Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Summary

Aquí, presentamos un método general para determinar la viabilidad embrionaria y el número total de embriones producidos (cría) utilizando el organismo modelo C. elegans.

Abstract

Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para el estudio de la meiosis, la fertilización y el desarrollo embrionario. C. elegans existen como hermafroditas autofertilizantes, que producen grandes crías de progenie; cuando los machos están presentes, pueden producir crías aún más grandes de progenie cruzada. Los errores en la meiosis, la fertilización y la embriogénesis pueden evaluarse rápidamente como fenotipos de esterilidad, fertilidad reducida o letalidad embrionaria. Este artículo describe un método para determinar la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en C. elegans. Demostramos cómo configurar este ensayo recogiendo un gusano en una placa individual de Youngren's Only Bacto-peptone (MYOB), establecemos el marco de tiempo apropiado para contar la progenie viable y los embriones no viables, y explicamos cómo contar con precisión las muestras de gusanos vivos. Esta técnica se puede utilizar para determinar la viabilidad en hermafroditas autofertilizantes, así como la fertilización cruzada mediante parejas de apareamiento. Estos experimentos relativamente simples son fácilmente adoptables para nuevos investigadores, como estudiantes de pregrado y estudiantes de posgrado de primer año.

Introduction

La reproducción sexual en organismos eucariotas requiere la producción de gametos funcionales que se fusionan para formar un embrión a través del proceso de fertilización. Los gametos maternos y paternos, el óvulo (óvulos) y los espermatozoides se crean a través de los procesos especializados de división celular y diferenciación de la meiosis y la gametogénesis¹. La meiosis comienza con una sola célula diploide y termina con la formación de células hijas que contienen la mitad del número de cromosomas de la célula parental original. Desde la reducción de la ploidía hasta la mezcla de material genético a través del surtido independiente y la recombinación cruzada, la meiosis cumple múltiples funciones importantes¹. Los errores dentro de la meiosis pueden resultar en aneuploidía, en la que hay demasiados o muy pocos cromosomas dentro de un gameto. Las incidencias de aneuploidía tienen un tremendo impacto en la salud humana, ya que los desequilibrios cromosómicos son una causa importante de abortos espontáneos y trastornos del desarrollo como el síndrome de Down y el síndrome de Edwards².

La fecundación es el proceso por el cual los gametos materno y paterno se fusionan para generar un nuevo organismo³. El reconocimiento de gametos-gametos es facilitado por proteínas en la superficie del gameto³. Los errores con la compatibilidad de gametos conducen a la infertilidad ya que la fusión de espermatozoides y óvulos no puede continuar. La fusión de espermatozoides con un ovocito desencadena una serie de eventos que conducen a la formación adecuada de un embrión activo que puede comenzar el viaje de desarrollo de un embrión unicelular a un organismo multicelular completamente funcional a través de divisiones mitóticas⁴. A lo largo de la embriogénesis, los eventos moleculares que regulan el desarrollo deben estar estrechamente regulados y cronometrados con precisión para permitir el crecimiento adecuado del organismo⁵. La diferenciación celular adecuada durante el desarrollo temprano es crucial a medida que el organismo pasa de un embrión pluripotente a un organismo de pleno derecho. Debido a las complejidades de estos eventos, las interrupciones pueden conducir a defectos de desarrollo que resultan en letalidad embrionaria.

Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para estudiar la meiosis, la fertilización y el desarrollo embrionario. C. elegans es un nematodo transparente que tiene dos sexos, machos y hermafroditas. C. elegans hermafroditas, capaces de autofecundarse, son el sexo predominante ^6,7. La gónada hermafrodita primero produce espermatozoides durante la cuarta etapa larvaria (L4), que se almacenan en la espermateca. En la transición de L4 a la edad adulta, la línea germinal cambia a la producción de ovocitos, que luego se fertilizan a través de los espermatozoides almacenados. Los machos, que surgen en los hermafroditas a una tasa de menos del 0,2%, solo producen espermatozoides y pueden aparearse con hermafroditas. Tras la fecundación cruzada, los espermatozoides masculinos superan a los espermatozoides hermafroditas en la fecundación de los ovocitos⁸. Esto permite el mantenimiento relativamente fácil de mutantes homocigotos a través de poblaciones autofertilizantes y manipulaciones genéticas a través de cruces genéticos. Los dos sexos permiten estudios que exploran las diferencias entre la meiosis en las líneas germinales masculinas y femeninas. Además, debido a la naturaleza transparente de C. elegans y sus huevos, los procesos de meiosis, gametogénesis, fertilización y embriogénesis se pueden estudiar en animales vivos e intactos utilizando técnicas de imágenes de fluorescencia.

Al analizar nuevas mutaciones en genes que pueden desempeñar un papel en la meiosis, fertilización y / o desarrollo embrionario en C. elegans, un primer paso crucial es determinar la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría, ya que los errores en estos procesos a menudo conducen a una falla o reducción en la producción de progenie viable. Este documento describe un protocolo para evaluar la fertilidad, la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría de hermafroditas autofertilizantes o cruces entre hermafroditas y machos. Si bien este ensayo clásico se ha utilizado en muchos estudios de C. elegans , proporcionamos un protocolo estandarizado para la configuración y cuantificación precisa. En este protocolo, se aíslan gusanos individuales o pares macho/hermafrodita para permitir el apareamiento y la producción de progenie. La producción y viabilidad de la progenie se observa durante una serie de días para determinar el número de progenies viables y embriones no viables. Al concluir el experimento, se analizan las crías individuales para calcular el porcentaje de viabilidad embrionaria y el tamaño total de la cría.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en este protocolo.

1. Preparación de placas experimentales

1. Prepare placas de Petri de 35 mm de diámetro con medios de Youngren's modificados, solo bacto-peptona (MYOB). Para hacer placas MYOB, añadir 20 g de agar Bacto, 2 g de NaCl, 0,55 g de Trizma-HCl, 0,24 g de Trizma-OH, 3,1 g de peptona de Bacto y 1,6 mL de colesterol a 1 L de_ddH2Oy autoclave durante 40 min a 121 °C. Dejar enfriar a 55 °C y, utilizando una técnica estéril, verter 4 ml del medio fundido en cada placa de Petri de 35 mm.
   NOTA: Un litro de MYOB hace ~ 250 placas, que se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses. Recomendamos un mínimo de 10 individuos por réplica con tres conjuntos de réplicas para cada cepa.
2. Usando una técnica estéril, siembre las placas con una pequeña mancha (aproximadamente 50 μL) de bacterias OP50 en el centro de la placa.
   NOTA: Los céspedes pequeños son especialmente importantes para evaluar la fertilización cruzada, ya que el punto más pequeño conduce a un aumento de los encuentros entre machos y hermafroditas, lo que aumenta la posibilidad de apareamiento.

2. Ensayos de viabilidad embrionaria (autofecundación hermafrodita)

1. Día 1
   1. Etiquete la parte posterior de cada plato. Asegúrese de realizar un seguimiento de cada placa y sus respectivos gusanos durante todo el experimento.
      NOTA: Técnica de etiquetado preferida-Día 1: gusano 1, Día 1: gusano 2, ... etc.
   2. Transfiera un hermafrodita individual de la etapa L4 a cada placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. Permita que los gusanos se conviertan en adultos y deposite su autoprogenie durante 24 h a la temperatura de cultivo estándar de 20 °C. Anota estos platos el día 3.
      NOTA: La temperatura de los experimentos puede ser alterada en el caso de mutaciones sensibles a la temperatura. Para mutaciones sensibles a la temperatura, los ensayos de viabilidad embrionaria deben realizarse tanto a temperaturas permisivas (15-16 °C) como no permisivas (24-26 °C).
2. Día 2
   1. Etiqueta un conjunto de placas nuevas-Día 2: gusano 1, Día 2: gusano 2, ... etc.
   2. Transfiera los gusanos individuales del día 1 a las nuevas placas.
      NOTA: Estos gusanos deberían haber alcanzado la edad adulta, y los gusanos de tipo salvaje ya deberían haber comenzado a poner embriones.
   3. Dejar que los gusanos pongan embriones durante 24 h a 20 °C u otra temperatura adecuada. Anota estos platos el día 4.
3. Día 3
   1. Etiquete un juego de platos nuevos. Día 3: gusano 1, Día 3: gusano 2, ... etc.
   2. Transfiera los gusanos individuales del día 2 a placas nuevas. Déjelos descendientes durante 24 h a 20 °C u otra temperatura apropiada. Anota estas placas el día 5.
      NOTA: En casos de temperaturas más bajas, los tiempos de eclosión aumentarán. Ajústese en consecuencia.
   3. Dibuje un patrón de cuadrícula en una tapa de 35 mm con un marcador fino. Coloque la tapa cuadriculada debajo de la placa de prueba para contar y realizar un seguimiento de los gusanos contados anteriormente (Figura 1A-B).
      1. Usando un contador de células diferenciales, puntúe las placas del día 1 para la presencia o ausencia de progenie. Cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados.
         NOTA: En este punto, ha transcurrido un tiempo suficiente para que cualquier embrión viable haya eclosionado. Cualquier embrión no eclosionado se presume muerto.
      2. Dentro de un cuadrado individual, cuente los embriones no eclosionados y las larvas vivas que están completamente dentro del cuadrado (Figura 1C-F).
      3. Para los gusanos que están en los bordes cuadrados, cuente según la ubicación de la cabeza del gusano. Cuente los gusanos con cabezas tocando los bordes superior e izquierdo del cuadrado (no cuente los que tocan los bordes inferior o derecho; Figura 1D). No contar ovocitos no fertilizados para este ensayo (Figura 1F).
   4. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.
4. Día 4
   1. Puntuar las placas del día 2 contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados, como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.
5. Día 5
   1. Puntuar las placas del día 3 contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados, como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio. Analizar los datos obtenidos utilizando el método descrito en el análisis de datos.
      NOTA: Algunos mutantes genéticos pueden tener un ciclo reproductivo retrasado o expandido. Monitoree las cepas individuales para la puesta continua de embriones más allá de las placas del día 3. Si la producción de embriones no ha cesado para el día 4, continúe transfiriendo a los adultos a nuevas placas.

3. Ensayos de viabilidad embrionaria (fecundación cruzada masculina/hermafrodita)

1. Día 1
   1. Etiquete la parte posterior de cada plato. Asegúrese de realizar un seguimiento de cada placa y sus respectivos gusanos durante todo el experimento.
   2. Transfiera un gusano hermafrodita L4 individual a cada placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa.
      NOTA: Las cepas feminizadas, como los mutantes de pérdida de función fog-2 , que no producen espermatozoides, se pueden usar en lugar de hermafroditas.
   3. Transfiera un solo gusano macho L4 a cada placa etiquetada que contenga un hermafrodita L4. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa.
      NOTA: Las cepas como los machos de la variante plg-1 se pueden usar para identificar si se ha producido apareamiento, ya que estos machos depositan un tapón copulatorio en la vulva hermafrodita después del apareamiento.
   4. Dejar que los gusanos se apareen y pongan descendencia durante 24 h a 20 °C, u otra temperatura apropiada. Puntúe estas placas para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el día 3.
2. Día 2
   1. Etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera los gusanos, como en el día 2 anterior. En este caso, asegúrese de transferir tanto el hermafrodita como el macho a nuevas placas. Asegúrese de que el hermafrodita ha alcanzado la edad adulta.
   2. Permitir que los hermafroditas pongan descendencia durante 24 h a 20 °C, u otra temperatura apropiada. Puntúe estas placas para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el día 4.
3. Día 3
   1. Etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera los gusanos, como en el día 3 anterior. Asegúrese de transferir tanto el hermafrodita como el macho a placas nuevas.
   2. Dejar que la progenie coloque durante 24 h a 20 °C, u otra temperatura adecuada. Puntúe estas placas para embriones vivos versus no eclosionados en el día 5.
   3. Utilizando un contador de células diferenciales, contar las larvas vivas y los embriones no eclosionados de las placas del día 1, como se describe en el paso 2.3.3.1.
      NOTA: No deseche las placas, ya que son necesarias para el día 4.
   4. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.
4. Día 4
   1. Contar las placas de la progenie viva y los embriones no eclosionados del día 2, tal como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.
   2. Verifique las placas del día 1 para hombres. Si se ha producido el apareamiento, la proporción genética esperada de hermafroditas a machos debe ser de 50:50. Si las placas del día 1 no contienen machos, no se produjo apareamiento entre el macho y el hermafrodita. Descarte este par de apareamiento y registre esta observación en el cuaderno de laboratorio.
5. Día 5
   1. Contar las larvas vivas y los embriones no eclosionados a partir de las placas del día 3, como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio. Analizar los datos obtenidos utilizando los métodos descritos en el análisis de datos.

4. Análisis de datos

1. Calcular el porcentaje de viabilidad embrionaria de una réplica biológica dada de una cepa usando la ecuación (1).
   NOTA: El número de descendientes vivos y embriones no eclosionados se obtiene sumando el recuento diario durante todo el período experimental.
   (1)
2. Calcule el tamaño de la cría por gusano de una cepa dada sumando el número de descendientes (embriones y larvas no eclosionados) producidos por el hermafrodita parental. Calcule el tamaño promedio de la cría usando la ecuación (2).
   (2)
3. Informe el porcentaje de viabilidad embrionaria y el tamaño promedio de la cría con la desviación promedio y estándar entre réplicas biológicas. Realizar la prueba t de Student comparando los datos de control y experimentales.

Representative Results

Realizamos ensayos de viabilidad embrionaria y tamaño de cría en N2 (tipo salvaje) y en dos cepas que albergan mutaciones en genes implicados en la meiosis, him-5(e1490) y spo-11(ok79). Como tanto him-5 como spo-11 juegan un papel en la formación del cruce meiótico, las mutaciones en estos dos genes dan lugar a la formación de gametos aneuploides. Este ensayo de viabilidad embrionaria para N2 arrojó un porcentaje de viabilidad del 98,9%, mientras que tanto him-5(e1490) como spo-11(ok79) mostraron una reducción en la viabilidad de la progenie con un porcentaje de 74,9% y 0,8%, respectivamente (Figura 2A; p < 0,0005). Estos resultados son consistentes con los resultados publicados anteriormente ^7,9. Se determinó que el tamaño promedio de cría de N2, him-5 (e1490) y spo-11 (ok79) era 217, 105 y 219, respectivamente (Figura 2B). De acuerdo con publicaciones anteriores, him-5 (e1490) tiene un tamaño de cría significativamente reducido en comparación con el tipo silvestre, mientras que spo-11 (ok79) no ^7,9.

Figura 1: Demostración de la configuración del conteo y la morfología embrionaria en placas . (A) Imagen de una tapa con un patrón de cuadrícula rayada dibujada con un sharpie fino. (B) Una placa MYOB de 35 mm con la tapa estampada debajo para contar. (C) Imagen que muestra un campo de visión de bajo aumento (10x) que muestra múltiples cajas de la cuadrícula. Las puntas de flecha blancas señalan varias larvas dentro de este campo de visión. El conteo debe hacerse a un aumento mayor (solo un cuadrado en el campo) para observar tanto larvas como embriones. Barra de escala = 1.000 μm. (D) Caricatura de la tapa con el patrón de rejilla colocado debajo de una placa de 35 mm. El recuadro denota la técnica adecuada para determinar qué larvas se cuentan en un cuadrado dado. Cuenta de arriba a abajo, de izquierda a derecha. Cuente cualquier gusano que esté completamente dentro del cuadrado. Los gusanos que tocan el límite deben contarse en función de la posición de la cabeza del gusano, no de la cola. Cuente los gusanos frente a la cuadrícula actual o las cuadrículas que se han contado previamente (es decir, los bordes superior e izquierdo). No cuente los gusanos con cabezas tocando los bordes inferior o derecho. A partir del recuadro, los gusanos azules se contarán, mientras que los gusanos rojos no. (E) Imagen representativa de larvas sanas N2 L1 eclosionadas (punta de flecha blanca). (F) Imagen representativa de un ovocito no fertilizado (punta de flecha negra) y un embrión no eclosionado (punta de flecha roja). Los ovocitos no fertilizados no deben contarse para este ensayo. Barras de escala (E,F) = (100 μm). Nota: Las imágenes en C, E y F se tomaron con un microscopio Zeiss AxioZoom, con una cámara conectada con el propósito de demostrar la apariencia de larvas, embriones y ovocitos en placas de gusano. Para los ensayos de viabilidad embrionaria, los recuentos se realizan mientras se observan las placas utilizando un microscopio estereoscópico (sin cámara). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Gráficos representativos que representan los resultados de los ensayos de viabilidad embrionaria y los tamaños de cría. (A) Porcentaje de viabilidad embrionaria de N2, him-5(e1490) y spo-11(ok79) a 20 °C. (B) Tamaños de cría de N2, him-5(e1490) y spo-11(ok79) a 20 °C. La progenie de al menos 28 hermafroditas fueron puntuados para cada cepa. El número total de embriones no eclosionados más larvas puntuadas fueron N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2,945 y spo-11 (ok79) = 7,230. Las barras de error indican la desviación estándar en tres réplicas individuales separadas. Estadística calculada mediante la prueba t de Student, n.s. = no significativa, *p < 0,0005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La propagación de especies que se reproducen sexualmente requiere la formación de gametos haploides (es decir, óvulos y espermatozoides) a través de la meiosis, que luego se unifican en la fertilización, restaurando el número de cromosomas diploides e iniciando el desarrollo embrionario. Los errores en cualquiera de estos procesos pueden conducir a la infertilidad, letalidad embrionaria y / o defectos de nacimiento. C. elegans es un poderoso sistema modelo para estudiar la reproducción sexual. Los efectos de las mutaciones génicas o la eliminación de la expresión génica (por ejemplo, interferencia de ARN) se pueden evaluar con relativa rapidez y facilidad utilizando los ensayos de viabilidad embrionaria y tamaño de cría descritos anteriormente. Hemos utilizado estos métodos para la caracterización inicial de genes implicados en la segregación cromosómica meiótica y la fertilización/activación del óvulo^10,11,12. Una reducción observada en la viabilidad embrionaria o el tamaño de la cría indica una interrupción en la meiosis, gametogénesis, fertilización o embriogénesis.

Como la viabilidad embrionaria y el tamaño de las crías se evalúan con relativa facilidad mediante el conteo de la progenie y un cálculo matemático simple, estos son experimentos introductorios óptimos para los principiantes en investigación, ya sea en el laboratorio o en el aula. La facilidad de cría de C. elegans y las ventajas económicas los hacen particularmente adecuados para las clases de biología experimental. Los estudiantes adquieren una valiosa experiencia de investigación a través de la cría de C. elegans , aprenden a usar microscopios de disección y pueden hacer preguntas biológicas en un sistema de desarrollo que se pueden responder en un período de tiempo relativamente corto (aproximadamente 5 días con el protocolo descrito en este documento).

El momento de los recuentos de progenie es muy importante para los ensayos de viabilidad embrionaria. A 20 °C, la embriogénesis dura aproximadamente 16 h, y los adultos reproductivamente maduros comienzan a poner huevos aproximadamente 60 h después de la eclosión como larvas L1. Como el ciclo de vida es rápido, es importante contar la progenie dentro de la ventana apropiada, dando tiempo suficiente para que los embriones eclosionen, pero antes de que la progenie comience a poner huevos. También es importante tener en cuenta que los períodos de crecimiento varían dependiendo de la temperatura. El crecimiento es aproximadamente 2,1 veces más rápido a 24-25 °C que a 15-16 °C, y aproximadamente 1,3 veces más rápido a 20 °C que a 15-16 °C¹³. En este protocolo, recomendamos que los recuentos ocurran 48 h después de que los adultos se colocan en un plato nuevo. Este período de tiempo asegura que todos los embriones con desarrollo de tipo salvaje tengan tiempo suficiente para eclosionar (>16 h), pero no envejecen hasta el punto de la capacidad reproductiva. Los ensayos realizados a temperaturas inferiores a 20 °C pueden necesitar ser extendidos (animales de transferencia durante 4 días) para que los embriones eclosionen y para que la progenie eclosionada alcance etapas larvales que son más fáciles de observar entre las bacterias en las placas MYOB (etapas L3-L4).

Una limitación para los ensayos de viabilidad embrionaria y el tamaño de las crías es que el proceso de desarrollo específico que se perturba no es evidente. Sin embargo, estos ensayos iniciales pueden ser seguidos con técnicas citológicas para determinar qué proceso está afectado. Por ejemplo, la disección de los gusanos adultos para liberar la gónada seguida de tinción de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y un análisis cuidadoso de la morfología del ADN dentro de la línea germinal pueden revelar si los procesos meióticos se interrumpen. Además, la tinción DAPI de embriones puede revelar en qué etapa se detiene la embriogénesis.

En conclusión, hemos descrito un protocolo para analizar el número de embriones producidos (cría) y el porcentaje de embriones que son viables para varios mutantes de C. elegans. Este ensayo se puede utilizar tanto para hermafroditas autofertilizantes como para cruces masculinos / hermafroditas. Con el corto ciclo de vida de C. elegans, este protocolo se puede completar en menos de 1 semana. Los ensayos de viabilidad embrionaria y los tamaños de cría se pueden utilizar como primeros análisis de genes involucrados en la meiosis, la fertilización o el desarrollo embrionario, y son protocolos apropiados para investigadores más avanzados y novatos en investigación (estudiantes de pregrado y posgrado de primer año) por igual.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.