Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Summary

Burada, C. elegans model organizmasını kullanarak embriyonik canlılığı ve üretilen toplam embriyo sayısını (kuluçka) belirlemek için genel bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

Caenorhabditis elegans , mayoz, döllenme ve embriyonik gelişim çalışmaları için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans , büyük yavru yavruları üreten kendi kendine döllenen hermafroditler olarak bulunur - erkekler mevcut olduğunda, daha büyük çapraz soy yavruları üretebilirler. Mayoz, döllenme ve embriyogenezdeki hatalar hızla sterilitenin fenotipleri, azalmış doğurganlık veya embriyonik ölümcüllük olarak değerlendirilebilir. Bu makalede, C. elegans'ta embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bireysel bir Modifiye Youngren'ın, Sadece Bakto-pepton (MYOB) plakasına bir solucan toplayarak bu tahlilin nasıl kurulacağını gösteriyoruz, canlı soy ve canlı olmayan embriyoları saymak için uygun zaman dilimini oluşturuyoruz ve canlı solucan örneklerinin nasıl doğru bir şekilde sayılacağını açıklıyoruz. Bu teknik, kendi kendine döllenen hermafroditlerde canlılığı ve çiftleşme çiftleriyle çapraz döllenmeyi belirlemek için kullanılabilir. Bu nispeten basit deneyler, lisans öğrencileri ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri gibi yeni araştırmacılar için kolayca benimsenebilir.

Introduction

Ökaryotik organizmalarda cinsel üreme, döllenme süreci boyunca bir embriyo oluşturmak için birleşen fonksiyonel gametlerin üretimini gerektirir. Maternal ve paternal gametler, yumurta (yumurtalar) ve sperm, mayoz ve gametogenezin özelleşmiş hücre bölünmesi ve farklılaşma süreçleri yoluyla oluşturulur¹. Mayoz, tek bir diploid hücre ile başlar ve orijinal ebeveyn hücrenin kromozom sayısının yarısını içeren yavru hücrelerin oluşumu ile sona erer. Ploidinin azaltılmasından, genetik materyalin bağımsız ürün çeşitliliği ve çapraz rekombinasyon yoluyla karıştırılmasına kadar, mayoz birçok önemli fonksiyona hizmet eder¹. Mayoz içindeki hatalar, bir gamet içinde çok fazla veya çok az kromozom bulunan anöploidi ile sonuçlanabilir. Anöploidi insidansı insan sağlığı üzerinde muazzam etkilere sahiptir, çünkü kromozomal dengesizlikler düşüklerin ve Down sendromu ve Edwards sendromu gibi gelişimsel bozuklukların önemli bir nedenidir².

Döllenme, anne ve baba gametlerinin yeni bir organizma oluşturmak için kaynaştığı süreçtir³. Gamet-gamet tanıma, gamet yüzeyindeki proteinler tarafından kolaylaştırılır³. Gamet uyumluluğu ile ilgili hatalar, sperm ve yumurta füzyonu ilerleyemediği için infertiliteye yol açar. Spermin bir oosit ile füzyonu, tek hücreli bir embriyodan mitotik bölünmeler yoluyla tamamen işlevsel çok hücreli bir organizmaya gelişimsel yolculuğa başlayabilen aktif bir embriyonun doğru oluşumuna yol açan bir dizi olayı tetikler⁴. Embriyogenez boyunca, gelişimi düzenleyen moleküler olaylar, organizmanın düzgün büyümesini sağlamak için sıkı bir şekilde düzenlenmeli ve hassas bir şekilde zamanlanmalıdır⁵. Erken gelişim sırasında uygun hücresel farklılaşma, organizma pluripotent bir embriyodan tam teşekküllü bir organizmaya geçerken çok önemlidir. Bu olayların karmaşıklığı nedeniyle, bozulmalar embriyonik ölümcüllükle sonuçlanan gelişimsel kusurlara yol açabilir.

Caenorhabditis elegans, mayoz, döllenme ve embriyonik gelişimi incelemek için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans, erkek ve hermafrodit olmak üzere iki cinsiyeti olan şeffaf bir nematoddur. Kendi kendine döllenme yeteneğine sahip olan C. elegans hermafroditleri, baskın cinsiyettir ^6,7. Hermafrodit gonad ilk olarak spermatheca'da depolanan dördüncü larva (L4) aşamasında sperm üretir. L4'ten yetişkinliğe geçişte, germ hattı oosit üretmeye geçer ve bunlar daha sonra depolanan sperm yoluyla döllenir. Hermafroditlerde% 0.2'den daha az bir oranda ortaya çıkan erkekler sadece sperm üretir ve hermafroditlerle çiftleşebilir. Çapraz döllenme üzerine, erkek spermi, oositlerin döllenmesinde hermafrodit spermini geride bırakır⁸. Bu, homozigot mutantların kendi kendine döllenen stoklar yoluyla nispeten kolay bir şekilde korunmasına ve genetik haçlar yoluyla genetik manipülasyonlara izin verir. İki cinsiyet, erkek ve dişi germ hatlarındaki mayoz arasındaki farkları araştıran çalışmalara izin verir. Ayrıca, C. elegans ve yumurtalarının şeffaf doğası nedeniyle, mayoz, gametogenez, döllenme ve embriyogenez süreçleri, floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak canlı, sağlam hayvanlarda incelenebilir.

C. elegans'ta mayoz, döllenme ve / veya embriyonik gelişimde rol oynayabilecek genlerdeki yeni mutasyonları analiz ederken, çok önemli bir ilk adım, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemektir, çünkü bu süreçlerdeki hatalar genellikle canlı döl üretiminde bir başarısızlığa veya azalmaya yol açar. Bu yazıda, kendi kendine döllenen hermafroditlerden veya hermafroditler ile erkekler arasındaki çaprazlardan doğurganlığı, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu klasik tahlil birçok C. elegans çalışmasında kullanılmış olsa da, kurulum ve doğru niceleme için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, çiftleşme ve soy üretimine izin vermek için bireysel solucanlar veya erkek / hermafrodit çiftleri izole edilir. Döl üretimi ve canlılığı, canlı soy ve canlı olmayan embriyoların sayısını belirlemek için bir dizi gün boyunca gözlemlenir. Deneyin sonunda, embriyonik canlılık yüzdesini ve toplam yavru boyutunu hesaplamak için bireysel yavrular analiz edilir.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.

1. Deney plakalarının hazırlanması

1. Modifiye Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) ortamı ile 35 mm çapında Petri yemekleri hazırlayın. MYOB plakaları yapmak için, 20 g Bacto agar, 2 g NaCl, 0.55 g Trizma-HCl, 0.24 g Trizma-OH, 3.1 g Bacto pepton ve 1.6 mL kolesterolü 1 L ddH₂O'ya ve 121 ° C'de 40 dakika boyunca otoklav ekleyin. 55 ° C'ye soğumaya bırakın ve steril teknik kullanarak, her 35 mm Petri kabına 4 mL erimiş ortam dökün.
   NOT: Bir litre MYOB, 6 aya kadar 4 ° C'de saklanabilen ~ 250 plaka yapar. Her suş için üç replika kümesi ile replika başına en az 10 birey öneririz.
2. Steril tekniği kullanarak, plakaları plakanın ortasında küçük bir nokta (yaklaşık 50 μL) OP50 bakterisi ile tohumlayın.
   NOT: Küçük çimler, çapraz döllenmeyi değerlendirmek için özellikle önemlidir, çünkü daha küçük nokta erkekler ve hermafroditler arasında daha fazla karşılaşmaya yol açar, böylece çiftleşme şansını arttırır.

2. Embriyonik canlılık testleri (hermafrodit kendi kendine döllenme)

1. 1. Gün
   1. Her plakanın arkasını etiketleyin. Deney boyunca her plakayı ve ilgili solucanları takip ettiğinizden emin olun.
      NOT: Tercih edilen etiketleme tekniği-Gün 1: solucan 1, Gün 1: solucan 2, ... ve saire.
   2. Her plakaya ayrı bir L4 evre hermafrodit aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Solucanların yetişkinlere dönüşmesine izin verin ve 20 ° C'lik standart kültür sıcaklığında 24 saat boyunca kendi kendine soy bırakmayın. Bu plakaları 3. günde puanlayın.
      NOT: Deneylerin sıcaklığı, sıcaklığa duyarlı mutasyonlar durumunda değiştirilebilir. Sıcaklığa duyarlı mutasyonlar için, embriyonik canlılık testleri hem izin verilen (15-16 ° C) hem de izin verilmeyen sıcaklıklarda (24-26 ° C) yapılmalıdır.
2. 2. Gün
   1. Bir dizi yeni plakayı etiketleyin-Gün 2: solucan 1, Gün 2: solucan 2, ... ve saire.
   2. 1. gün bireysel solucanları yeni plakalara aktarın.
      NOT: Bu solucanlar yetişkinliğe ulaşmış olmalı ve vahşi tip solucanlar embriyo bırakmaya çoktan başlamış olmalıdır.
   3. Solucanların 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca embriyo bırakmasına izin verin. Bu plakaları 4. günde puanlayın.
3. 3. Gün
   1. Bir dizi yeni plakayı etiketleyin. 3. Gün: Solucan 1. Gün, 3. Gün: Solucan 2, ... ve saire.
   2. 2. gün bireysel solucanları yeni plakalara aktarın. 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca soy bırakmalarına izin verin. Bu plakaları 5. günde puanlayın.
      NOT: Düşük sıcaklıklarda, kuluçka süreleri artacaktır. Buna göre ayarlayın.
   3. İnce bir işaretleyici kullanarak 35 mm'lik bir kapak üzerine bir ızgara deseni çizin. Daha önce sayılan solucanları takip etmek için ızgaralı kapağı sayım için test plakasının altına yerleştirin (Şekil 1A-B).
      1. Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, döllerin varlığı veya yokluğu için 1. gün plakalarını puanlayın. Canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayın.
         NOT: Bu noktada, herhangi bir canlı embriyonun yumurtadan çıkması gereken yeterli bir süre geçmiştir. Yumurtadan çıkmamış embriyoların öldüğü varsayılır.
      2. Tek bir kare içinde, tamamen kare içinde bulunan yumurtadan çıkmamış embriyoları ve canlı larvaları sayın (Şekil 1C-F).
      3. Kare kenarlıklarda bulunan solucanlar için, solucan kafasının konumuna göre sayın. Kafaları karenin üst ve sol kenarlarına dokunan solucanları sayın (alt veya sağ kenarlara dokunanları saymayın; Şekil 1D). Bu tahlil için döllenmemiş oositleri saymayın (Şekil 1F).
   4. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.
4. 4. Gün
   1. Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak 2. gün plakalarını puanlayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.
5. 5. Gün
   1. Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak 3. günü puanlayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Veri analizinde açıklanan yöntemi kullanarak elde edilen verileri analiz edin.
      NOT: Bazı genetik mutantlar gecikmiş veya genişlemiş üreme döngüsüne sahip olabilir. 3. gün plakalarının ötesinde embriyoların devam eden döşemesi için bireysel suşları izleyin. Embriyo üretimi 4. güne kadar durmadıysa, yetişkinleri yeni plakalara aktarmaya devam edin.

3. Embriyonik canlılık testleri (erkek / hermafrodit çapraz döllenme)

1. 1. Gün
   1. Her plakanın arkasını etiketleyin. Deney boyunca her plakayı ve ilgili solucanları takip ettiğinizden emin olun.
   2. Her plakaya ayrı bir L4 hermafrodit solucanı aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun.
      NOT: Sperm üretmeyen fog-2 fonksiyon kaybı mutantları gibi dişileştirilmiş suşlar, hermafroditlerin yerine kullanılabilir.
   3. L4 hermafrodit içeren her etiketli plakaya tek bir L4 erkek solucanı aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun.
      NOT: Plg-1 varyantı erkekler gibi suşlar, çiftleşmenin gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için kullanılabilir, çünkü bu erkekler çiftleşmeden sonra hermafrodit vulva üzerinde bir çiftleşme tıkacı biriktirir.
   4. Solucanların çiftleşmesine ve 20 ° C'de 24 saat boyunca veya başka bir uygun sıcaklıkta soy bırakmasına izin verin. Bu plakaları 3. günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için puanlayın.
2. 2. Gün
   1. Bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve yukarıdaki 2. günde olduğu gibi solucanları aktarın. Bu durumda, hem hermafroditi hem de erkeği yeni plakalara aktardığınızdan emin olun. Hermafroditin yetişkinliğe ulaştığından emin olun.
   2. Hermafroditlerin 20 ° C'de 24 saat boyunca veya başka bir uygun sıcaklıkta soy bırakmasına izin verin. Bu plakaları 4. günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için puanlayın.
3. 3. Gün
   1. Bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve yukarıdaki 3. günde olduğu gibi solucanları aktarın. Hem hermafroditi hem de erkeği yeni plakalara aktardığınızdan emin olun.
   2. 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca döl bırakmasına izin verin. Bu plakaları 5. günde canlı ve yumurtadan çıkmamış embriyolar için puanlayın.
   3. Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları 1. gün plakalarından sayın.
      NOT: 4. gün için gerekli oldukları için plakaları atmayın.
   4. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.
4. 4. Gün
   1. Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı soyu ve yumurtadan çıkmamış embriyoları 2. gün plakalarından sayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.
   2. Erkekler için gün 1 plakalarını kontrol edin. Çiftleşme meydana gelmişse, hermafroditlerin erkeklere beklenen genetik oranı 50:50 olmalıdır. 1. gün plakaları herhangi bir erkek içermiyorsa, erkek ve hermafrodit arasında çiftleşme meydana gelmemiştir. Bu çiftleşme çiftini atın ve bu gözlemi laboratuvar defterine kaydedin.
5. 5. Gün
   1. Canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları, adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, 3. gün plakalarından sayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Veri analizinde açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen verileri analiz edin.

4. Veri analizi

1. Denklemi kullanarak bir suşun belirli bir biyolojik kopyasının embriyonik canlılık yüzdesini hesaplayın (1).
   NOT: Canlı soy ve yumurtadan çıkmamış embriyo sayıları, deney dönemi boyunca günlük sayımın toplamı ile elde edilir.
   (1)
2. Ana hermafrodit tarafından üretilen döl sayısını (yumurtadan çıkmamış embriyolar ve larvalar) toplayarak belirli bir suşun solucanı başına yavru boyutunu hesaplayın. Denklemi kullanarak ortalama yavru boyutunu hesaplayın (2).
   (2)
3. Embriyonik canlılık yüzdesini ve ortalama yavru büyüklüğünü, biyolojik replikalar arasındaki ortalama ve standart sapma ile raporlayın. Kontrol ve deneysel verileri karşılaştıran Student'ın t-testini gerçekleştirin.

Representative Results

N2 (vahşi tip) ve mayozda rol oynayan genlerde mutasyon barındıran iki suş, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) üzerinde embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri yaptık. Hem him-5 hem de spo-11 mayotik çaprazlama oluşumunda rol oynadığından, bu iki gendeki mutasyonlar anöploid gametlerin oluşumuna neden olur. N2 için yapılan bu embriyonik canlılık testi, %98,9'luk bir canlılık yüzdesi sağlarken, hem him-5(e1490) hem de spo-11(ok79), sırasıyla %74,9 ve %0,8'lik bir yüzdeyle soy canlılığında bir azalma göstermiştir (Şekil 2A; p < 0.0005). Bu sonuçlar daha önce yayınlanmış sonuçlarla tutarlıdır ^7,9. Ortalama yavru büyüklüğü N2, him-5(e1490) ve spo-11(ok79) sırasıyla 217, 105 ve 219 olarak belirlenmiştir (Şekil 2B). Önceki yayınlarla tutarlı olarak, him-5 (e1490) vahşi tipe kıyasla önemli ölçüde azaltılmış bir yavru boyutuna sahipken, spo-11 (ok79) ^7,9 değildir.

Şekil 1: Plakalar üzerinde sayım düzeneğinin ve embriyo morfolojisinin gösterilmesi . (A) İnce bir keskinlik kullanılarak çizilmiş çapraz taranmış ızgara desenli bir kapağın görüntüsü. (B) Sayım için altında desenli kapağı olan 35 mm'lik bir MYOB plakası. (C) Izgaranın birden fazla kutusunu gösteren düşük büyütmeli (10x) görüş alanını gösteren görüntü. Beyaz ok uçları bu görüş alanındaki birkaç larvaya işaret eder. Sayım, hem larvaları hem de embriyoları gözlemlemek için daha yüksek bir büyütmede (alanda sadece bir kare) yapılmalıdır. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. (D) 35 mm'lik bir plakanın altına yerleştirilmiş ızgara desenli kapağın karikatürü. İç kısım, belirli bir karede hangi larvaların sayıldığını belirlemek için uygun tekniği gösterir. Yukarıdan aşağıya, soldan sağa sayın. Tamamen meydanın içinde olan solucanları sayın. Sınıra dokunan solucanlar, kuyruğun değil, solucan başının konumuna göre sayılmalıdır. Geçerli ızgaraya bakan solucanları veya daha önce sayılan ızgaraları (yani, üst ve sol kenarları) sayın. Kafaları alt veya sağ kenarlara değen solucanları saymayın. Girişten itibaren mavi solucanlar sayılırken, kırmızı solucanlar sayılmayacaktır. (E) Sağlıklı N2 L1 yumurtadan çıkmış larvaların temsili görüntüsü (beyaz ok ucu). (F) Döllenmemiş bir oositin (siyah ok ucu) ve yumurtadan çıkmamış bir embriyonun (kırmızı ok ucu) temsili görüntüsü. Döllenmemiş oositler bu tahlil için sayılmamalıdır. Ölçek çubukları (E,F) = (100 μm). Not: C, E ve F'deki görüntüler, solucan plakaları üzerindeki larvaların, embriyoların ve oositlerin görünümünü göstermek amacıyla takılı bir kamera ile bir Zeiss AxioZoom mikroskobu ile çekilmiştir. Embriyonik canlılık testleri için, plakaları bir stereomikroskop (kamera olmadan) kullanarak gözlemlerken sayımlar yapılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Embriyonik canlılık tahlillerinden ve yavru boyutlarından elde edilen sonuçları gösteren temsili grafikler. (A) 20 °C'de N2, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) embriyonik canlılık yüzdesi. (B) 20 °C'de N2, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) yavru boyutları . Her suş için en az 28 hermafroditin soyu puanlandı. Toplam yumurtadan çıkmamış embriyo sayısı artı atılan larva sayısı N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2.945 ve spo-11 (ok79) = 7.230 idi. Hata çubukları, üç ayrı çoğaltmadaki standart sapmayı gösterir. İstatistikler Student's t-testi kullanılarak hesaplanmıştır, n.s. = not meaning, *p < 0.0005. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Cinsel olarak üreyen türlerin çoğalması, mayoz yoluyla haploid gametlerin (yani yumurta ve sperm) oluşumunu gerektirir, bunlar daha sonra döllenmede birleştirilir, diploid kromozom sayısını geri kazandırır ve embriyonik gelişimi başlatır. Bu süreçlerden herhangi birindeki hatalar kısırlığa, embriyonik ölümcüllüğe ve / veya doğum kusurlarına yol açabilir. C. elegans, cinsel üremeyi incelemek için güçlü bir model sistemdir. Gen mutasyonlarının veya gen ekspresyonunun nakavtının (örneğin, RNA girişimi) etkileri, yukarıda açıklanan embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri kullanılarak nispeten hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilebilir. Bu yöntemleri, mayotik kromozom ayrışması ve döllenme/yumurta aktivasyonu^10,11,12 ile ilgili genlerin ilk karakterizasyonu için kullandık. Embriyonik canlılıkta veya yavru boyutunda gözlenen bir azalma, mayoz, gametogenez, döllenme veya embriyogenezde bir bozulma olduğunu gösterir.

Embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma, soy sayımı ve basit bir matematiksel hesaplama yoluyla nispeten kolay bir şekilde değerlendirildiğinden, bunlar laboratuvarda veya sınıfta araştırma acemileri için en uygun giriş deneyleridir. C. elegans yetiştiriciliğinin kolaylığı ve ekonomik avantajları, onları deneysel biyoloji dersleri için özellikle uygun hale getirmektedir. Öğrenciler C. elegans hayvancılığı yoluyla değerli araştırma deneyimi kazanırlar, diseksiyon mikroskoplarını kullanmayı öğrenirler ve gelişimsel bir sistemde nispeten kısa sürede (bu makalede açıklanan protokolle yaklaşık 5 gün) cevaplanabilecek biyolojik sorular sorabilirler.

Embriyonik canlılık testleri için soy sayımlarının zamanlaması çok önemlidir. 20 ° C'de, embriyogenez yaklaşık 16 saat sürer ve üreme açısından olgun yetişkinler, L1 larvaları olarak yumurtadan çıktıktan yaklaşık 60 saat sonra yumurta bırakmaya başlar. Yaşam döngüsü hızlı olduğu için, embriyoların yumurtadan çıkması için yeterli zamana izin veren, ancak döllerin kendileri yumurta bırakmaya başlamadan önce uygun pencerede dölleri saymak önemlidir. Büyüme dönemlerinin sıcaklığa bağlı olarak değiştiğini de belirtmek önemlidir. Büyüme, 24-25 °C'de 15-16 °C'den yaklaşık 2,1 kat daha hızlıdır ve 20 °C'de 15-16^°C'den yaklaşık 1,3 kat daha hızlıdır. Bu protokolde, yetişkinler taze bir tabağa yerleştirildikten 48 saat sonra sayımların yapılmasını öneririz. Bu zaman dilimi, vahşi tip gelişime sahip tüm embriyoların yumurtadan çıkmak için yeterli zamana (>16 saat) sahip olmasını, ancak üreme kabiliyeti noktasına kadar yaşlanmamasını sağlar. 20 ° C'den düşük sıcaklıklarda yapılan testlerin, embriyoların yumurtadan çıkması ve yumurtadan çıkan döllerin MYOB plakalarındaki bakteriler arasında gözlemlenmesi daha kolay olan larva aşamalarına (L3-L4 aşamaları) ulaşması için uzatılması (4 gün boyunca hayvanları transfer etmek) gerekebilir.

Embriyonik canlılık tahlilleri ve yavru boyutlandırma ile ilgili bir sınırlama, bozulan spesifik gelişimsel sürecin kolayca belirgin olmamasıdır. Bununla birlikte, bu ilk tahliller, hangi sürecin etkilendiğini belirlemek için sitolojik tekniklerle takip edilebilir. Örneğin, gonadı serbest bırakmak için yetişkin solucanların diseksiyonu, ardından 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyaması ve germ hattı içindeki DNA morfolojisinin dikkatli bir şekilde analiz edilmesi, mayotik süreçlerin bozulup bozulmadığını ortaya çıkarabilir. Ek olarak, embriyoların DAPI boyaması, embriyogenezin hangi aşamada durduğunu ortaya çıkarabilir.

Sonuç olarak, üretilen embriyo sayısını (yavru) ve çeşitli C. elegans mutantları için uygun embriyoların yüzdesini belirlemek için bir protokol tanımladık. Bu tahlil hem kendi kendine döllenen hermafroditler hem de erkek / hermafrodit haçları için kullanılabilir. C. elegans'ın kısa yaşam döngüsü ile bu protokol 1 haftadan daha kısa sürede tamamlanabilir. Embriyonik canlılık testleri ve yavru boyutları, mayoz, döllenme veya embriyonik gelişimde rol oynayan genlerin ilk analizleri olarak kullanılabilir ve daha gelişmiş araştırmacılar ve araştırma acemileri (lisans ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri) için uygun protokollerdir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.