ~ 250 plaques, qui peuvent être stockées à 4 ° C jusqu’à 6 mois. Nous recommandons un minimum de 10 individus par répétition avec trois ensembles de réplications pour chaque souche.
2. À l’aide d’une technique stérile, ensemencer les plaques avec une petite tache (environ 50 μL) de bactéries OP50 au milieu de la plaque.
   REMARQUE : Les petites pelouses sont particulièrement importantes pour évaluer la fertilisation croisée, car la plus petite tache entraîne une augmentation des rencontres entre les mâles et les hermaphrodites, augmentant ainsi les chances d’accouplement.

2. Essais de viabilité embryonnaire (autofécondation hermaphrodite)

1. Jour 1
   1. Étiquetez le dos de chaque assiette. Assurez-vous de garder une trace de chaque plaque et de leurs vers respectifs tout au long de l’expérience.
      REMARQUE: Technique d’étiquetage préférée-Jour 1: ver 1, Jour 1: ver 2, ... etc.
   2. Transférer un hermaphrodite individuel du stade L4 sur chaque plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. Laisser les vers se développer en adultes et pondre leur descendance pendant 24 heures à la température de culture standard de 20 °C. Marquez ces plaques le jour 3.
      NOTE: La température des expériences peut être modifiée dans le cas de mutations sensibles à la température. Pour les mutations sensibles à la température, les essais de viabilité embryonnaire doivent être effectués à la fois aux températures permissives (15-16 °C) et non permissives (24-26 °C).
2. Jour 2
   1. Étiquetez un ensemble de nouvelles plaques-Jour 2: ver 1, Jour 2: ver 2, ... etc.
   2. Transférer les vers individuels du jour 1 sur les nouvelles plaques.
      REMARQUE: Ces vers devraient avoir atteint l’âge adulte, et les vers de type sauvage devraient déjà avoir commencé à pondre des embryons.
   3. Laisser les vers pondre des embryons pendant 24 h à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques le jour 4.
3. Jour 3
   1. Étiquetez un ensemble de nouvelles plaques. Jour 3: ver 1, Jour 3: ver 2, ... etc.
   2. Transférer les vers individuels du jour 2 sur de nouvelles assiettes. Laissez-les pondre pendant 24 heures à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques le jour 5.
      NOTE: En cas de températures plus basses, les temps d’éclosion seront augmentés. Ajustez en conséquence.
   3. Dessinez un motif de grille sur un couvercle de 35 mm à l’aide d’un marqueur fin. Placez le couvercle quadrillé sous la plaque d’essai pour le comptage afin de garder une trace des vers précédemment comptés (Figure 1A-B).
      1. À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, notez les plaques du jour 1 pour la présence ou l’absence de descendance. Comptez les larves vivantes et les embryons non éclos.
         NOTE: À ce stade, un temps suffisant s’est écoulé pour que tous les embryons viables aient éclos. Tout embryon non éclos est présumé mort.
      2. À l’intérieur d’un carré individuel, compter les embryons non éclos et les larves vivantes qui se trouvent entièrement dans le carré (figure 1C-F).
      3. Pour les vers qui se trouvent sur les bordures carrées, comptez en fonction de l’emplacement de la tête du ver. Comptez les vers dont la tête touche les bords supérieur et gauche du carré (ne comptez pas ceux qui touchent les bords inférieur ou droit; Figure 1D). Ne comptez pas les ovocytes non fécondés pour ce test (Figure 1F).
   4. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.
4. Jour 4
   1. Noter les plaques du jour 2 en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.
5. Jour 5
   1. Noter les plaques du jour 3 en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire. Analyser les données obtenues à l’aide de la méthode décrite dans l’analyse des données.
      NOTE: Certains mutants génétiques peuvent avoir un cycle de reproduction retardé ou élargi. Surveiller les souches individuelles pour la poursuite de la ponte des embryons au-delà des plaques du jour 3. Si la production d’embryons n’a pas cessé au jour 4, continuer à transférer les adultes dans de nouvelles plaques.

3. Essais de viabilité embryonnaire (fécondation croisée mâle/hermaphrodite)

1. Jour 1
   1. Étiquetez le dos de chaque assiette. Assurez-vous de garder une trace de chaque plaque et de leurs vers respectifs tout au long de l’expérience.
   2. Transférer un ver hermaphrodite L4 individuel sur chaque plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette.
      NOTE: Les souches féminisées, telles que les mutants de perte de fonction fog-2 , qui ne produisent pas de spermatozoïdes, peuvent être utilisées à la place des hermaphrodites.
   3. Transférer un seul ver mâle L4 sur chaque plaque étiquetée contenant un hermaphrodite L4. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette.
      REMARQUE: Des souches telles que les mâles variants plg-1 peuvent être utilisées pour déterminer si l’accouplement a eu lieu, car ces mâles déposent un bouchon copulatoire sur la vulve hermaphrodite après l’accouplement.
   4. Laisser les vers s’accoupler et pondre pendant 24 h à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos au jour 3.
2. Jour 2
   1. Étiquetez un ensemble de nouvelles plaques et transférez les vers, comme au jour 2 ci-dessus. Dans ce cas, assurez-vous de transférer l’hermaphrodite et le mâle sur de nouvelles plaques. Assurez-vous que l’hermaphrodite a atteint l’âge adulte.
   2. Laisser les hermaphrodites pondre pendant 24 heures à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos au jour 4.
3. Jour 3
   1. Étiquetez un ensemble de nouvelles assiettes et transférez les vers, comme au jour 3 ci-dessus. Assurez-vous de transférer l’hermaphrodite et le mâle sur de nouvelles plaques.
   2. Laisser pondre la progéniture pendant 24 h à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques pour les embryons vivants par rapport aux embryons non éclos le jour 5.
   3. À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, compter les larves vivantes et les embryons non éclos des plaques du jour 1, comme décrit à l’étape 2.3.3.1.
      REMARQUE: Ne jetez pas les plaques, car elles sont requises pour le jour 4.
   4. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.
4. Jour 4
   1. Compter la descendance vivante et les embryons non éclos des plaques du jour 2, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.
   2. Vérifiez les plaques du jour 1 pour les hommes. Si l’accouplement a eu lieu, le rapport génétique attendu des hermaphrodites par rapport aux mâles devrait être de 50:50. Si les plaques du jour 1 ne contiennent aucun mâle, l’accouplement entre le mâle et l’hermaphrodite n’a pas eu lieu. Jetez ce couple d’accouplement et notez cette observation dans le cahier de laboratoire.
5. Jour 5
   1. Compter les larves vivantes et les embryons non éclos des plaques du jour 3, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire. Analyser les données obtenues à l’aide des méthodes décrites dans l’analyse des données.

4. Analyse des données

1. Calculer le pourcentage de viabilité embryonnaire d’une réplication biologique donnée d’une souche à l’aide de l’équation (1).
   NOTE: Le nombre de descendants vivants et d’embryons non éclos est obtenu en totalisant le nombre quotidien tout au long de la période expérimentale.
   (1)
2. Calculer la taille de la couvée par ver d’une souche donnée en additionnant le nombre de descendants (embryons et larves non éclos) produits par l’hermaphrodite parent. Calculer la taille moyenne de la couvée à l’aide de l’équation (2).
   (2)
3. Indiquez le pourcentage de viabilité embryonnaire et la taille moyenne des couvées avec la moyenne et l’écart-type entre les répétitions biologiques. Effectuer le test t de Student en comparant les données de contrôle et expérimentales.

Representative Results

Nous avons effectué des tests de viabilité embryonnaire et de dimensionnement du couvain sur N2 (type sauvage) et sur deux souches présentant des mutations dans les gènes impliqués dans la méiose, him-5 (e1490) et spo-11 (ok79). Comme him-5 et spo-11 jouent tous deux un rôle dans la formation de croisements méiotiques, des mutations dans ces deux gènes entraînent la formation de gamètes aneuploïdes. Cet essai de viabilité embryonnaire pour N2 a donné un pourcentage de viabilité de 98,9 %, tandis que him-5(e1490) et spo-11(ok79) ont montré une réduction de la viabilité de la descendance avec un pourcentage de 74,9 % et 0,8 %, respectivement (Figure 2A; p < 0,0005). Ces résultats concordent avec ceux publiés antérieurement ^7,9. La taille moyenne des couvées N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) a été déterminée à 217, 105 et 219, respectivement (figure 2B). Conformément aux publications précédentes, him-5 (e1490) a une taille de couvain significativement réduite par rapport au type sauvage, alors que spo-11 (ok79) n’en a pas ^7,9.

Figure 1 : Démonstration de la configuration de comptage et de la morphologie embryonnaire sur plaques. (A) Image d’un couvercle avec un motif de grille hachurée dessiné à l’aide d’un sharpie fin. (B) Une plaque MYOB de 35 mm avec le couvercle à motifs en dessous pour le comptage. (C) Image montrant un faible grossissement (10x) montrant plusieurs cases de la grille. Les pointes de flèches blanches indiquent plusieurs larves dans ce champ de vision. Le comptage doit être effectué à un grossissement plus élevé (un seul carré dans le champ) pour observer à la fois les larves et les embryons. Barre d’échelle = 1 000 μm. (D) Dessin du couvercle avec le motif de la grille placé sous une plaque de 35 mm. L’encart indique la technique appropriée pour déterminer quelles larves sont comptées dans un carré donné. Comptez de haut en bas, de gauche à droite. Comptez tous les vers qui se trouvent entièrement dans le carré. Les vers qui touchent la limite doivent être comptés en fonction de la position de la tête du ver et non de la queue. Comptez les vers faisant face à la grille actuelle ou les grilles qui ont été précédemment comptées (c’est-à-dire les bords supérieur et gauche). Ne comptez pas les vers dont la tête touche le bas ou le bord droit. À partir de l’encart des vers bleus, les vers bleus seront comptés alors que les vers rouges ne le seront pas. (E) Image représentative des larves écloses N2 L1 en bonne santé (pointe de flèche blanche). (F) Image représentative d’un ovocyte non fécondé (pointe de flèche noire) et d’un embryon non éclos (pointe de flèche rouge). Les ovocytes non fécondés ne doivent pas être comptés pour ce test. Barres d’échelle (E,F) = (100 μm). Remarque: Les images en C, E et F ont été prises avec un microscope Zeiss AxioZoom, avec une caméra fixée dans le but de démontrer l’apparence des larves, des embryons et des ovocytes sur les plaques de vers. Pour les essais de viabilité embryonnaire, les comptages sont effectués tout en observant les plaques à l’aide d’un stéréomicroscope (pas de caméra). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Graphiques représentatifs illustrant les résultats des essais de viabilité embryonnaire et de la taille des couvées. (A) Pourcentage de viabilité embryonnaire de N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) à 20 °C. (B) Tailles de couvée de N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) à 20 °C . La descendance d’au moins 28 hermaphrodites a été notée pour chaque souche. Le nombre total d’embryons non éclos et de larves marquées était N2 = 6302, him-5(e1490) = 2 945 et spo-11(ok79) = 7 230. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type sur trois répétitions individuelles distinctes. Statistiques calculées à l’aide du test t de Student, n.s. = non significatif, *p < 0,0005. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La propagation des espèces à reproduction sexuée nécessite la formation de gamètes haploïdes (c’est-à-dire des ovules et des spermatozoïdes) par méiose, qui sont ensuite unifiés lors de la fécondation, restaurant le nombre de chromosomes diploïdes et initiant le développement embryonnaire. Des erreurs dans l’un de ces processus peuvent entraîner l’infertilité, la létalité embryonnaire et / ou des malformations congénitales. C. elegans est un puissant système modèle pour étudier la reproduction sexuée. Les effets des mutations génétiques ou de l’élimination de l’expression génique (p. ex. interférence ARN) peuvent être évalués relativement rapidement et facilement à l’aide des essais de viabilité embryonnaire et de dimensionnement du couvain décrits ci-dessus. Nous avons utilisé ces méthodes pour la caractérisation initiale des gènes impliqués dans la ségrégation et la fécondation des chromosomes méiotiques / activation des œufs^10,11,12. Une réduction observée de la viabilité embryonnaire ou de la taille du couvain indique une perturbation de la méiose, de la gamétogenèse, de la fécondation ou de l’embryogenèse.

Comme la viabilité embryonnaire et le dimensionnement du couvain sont évalués relativement facilement par comptage de la descendance et un simple calcul mathématique, il s’agit d’expériences d’introduction optimales pour les novices en recherche, que ce soit en laboratoire ou en classe. La facilité d’élevage de C. elegans et les avantages économiques les rendent particulièrement adaptés aux cours de biologie expérimentale. Les étudiants acquièrent une expérience de recherche précieuse grâce à l’élevage de C. elegans , apprennent à utiliser des microscopes à dissection et peuvent poser des questions biologiques dans un système de développement auquel il est possible de répondre dans un laps de temps relativement court (environ 5 jours avec le protocole décrit dans cet article).

Le moment du dénombrement des descendants est très important pour les essais de viabilité embryonnaire. À 20 °C, l’embryogenèse prend environ 16 h et les adultes matures sur le plan de la reproduction commencent à pondre environ 60 h après l’éclosion en tant que larves L1. Comme le cycle de vie est rapide, il est important de compter la progéniture dans la fenêtre appropriée, en laissant suffisamment de temps aux embryons pour éclore, mais avant que la progéniture elle-même ne commence à pondre des œufs. Il est également important de noter que les périodes de croissance varient en fonction de la température. La croissance est environ 2,1 fois plus rapide à 24-25 °C qu’à 15-16 °C, et environ 1,3 fois plus rapide à 20 °C que 15-16 °C¹³. Dans ce protocole, nous recommandons que les dénombrements aient lieu 48 heures après que les adultes ont été placés sur une assiette fraîche. Ce délai garantit que tous les embryons ayant un développement de type sauvage ont suffisamment de temps pour éclore (>16 h), mais ne vieillissent pas au point de se reproduire. Les essais effectués à des températures inférieures à 20 °C peuvent devoir être prolongés (animaux transférés pendant 4 jours) pour que les embryons éclosent et que la descendance éclose atteigne des stades larvaires plus faciles à observer parmi les bactéries sur les plaques MYOB (stades L3-L4).

Une limite aux essais de viabilité embryonnaire et au dimensionnement du couvain est que le processus de développement spécifique qui est perturbé n’est pas facilement apparent. Cependant, ces tests initiaux peuvent être suivis de techniques cytologiques pour déterminer quel processus est affecté. Par exemple, la dissection des vers adultes pour libérer la gonade suivie d’une coloration au 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et une analyse minutieuse de la morphologie de l’ADN dans la lignée germinale peuvent révéler si les processus méiotiques sont perturbés. En outre, la coloration DAPI des embryons peut révéler à quel stade l’embryogenèse s’arrête.

En conclusion, nous avons décrit un protocole pour tester le nombre d’embryons produits (couvée) et le pourcentage d’embryons viables pour divers mutants de C. elegans. Ce test peut être utilisé à la fois pour les hermaphrodites autofécondants et pour les croisements mâle/hermaphrodites. Avec le cycle de vie court de C. elegans, ce protocole peut être complété en moins de 1 semaine. Les tests de viabilité embryonnaire et la taille des couvées peuvent être utilisés comme premières analyses des gènes impliqués dans la méiose, la fécondation ou le développement embryonnaire, et sont des protocoles appropriés pour les chercheurs plus avancés et les novices en recherche (étudiants de premier cycle et de première année).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.