Summary
En egnet dyremodell er nødvendig for å forstå de patologiske mekanismene som ligger til grunn for aortaklaffstenose (AVS) og for å evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner. Denne protokollen beskriver en ny prosedyre for utvikling av AVS-kaninmodellen via en direkte ballongskade in vivo.
Abstract
Dyremodeller fremstår som et viktig verktøy for å forstå de patologiske mekanismene som ligger til grunn for aortaklaffstenose (AVS) på grunn av mangel på tilgang til pålitelige kilder til syke humane aortaklaffer. Blant de forskjellige dyremodellene er AVS kaninmodeller en av de mest brukte i store dyreforsøk. Imidlertid krever tradisjonelle AVS-kaninmodeller en langsiktig periode med kosttilskudd og genetisk manipulasjon for å indusere signifikant stenose i aortaklaffen, noe som begrenser bruken i eksperimentelle studier. For å løse disse begrensningene foreslås en ny AVS-kaninmodell, der stenose induseres av en direkte ballongskade på aortaklaffen. Den nåværende protokollen beskriver en vellykket teknikk for å indusere AVS hos New Zealand hvite (NZW) kaniner, med trinnvise prosedyrer for forberedelse, kirurgisk prosedyre og postoperativ behandling. Denne enkle og reproduserbare modellen gir en lovende tilnærming for å studere initiering og progresjon av AVS og gir et verdifullt verktøy for å undersøke de underliggende patologiske mekanismene til sykdommen.
Introduction
Det er i økende grad anerkjent at bruk av egnede dyremodeller kan bidra til en bedre forståelse av de patologiske mekanismene som ligger til grunn for aortaklaffstenose (AVS) på grunn av manglende tilgang til pålitelige kilder til syke humane aortaklaffer assosiert med progresjon av aortastenose (AS). Blant de ulike dyremodellene for å studere AVS er kaniner en av de mest brukte AVS-modellene for store dyr, og AVS-kaninmodellen induseres enten gjennom kolesterol/vitamin D2-tilskudd eller genetisk manipulasjon 1,2,3,4.
Selv om kanin AVS-modeller har gitt betydelig innsikt i utviklingen og progresjonen av AVS, er det fortsatt utfordrende å indusere AVS konsekvent og reproduserbart, som sett i våre foreløpige eksperimenter.
I tillegg til diettinduserte og genetisk følsomme dyremodeller, er det etablert en ny modell av AVS gjennom direkte mekanisk skade hos mus 5,6. Den mekaniske skademodellen induserer vellykket aortastenose og representerer en enkel og reproduserbar AVS-modell i villtypemus. Så vidt vi vet, har det ikke vært noen tidligere studier som undersøker effekten av en mekanisk skade på aortaklaffen i kaninmodeller. Dermed gir denne studien en ny prosedyre for å indusere AVS hos mannlige New Zealand hvite kaniner gjennom en direkte ballongskade på aortaklaffen, som nøyaktig kan etterligne tilstanden til valvulær aortastenose. Denne protokollen inkluderer trinnvise beskrivelser av preparatet, den kirurgiske prosedyren og den postoperative behandlingen, som er nyttige for å indusere reproduserbare AVS-kaninmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøksprosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med dyrevelferdsloven, veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr, og retningslinjene og retningslinjene for dyreforsøk gitt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved College of Medicine ved The Catholic University of Korea (godkjenningsnummer: CUMC-2021-0176-05). Denne studien benyttet 3 måneder gamle mannlige New Zealand hvite (NZW) kaniner som veide 3,5-4,0 kg, som ble opprettholdt under standardforhold i individuelle bur. Kaninene ble fôret med enten et normalt kosthold eller en 0,5 % kolesterolberiket diett supplert med 50 000 E vitamin D2 (se materialfortegnelse). De eksperimentelle design- og analysemetodene for induksjon av AVS-kaninmodellen er avbildet i figur 1.
1. Forberedelse for operasjonen
- Sørg for at alle medisinske og kirurgiske instrumenter (se materialfortegnelse) er sterilisert i begynnelsen av operasjonen.
- Forbered dilatasjonsballongkatetersettet ved å følge trinnene nedenfor.
- Koble in-deflasjonsenheten fylt med en blanding av saltvann og kommersielt tilgjengelig kontrastmiddel (1:1) til luerlåsdelen av ballongkateteret (se materialfortegnelse).
- Fyll ballongen med oppblåsingsløsning, og fjern eventuell luft fra ballongkateteret.
MERK: For denne studien besto inflasjonsløsningen av 30% jodixanol med 0,9% saltvann (se materialfortegnelse). - Bekreft riktig ballonginflasjon ved å rense ballonglumen med inflasjonsløsningen.
2. Kirurgisk prosedyre for aortaklaffskade
- Administrer en intramuskulær injeksjon av tiletamin & zolazepam (15 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg) (se materialfortegnelse) for å bedøve dyret.
MERK: Før anestesien ble administrert, ble kaninene forhåndsbehandlet med en subkutan glykopyrrolatinjeksjon (0,05 mg/kg) som et antikolinergt preanestetisk middel. Anestesinivået ble bestemt ut fra en kombinasjon av kriterier, blant annet manglende respons på tåklemme og jevn respirasjonsfrekvens. - Sett inn et 24 G intravenøst (IV) kateter i den marginale ørevenen, og koble et infusjonssett med heparinisert saltvann (100 E / kg heparin).
- Koble kaninen med en multiparameter veterinærmonitor (se materialfortegnelse) for kontinuerlig å overvåke vitale tegn, for eksempel oksygenmetningssignalet (SpO2), temperatur og blodtrykk.
MERK: For SpO 2-overvåking, fest SpO2-sensoren til kaninens tunge. For temperaturovervåking, sett sonden inn i kaninens endetarm. For blodtrykksovervåking, plasser mansjetten på forbenet. - Plasser kaninen i liggende stilling på et operasjonsbord utstyrt med en C-arm fluoroskopi (se materialfortegnelse), og fjern håret fra det ventrale nakkeområdet ved hjelp av dyrehårklippere (figur 2A).
- Steriliser snittområdet med jod, og dekk kaninen med kirurgiske håndklær.
- Plasser kaninens hjerte i midten av bildet av C-armen.
MERK: Alle forskere må bruke verneutstyr med vedlagte termoluminescerende dosimetre (TLD) for å redusere strålingseksponering mens de utfører C-armstyrt kirurgi.- Slå på C-armen, og velg fluoroskopisk modus for hjerteavbildning.
- Juster kaninens posisjon for å sikre at hjertet er i midten av bildefeltet.
- Lag et langsgående snitt på ca. 3 cm i nakkehuden, og bruk kirurgisk saks til å kutte fascia og fettvev.
- Eksponer venstre arteria carotis communis (LCCA) ved å separere musklene forsiktig inntil ca. 3-3,5 cm av LCCA er eksponert (figur 2B).
- Ligate LCCA med en 3-0 silke sutur (se tabell over materialer) på toppen og enden av den eksponerte LCCA for å stoppe blodstrømmen.
- Sett inn et 22 G IV kateter i LCCA, og innfør en ledetråd (0,016 tommer, se materialtabell) inn i venstre ventrikkel (LV) gjennom IV-kateteret, og sørg for at spissen av kateteret er riktig plassert i avbildningsfeltet til C-armen.
MERK: Når du setter inn IV-kateteret, løsner du forsiktig ligatursuturen på vei ned til aortaklaffen for å tillate fremdrift av kateteret. - Trekk ut IV-kateteret, forlater styretråden, og plasser en 4-F-kappe (se materialfortegnelse) over føringstråden i LCCA for å introdusere ballongkateteret (figur 2C).
MERK: Etter å ha erstattet IV-kateteret med kappen, bør all fanget luft fjernes fra kappeenheten. - Sett 8 mm ballongkateteret forsiktig over føringstråden inn i aortaklaffen under fluoroskopisk veiledning med C-arm (figur 2D).
- Plasser ballongkateterspissen ca. 1-2 cm distalt for aortaklaffen, og blås opp ballongen ved å rense oppblåsingsløsningen med en trykkoppblåser ved 6 atm.
- Før ballongen inn i LV-toppunktet, og trekk den tilbake i LV-uttaket. Gjenta denne prosedyren fem ganger, og slipp deretter ballongen ut av luften (figur 2E, F).
- Gjenta trinn 2,8-2,9 tre ganger for å sikre tilstrekkelig ventilskade.
- Trekk ut ballongkateteret og føringstråden. Fjern langsomt kappen fra LCCA, og bind umiddelbart LCCA med suturen på vei ned til aortaklaffen.
- Rengjør snittområdet med saltvann for å fjerne blodproppene, og inspiser det punkterte stedet for arteriell blødning.
- Lukk muskel og hud med en 3-0 ikke-absorberbar sutur, og steriliser alle sider av såret med jod.
3. Postoperativ behandling
- Fjern overvåkingsplaster og klips, og hold kaninen i en intensiv omsorgsinkubator.
MERK: Etter operasjonen ble kaninene nøye observert i 1 dag i en intensiv omsorgsinkubator og deretter flyttet til et hjemmebur. - Behandle postoperativ smerte med 5 mg/kg tramadol og 3 mg/kg ketoprofen og gi antibiotika (4 mg/kg gentamicin) to ganger daglig i 3 dager via subkutan injeksjon (se materialfortegnelse).
MERK: Postoperativ smertebehandling bør følge veterinære og IACUC retningslinjer (f.eks. opioid, NSAID, lokalbedøvelse eller kombinasjon). - Gi et 0,5% kolesterolberiket kosthold med 50 000 E vitamin D2 (HC + VitD2) i 8 uker.
4. Ekkokardiografi
- Etter 8 uker med ballongskade, bedøv kaninen ved å bruke samme prosedyre som beskrevet i trinn 2.1.
- Visualiser aortaklaffene ved hjelp av todimensjonale transtorakale visninger, og ta M-mode-bilder i kortakse- og langaksevisninger.
- Plasser kaninen i en liggende stilling på et ekkobord.
- Barber brystområdet med klippemaskiner og hårfjerningskrem.
- Påfør ultralydtransdusergel (se materialfortegnelse) på brystet.
- Juster svingeren for å få den parasternale langaksevisningen og den parasternale kortaksevisningen av aortaklaffen.
- Bruk M-mode imaging til å ta bilder av aortaklaffen i både langakse og kortaksevisning, og lagre bildene for senere analyse.
5. Histologisk analyse
- Etter ekkokardiografien avlives kaninen ved å administrere en intravenøs injeksjon av kaliumklorid (KCl, 3 g / 20 ml, 1 ml).
- Åpne brysthulen, høst hjertet med den stigende aorta7, og legg den på is i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Senk hjertet umiddelbart i en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning, og legg det inn i en parafinblokk (se materialtabellen).
- Skjær den parafininnebygde hjerteblokken i 4 μm tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotom, og flekk seksjonene med Massons trichrome (MT), Alizarin Red og von Kossa (se materialtabell) for å vurdere kollagenavsetning og ventilforkalkning, henholdsvis 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kanin AVS modell indusert av aortaklaffskade
For å indusere kanin AVS-modellen ble mannlige NZW-kaniner som veide 3,5-4,0 kg brukt til denne studien. I henhold til de kirurgiske prosedyrene beskrevet i trinn 2 (figur 2) ble AVS-modellen etablert ved aortaklaffskade, som resulterte i mekanisk aortaklaffdegenerasjon og forkalkning. Kontrollgruppen inkluderte kaniner fôret med et 0,5% kolesterolberiket kosthold (høyt kolesterol, HC) og 50.000 U vitamin D2 (VitD2), som er kjent som diettindusert AVS-modell.
Vurdering av aortaklaffen
For å vurdere strukturelle endringer i aortaklaffen ble brosjyrens mobilitet og tykkelse evaluert ved hjelp av ekkokardiografiske kortakse- og langaksevisninger. 8 uker etter aortaklaffskaden viste ekkokardiografien at cusps var fortykket og bevegelsen begrenset hos skadde kaniner fôret med HC + VitD2 diett sammenlignet med kontrollkaninene, inkludert villtype (WT) kaniner og kaninene fôret med HC + VitD2 diett uten ventilskade (figur 3).
Histologisk analyse
For å vurdere de histologiske forandringene i aortaklaffen ble kaninene ofret 8 uker etter aortaklaffskaden, og histologisk analyse ble utført med de utskårne hjertene (figur 4). Som vist i figur 4A viste aortaklaffen farget med Massons trichrome (MT) økt tykkelse på aortaklaffcuspene i den skadde gruppen sammenlignet med WT og HC + VitD2 diettinduserte grupper. For å sammenligne graden av valvulære kalkavleiringer ble det i tillegg utført Alizarin Red-farging og von Kossa-farging, som vist i figur 4B,C. Mens HC + VitD2 diettindusert gruppe viste ubetydelige kalkavleiringer i valvulære brosjyrer, ble det observert signifikante kalkavleiringer i den ballongskadede gruppen.
Figur 1: Skjema for den eksperimentelle tidslinjen. En kaninmodell av aortaklaffstenose ble etablert ved direkte ballongskade på aortaklaffen hos hvite hannkaniner (3,5-4,0 kg), etterfulgt av en høykolesterol/vitamin D2-diett (0,5 % kolesterolberiket diett + 50 000 U vitamin D2; HC + VitD2) i 8 uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over operasjonsprosedyren. (A) Under anestesi ble kaninen plassert i liggende stilling på operasjonsbordet. (B) Venstre arteria carotis communis (LCCA) ble eksponert ved forsiktig separering av hud og muskler. (C) 4-F-kappen og ledningstråden ble satt inn i LCCA. Rød pil: skjede; Gul pil: ledetråd. (D) Ballongkateteret ble ført over ledetråden inn i aortaklaffen. Rød pil: ballongkateter. (E,F) Ballongkateteret ble oppblåst og avansert/trukket tilbake mellom venstre ventrikkelapex og utløp under C-arm fluoroskopisk veiledning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Ekkokardiografisk analyse av aortaklaffstenose. Representative bilder av langakse (øvre paneler) og kortakse (midtpaneler) visninger i ekkokardiogrammet og et skjematisk diagram over grad av valvulær stenose (nedre paneler) i gruppene WT (n = 3), HC + VitD2-diett (n = 3) og HC + VitD2 diett med klaffeskade (n = 3). Stiplet sirkel: aortaklaff; Rød pilspiss: fortykkede brosjyrer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologisk analyse av aortaklaffene. Representative bilder av (A) Massons trichrome, (B) Alizarin Red og (C) von Kossa-farging i WT, HC + VitD2-dietten og HC + VitD2-dietten med ventilskadegrupper. Blå pilspiss: fortykkede brosjyrer; Rød pilspiss: Forkalkede brosjyrer. Skalastenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Animal AVS-modeller brukes ofte til å studere de patologiske aspektene ved AVS, inkludert initiering og progresjon av AVS. Denne protokollen introduserer en ny kanin AVS-modell indusert av en direkte ballongskade på aortaklaffen. I denne studien viste aortaklaffskademodellen signifikant brosjyrefortykkelse og forkalkning. Sammenlignet med den milde AVS-modellen indusert av kosttilskudd, ble aortaklaffen i modellen for direkte ballongskade selektivt skadet, noe som førte til fortykkede cusps og begrenset bevegelse, samt fortykkede og forkalkede brosjyrer. Disse resultatene stemmer overens med de generelle egenskapene til AVS10,11.
De vanlige AVS-kaninmodellene indusert av kosttilskudd og genetisk manipulasjon har flere begrensninger i eksperimentelle studier12,13,14. Utviklingen av signifikant stenose i kaninmodeller krever ofte en lengre fôringsperiode enn hos mus, noe som kan forårsake betydelig betennelse og levertoksisitet. I tillegg induserer kosttilskudd, som med hyperkolesterolemiske dietter og VitD2, i disse modellene ikke alltid konsistent og signifikant valvulær stenose. Til sammenligning kan den direkte ballongskaden beskrevet i denne protokollen forårsake mekanisk skade på de opererte aortaklaffbrosjyrene, og derved spesifikt indusere en reproduserbar remodelleringsrespons. Videre tillater denne protokollen manipulering av alvorlighetsgraden av AVS ved å justere skadeintensiteten. Så vidt vi vet, er dette første gang effekten av mekanisk skade på aortaklaffen i kaninmodeller er validert in vivo.
Til tross for disse fordelene har denne protokollen begrensninger i å indusere konsistente og reproduserbare AVS-modeller. For det første krever den kirurgiske prosedyren mye kirurgisk erfaring med dyremodeller. For det andre er det nødvendig å etablere detaljerte forhold for å optimalisere AVS-alvorlighetsgraden, for eksempel når det gjelder skadeintensitet og varighet av kosttilskudd. For det tredje er denne protokollen begrenset i sin evne til å gi informasjon om effekten av ballongskaden alene på aortaklaffstenose, da denne studien bare undersøkte effekten av ballongskade i kombinasjon med et kolesterolberiket kosthold. Å inkludere en gruppe som får ballongskaden uten et kolesterolberiket kosthold, vil være informativt, og vi vil vurdere det for fremtidige studier. Likevel demonstrerer dette arbeidet en ny protokoll for direkte ballongskade på aortaklaffen i kaninmodellen, som er nyttig for å studere de patologiske mekanismene som ligger til grunn for AVS og potensielt kan brukes til å utvikle terapeutiske alternativer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi med dette verket.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT) (nr. 2020R1A4A3079570), utdanningsdepartementet (nr. 2021R1I1A1A01051425) og Industrial Strategic Technology Development Program (nr. 20014873) finansiert av departementet for handel, industri og energi, Sør-Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580 (2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al.
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
