Summary
En lämplig djurmodell behövs för att förstå de patologiska mekanismerna bakom aortastenos (AVS) och för att utvärdera effekten av terapeutiska interventioner. Det nuvarande protokollet beskriver en ny procedur för att utveckla AVS-kaninmodellen via en direkt ballongskada in vivo.
Abstract
Djurmodeller växer fram som ett viktigt verktyg för att förstå de patologiska mekanismerna bakom aortaklaffstenos (AVS) på grund av bristen på tillgång till tillförlitliga källor till sjuka mänskliga aortaklaffar. Bland de olika djurmodellerna är AVS-kaninmodeller en av de vanligaste i stordjursstudier. Traditionella AVS-kaninmodeller kräver dock en långvarig period av kosttillskott och genetisk manipulation för att inducera betydande stenos i aortaklaffen, vilket begränsar deras användning i experimentella studier. För att ta itu med dessa begränsningar föreslås en ny AVS-kaninmodell, där stenos induceras av en direkt ballongskada på aortaklaffen. Det nuvarande protokollet beskriver en framgångsrik teknik för att inducera AVS hos nyzeeländska vita (NZW) kaniner, med steg-för-steg-procedurer för förberedelse, kirurgiskt ingrepp och postoperativ vård. Denna enkla och reproducerbara modell erbjuder ett lovande tillvägagångssätt för att studera initiering och progression av AVS och ger ett värdefullt verktyg för att undersöka de underliggande patologiska mekanismerna för sjukdomen.
Introduction
Det blir alltmer erkänt att användningen av lämpliga djurmodeller kan bidra till en bättre förståelse av de patologiska mekanismerna bakom aortastenos (AVS) på grund av bristen på tillgång till tillförlitliga källor till sjuka mänskliga aortaklaffar i samband med progressionen av aortastenos (AS). Bland de olika djurmodellerna för att studera AVS är kaniner en av de mest använda AVS-modellerna för stordjur, och AVS-kaninmodellen induceras antingen genom kolesterol/vitamin D2-tillskott eller genetisk manipulation 1,2,3,4.
Även om AVS-modeller på kanin har gett betydande insikter i utvecklingen och progressionen av AVS, är det fortfarande utmanande att inducera AVS konsekvent och reproducerbart, vilket vi sett i våra preliminära experiment.
Förutom dietinducerade och genetiskt mottagliga djurmodeller har en ny modell av AVS etablerats genom direkt mekanisk skada i möss 5,6. Den mekaniska skademodellen inducerar framgångsrikt aortastenos och representerar en enkel och reproducerbar AVS-modell i vildtypsmöss. Så vitt vi vet har det inte gjorts några tidigare studier som undersökt effekterna av en mekanisk skada på aortaklaffen i kaninmodeller. Således ger denna studie en ny procedur för att inducera AVS hos vita kaniner av hankön i Nya Zeeland genom en direkt ballongskada på aortaklaffen, vilket exakt kan efterlikna tillståndet vid klaffaortastenos. Detta protokoll innehåller steg-för-steg-beskrivningar av förberedelserna, det kirurgiska ingreppet och den postoperativa vården, som är användbara för att inducera reproducerbara AVS-kaninmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsöksprocedurer godkändes och utfördes i enlighet med Laboratory Animals Welfare Act, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och Guidelines and Policies for Animal Experiments som tillhandahålls av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid College of Medicine of The Catholic University of Korea (godkännandenummer: CUMC-2021-0176-05). I den aktuella studien användes 3 månader gamla hankaniner från Nya Zeeland (NZW) som vägde 3,5-4,0 kg, som hölls under standardförhållanden i individuella burar. Kaninerna utfodrades antingen med en normal kost eller en 0,5 % kolesterolberikad kost kompletterad med 50 000 U vitamin D2 (se materialförteckning). De experimentella design- och analysmetoderna för induktion av AVS-kaninmodellen visas i figur 1.
1. Förberedelser inför operationen
- Se till att alla medicinska och kirurgiska instrument (se materialförteckning) är steriliserade i början av operationen.
- Förbered setet med ballongkatetern genom att följa stegen nedan.
- Anslut tömningsanordningen fylld med en blandning av koksaltlösning och kommersiellt tillgängligt kontrastmedel (1:1) till luerlockdelen av ballongkatetern (se materialförteckning).
- Fyll ballongen med uppblåsningslösning och ta bort eventuell luft från ballongkatetern.
OBS: För den aktuella studien bestod uppblåsningslösningen av 30 % jodixanol med 0,9 % saltlösning (se Materialförteckning). - Kontrollera att ballongen är korrekt uppblåst genom att rensa ballonglumen med uppblåsningslösningen.
2. Kirurgiskt ingrepp för aortaklaffskada
- Administrera en intramuskulär injektion av tiletamin och zolazepam (15 mg/kg) och xylazin (5 mg/kg) (se materialförteckning) för att bedöva djuret.
OBS: Före administrering av anestesi förbehandlades kaninerna med en subkutan glykopyrrolatinjektion (0,05 mg/kg) som ett antikolinergt medel före anestesi. Den adekvata anestesinivån bestämdes av en kombination av kriterier, inklusive ett uteblivet svar på ett nyp i tån och en jämn andningsfrekvens. - För in en 24 G intravenös (IV) kateter i den marginella öronvenen och anslut ett infusionsset med hepariniserad koksaltlösning (100 E/kg heparin).
- Anslut kaninen till en veterinärmonitor med flera parametrar (se materialtabell) för att kontinuerligt övervaka de vitala tecknen, såsom syremättnadssignalen (SpO2), temperatur och blodtryck.
OBS: För SpO 2-övervakningen, fäst SpO2-sensorn på kaninens tunga. För temperaturövervakningen, för in sonden i kaninens ändtarm. För blodtrycksövervakning, placera manschetten på frambenet. - Placera kaninen på rygg på ett operationsbord utrustat med en C-armsfluoroskopi (se materialförteckning) och ta bort håret från det ventrala halsområdet med hjälp av en hårklippare (Figur 2A).
- Sterilisera snittområdet med jod och täck kaninen med kirurgiska handdukar.
- Placera kaninens hjärta i mitten av bilden av C-armen.
OBS: Alla forskare måste bära skyddsutrustning med bifogade termoluminescerande dosimetrar (TLD) för att minska strålningsexponeringen när de utför den C-armsstyrda operationen.- Slå på C-armen och välj det fluoroskopiska läget för hjärtavbildning.
- Justera kaninens position för att säkerställa att hjärtat är i mitten av bildfältet.
- Gör ett längsgående snitt på cirka 3 cm i huden på halsen och använd en kirurgisk sax för att klippa fascian och fettvävnaden.
- Exponera den vänstra gemensamma halspulsådern (LCCA) genom att försiktigt separera musklerna tills cirka 3-3,5 cm av LCCA är exponerad (Figur 2B).
- Ligate LCCA med en 3-0 silkessutur (se Materialtabell) i toppen och änden av den exponerade LCCA för att stoppa blodflödet.
- För in en 22 G IV-kateter i LCCA och för in en ledare (0,016 tum, se materialtabell) i vänster kammare (LV) genom IV-katetern, och se till att kateterns spets är korrekt placerad i C-bågens bildfält.
OBS: När du för in IV-katetern, lossa försiktigt ligatursuturen på väg ner till aortaklaffen för att möjliggöra frammatning av katetern. - Dra ut IV-katetern, lämna ledaren och placera en 4-F-hylsa (se materialtabell) över ledaren i LCCA för att föra in ballongkatetern (Figur 2C).
OBS: Efter att ha bytt ut IV-katetern mot hylsan ska eventuell instängd luft avlägsnas från hylsanordningen. - För försiktigt in 8 mm ballongkatetern över ledaren i aortaklaffen under C-armens fluoroskopiska styrning (Figur 2D).
- Placera ballongkateterns spets cirka 1-2 cm distalt om aortaklaffen och blås upp ballongen genom att tömma uppblåsningslösningen med en tryckpump vid 6 atm.
- För in ballongen i LV-spetsen och dra tillbaka den i LV-uttaget. Upprepa denna procedur fem gånger och töm sedan ballongen på luft (Figur 2E, F).
- Upprepa steg 2.8-2.9 tre gånger för att säkerställa tillräcklig ventilskada.
- Dra ut ballongkatetern och ledaren. Ta långsamt bort hylsan från LCCA och knyt omedelbart LCCA med suturen på väg ner till aortaklaffen.
- Rengör snittområdet med koksaltlösning för att ta bort blodpropparna och inspektera det punkterade stället för arteriell blödning.
- Stäng muskeln och huden med en 3-0 icke-absorberbar sutur och sterilisera alla sidor av såret med jod.
3. Postoperativ vård
- Ta bort övervakningsplåster och klämmor och förvara kaninen i en intensivvårdskuvös.
OBS: Efter operationen observerades kaninerna noggrant under 1 dag i en intensivvårdskuvös och flyttades sedan till en hembur. - Hantera postoperativ smärta med 5 mg/kg tramadol och 3 mg/kg ketoprofen och administrera antibiotika (4 mg/kg gentamicin) två gånger dagligen i 3 dagar via subkutan injektion (se Materialförteckning).
OBS: Postoperativ smärtbehandling bör följa veterinära och IACUC:s riktlinjer (t.ex. opioid, NSAID, lokalbedövning eller kombination). - Ge en 0,5 % kolesterolberikad kost med 50 000 U vitamin D2 (HC + VitD2) i 8 veckor.
4. Ekokardiografi
- Efter 8 veckors ballongskada, söva kaninen med samma procedur som beskrivs i steg 2.1.
- Visualisera aortaklaffarna med hjälp av tvådimensionella transthoraxvyer och spela in M-lägesbilder i kortaxliga och långaxliga vyer.
- Placera kaninen på rygg på ett ekobord.
- Raka bröstområdet med hjälp av en klippare och hårborttagningskräm.
- Applicera ultraljudsgivargel (se materialförteckning) på bröstet.
- Justera givaren för att få den parasternala långaxeln view och den parasternala kortaxeln view av aortaklaffen.
- Använd M-lägesavbildning för att ta bilder av aortaklaffen i både långaxliga och kortaxliga vyer och spara bilderna för senare analys.
5. Histologisk analys
- Efter ekokardiografin avlivas kaninen genom intravenös injektion av kaliumklorid (KCl, 3 g/20 ml, 1 ml).
- Öppna brösthålan, skörda hjärtat med den uppåtgående aortan7 och lägg det på is i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Sänk omedelbart ner hjärtat i en 4% paraformaldehydlösning (PFA) och bädda in den i ett paraffinblock (se Materialförteckning).
- Skär det paraffininbäddade hjärtblocket i 4 μm tjocka sektioner med hjälp av en mikrotom och färga sektionerna med Massons trikrom (MT), Alizarin Red och von Kossa (se Materialtabell) för att bedöma kollagendepositionen respektive klaffförkalkningen 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kanin AVS-modell inducerad av aortaklaffskada
För att inducera kaninens AVS-modell användes hankaniner som vägde 3,5-4,0 kg för denna studie. Enligt de kirurgiska ingrepp som beskrivs i steg 2 (Figur 2) etablerades AVS-modellen genom aortaklaffskada, vilket resulterade i mekanisk aortaklaffdegeneration och förkalkning. I kontrollgruppen ingick kaniner som utfodrades med en 0,5 % kolesterolberikad kost (högt kolesterol, HC) och 50 000 U vitamin D2 (VitD2), som är känd som den dietinducerade AVS-modellen.
Bedömning av aortaklaffen
För att bedöma strukturella förändringar i aortaklaffen utvärderades bipacksedelns rörlighet och tjocklek med hjälp av ekokardiografiska kortaxliga och långaxliga vyer. Vid 8 veckor efter aortaklaffskadan visade ekokardiografin att kusparna var förtjockade och rörelsen var begränsad hos de skadade kaninerna som utfodrades med HC + VitD2-dieten jämfört med kontrollkaninerna, inklusive vildtypskaninerna (WT) och kaninerna som utfodrades med HC + VitD2-dieten utan klaffskada (Figur 3).
Histologisk analys
För att utvärdera de histologiska förändringarna i aortaklaffen avlivades kaninerna 8 veckor efter aortaklaffskadan, och en histologisk analys utfördes med de utskurna hjärtana (Figur 4). Som visas i figur 4A visade aortaklaffen färgad med Massons trikrom (MT) ökad tjocklek på aortaklaffspetsarna i den skadade gruppen jämfört med WT och HC + VitD2 dietinducerade grupper. Dessutom, för att jämföra graden av klaffkalciumavlagringar, utfördes Alizarin Red-färgning och von Kossa-färgning, som visas i figur 4B,C. Medan den kostinducerade gruppen HC + VitD2 uppvisade försumbara kalciumavlagringar i klaffbladen, observerades signifikanta kalkavlagringar i den ballongskadade gruppen.
Figur 1: Schema för den experimentella tidslinjen. En kaninmodell av aortaklaffstenos etablerades genom direkt ballongskada på aortaklaffen hos hankaniner av Nya Zeeland (NZW) (3,5-4,0 kg), följt av en diet med högt kolesterol/vitamin D2 (0,5 % kolesterolberikad kost + 50 000 U vitamin D2; HC + VitD2) i 8 veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Översikt över det operativa förfarandet. A) Under narkos placerades kaninen på rygg på operationsbordet. (B) Den vänstra gemensamma halspulsådern (LCCA) exponerades genom att noggrant separera huden och musklerna. (C) 4-F-manteln och guidekabeln sattes in i LCCA. Röd pil: mantel; Gul pil: Guidekabel. (D) Ballongkatetern fördes in över ledaren i aortaklaffen. Röd pil: ballongkateter. (E,F) Ballongkatetern blåstes upp och fördes fram/drogs tillbaka mellan vänster kammares apex och utlopp under C-armens fluoroskopiska ledning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ekokardiografisk analys av aortaklaffstenos. Representativa bilder av de långaxliga (övre panelerna) och kortaxliga (mellersta panelerna) vyerna i ekokardiogrammet och ett schematiskt diagram över graden av klaffstenos (nedre paneler) i grupperna WT (n = 3), HC + VitD2-diet (n = 3) och HC + VitD2 diet med klaffskada (n = 3). Prickad cirkel: aortaklaff; röd pilspets: förtjockade broschyrer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Histologisk analys av aortaklaffarna. Representativa bilder av (A) Massons trikrom, (B) Alizarin Red, och (C) von Kossa-färgning i WT, HC + VitD2-dieten och HC + VitD2-dieten med klaffskadegrupper. Blå pilspets: förtjockade broschyrer; Röd pilspets: förkalkade broschyrer. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurmodeller av AVS används ofta för att studera de patologiska aspekterna av AVS, inklusive initiering och progression av AVS. Detta protokoll introducerar en ny AVS-modell för kanin inducerad av en direkt ballongskada på aortaklaffen. I denna studie visade aortaklaffskademodellen signifikant förtjockning och förkalkning av broschyren. Jämfört med den milda AVS-modellen som inducerades av kosttillskott var aortaklaffen i modellen med direkt ballongskada selektivt skadad, vilket ledde till förtjockade cusps och begränsad rörelse, samt förtjockade och förkalkade broschyrer. Dessa resultat överensstämmer med de allmänna egenskaperna hos AVS10,11.
De vanliga AVS-kaninmodellerna som induceras av kosttillskott och genetisk manipulation har flera begränsningar i experimentella studier12,13,14. Utvecklingen av betydande stenos hos kaninmodeller kräver ofta en längre utfodringsperiod än hos möss, vilket kan orsaka betydande inflammation och levertoxicitet. Dessutom inducerar kosttillskott, såsom med hyperkolesterolemiska dieter och VitD2, i dessa modeller inte alltid konsekvent och signifikant klaffstenos. Som jämförelse kan den direkta ballongskadan som beskrivs i detta protokoll orsaka mekanisk skada på de opererade aortaklaffbladen, och därigenom specifikt inducera en reproducerbar remodelleringsrespons. Dessutom gör detta protokoll det möjligt att manipulera AVS:s svårighetsgrad genom att justera skadeintensiteten. Så vitt vi vet är detta första gången som effekten av mekanisk skada på aortaklaffen i kaninmodeller har validerats in vivo.
Trots dessa fördelar har detta protokoll begränsningar när det gäller att inducera konsekventa och reproducerbara AVS-modeller. För det första kräver det kirurgiska ingreppet mycket kirurgisk erfarenhet av djurmodeller. För det andra är det nödvändigt att fastställa detaljerade villkor för att optimera AVS-svårighetsgraden, till exempel när det gäller skadeintensitet och varaktigheten av kosttillskott. För det tredje är detta protokoll begränsat i sin förmåga att ge information om effekterna av ballongskadan enbart på aortaklaffstenos, eftersom denna studie endast undersökte effekterna av ballongskada i kombination med en kolesterolberikad kost. Att inkludera en grupp som får ballongskadan utan en kolesterolberikad kost skulle vara informativt, och vi kommer att överväga det för framtida studier. Icke desto mindre visar detta arbete ett nytt protokoll för direkt ballongskada på aortaklaffen i kaninmodellen, vilket är användbart för att studera de patologiska mekanismerna bakom AVS och potentiellt kan användas för att utveckla terapeutiska alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera med detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av den koreanska regeringen (MSIT) (nr 2020R1A4A3079570), utbildningsministeriet (nr 2021R1I1A1A01051425) och Industrial Strategic Technology Development Program (nr 20014873) finansierat av ministeriet för handel, industri och energi, Republiken Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580 (2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al.
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
