Summary
Для понимания патологических механизмов, лежащих в основе стеноза аортального клапана (АВС), и для оценки эффективности терапевтических вмешательств необходима соответствующая модель на животных. В настоящем протоколе описана новая процедура разработки модели кролика AVS с помощью прямого повреждения баллоном in vivo.
Abstract
Модели на животных становятся важным инструментом для понимания патологических механизмов, лежащих в основе стеноза аортального клапана (АВС), из-за отсутствия доступа к надежным источникам пораженных аортальных клапанов человека. Среди различных моделей животных модели кроликов AVS являются одними из наиболее часто используемых в исследованиях крупных животных. Тем не менее, традиционные модели AVS кроликов требуют длительного периода приема пищевых добавок и генетических манипуляций для индуцирования значительного стеноза аортального клапана, что ограничивает их использование в экспериментальных исследованиях. Для устранения этих ограничений предложена новая модель кроликов AVS, в которой стеноз индуцируется прямым баллонным повреждением аортального клапана. В настоящем протоколе описана успешная методика индуцирования АВС у новозеландских белых кроликов (NZW) с пошаговыми процедурами подготовки, хирургического вмешательства и послеоперационного ухода. Эта простая и воспроизводимая модель предлагает многообещающий подход к изучению возникновения и прогрессирования АВС и предоставляет ценный инструмент для изучения основных патологических механизмов заболевания.
Introduction
Все большее признание получает тот факт, что использование соответствующих моделей на животных может способствовать лучшему пониманию патологических механизмов, лежащих в основе стеноза аортального клапана (АВС), из-за отсутствия доступа к надежным источникам пораженных аортальных клапанов человека, связанных с прогрессированием аортального стеноза (АС). Среди различных животных моделей для изучения АВС кролики являются одной из наиболее часто используемых моделей АВС крупных животных, а модель АВС кроликов индуцируется либо с помощью добавок холестерина/витамина D2, либо с помощью генетических манипуляций 1,2,3,4.
Несмотря на то, что кроличьи модели AVS предоставили значительное представление о развитии и прогрессировании AVS, по-прежнему остается сложной задачей последовательное и воспроизводимое индуцирование AVS, как видно из наших предварительных экспериментов.
В дополнение к генетически восприимчивым моделям животных, индуцированных диетой и генетически восприимчивым, была создана новая модель AVS путем прямой механической травмы у мышей 5,6. Модель механической травмы успешно индуцирует аортальный стеноз и представляет собой простую и воспроизводимую модель AVS у мышей дикого типа. Насколько нам известно, ранее не проводилось исследований, изучающих влияние механической травмы на аортальный клапан на кроличьих моделях. Таким образом, в данном исследовании представлена новая процедура индуцирования АВС у самцов новозеландских белых кроликов путем прямого баллонного повреждения аортального клапана, которая может точно имитировать состояние клапанного аортального стеноза. Этот протокол включает в себя пошаговое описание подготовки, хирургической процедуры и послеоперационного ухода, которые полезны для индуцирования воспроизводимых моделей кроликов AVS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры исследований на животных были утверждены и проведены в соответствии с Законом о благополучии лабораторных животных, Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, а также Руководящими принципами и политикой в отношении экспериментов на животных, предоставленными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Медицинском колледже Католического университета Кореи (номер утверждения: CUMC-2021-0176-05). В настоящем исследовании использовались 3-месячные кролики-самцы новозеландской белой (NZW) массой 3,5-4,0 кг, которые содержались в стандартных условиях в индивидуальных клетках. Кроликов кормили либо обычной пищей, либо диетой, обогащенной 0,5% холестерином, с добавлением 50 000 ЕД витамина D2 (см. таблицу материалов). Дизайн эксперимента и методы анализа индукции модели кролика AVS изображены на рисунке 1.
1. Подготовка к операции
- Убедитесь, что все медицинские и хирургические инструменты (см. Таблицу материалов) стерилизованы в начале операции.
- Подготовьте набор баллонного катетера для дилатации, выполнив следующие действия.
- Подсоедините устройство для дефляции, заполненное смесью физиологического раствора и имеющегося в продаже контрастного вещества (1:1), к части с замком Люэра баллонного катетера (см. Таблицу материалов).
- Наполните баллон раствором для надувания и удалите воздух из баллонного катетера.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании инфляционный раствор состоял из 30% йодиксанола с 0,9% физиологического раствора (см. таблицу материалов). - Проверьте правильность надувания баллона, продув просвет баллона раствором для надувания.
2. Хирургическое вмешательство при травме аортального клапана
- Вводят внутримышечно тилетамин и золазепам (15 мг/кг) и ксилазин (5 мг/кг) (см. таблицу материалов) для обезболивания животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением анестезии кролики были предварительно обработаны подкожной инъекцией гликопирролата (0,05 мг/кг) в качестве преданестезирующего антихолинергического средства. Адекватный уровень анестезии определялся по сочетанию критериев, включая отсутствие реакции на защемление пальца ноги и стабильную частоту дыхания. - Введите внутривенный катетер 24 G в краевую ушную вену и соедините инфузионный набор с гепаринизированным физиологическим раствором (100 ЕД/кг гепарина).
- Подключите кролика к многопараметрическому ветеринарному монитору (см. Таблицу материалов) для непрерывного мониторинга жизненно важных показателей, таких как сигнал насыщения кислородом (SpO2), температура и артериальное давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга SpO 2 прикрепите датчик SpO2 к языку кролика. Для контроля температуры введите зонд в прямую кишку кролика. Для контроля артериального давления наденьте манжету на переднюю конечность. - Поместите кролика в положение лежа на спине на операционном столе, оборудованном рентгеноскопией С-дуги (см. таблицу материалов), и удалите волосы из вентральной области шеи с помощью машинок для стрижки шерсти животных (рис. 2A).
- Простерилизуйте место разреза йодом, а кролика накройте хирургическими полотенцами.
- Расположите сердце кролика в центре изображения С-дуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследователи должны носить защитное снаряжение с прикрепленными термолюминесцентными дозиметрами (TLD) для снижения лучевой нагрузки во время проведения операции под контролем С-дуги.- Включите С-дугу и выберите режим рентгеноскопии для визуализации сердца.
- Отрегулируйте положение кролика так, чтобы сердце находилось в центре поля визуализации.
- Сделайте продольный разрез примерно 3 см на коже шеи, и хирургическими ножницами разрежьте фасцию и жировую ткань.
- Обнажайте левую общую сонную артерию (LCCA), осторожно разделяя мышцы до тех пор, пока не обнажится примерно 3-3,5 см LCCA (Рисунок 2B).
- Наложите на LCCA шелковый шов 3-0 (см. Таблицу материалов) в верхней и нижней части открытого LCCA, чтобы остановить кровоток.
- Вставьте внутривенный катетер 22 G в LCCA и введите направляющий провод (0,016 дюйма, см. Таблицу материалов) в левый желудочек (ЛЖ) через внутривенный катетер, убедившись, что кончик катетера правильно расположен в поле визуализации С-дуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении внутривенного катетера осторожно ослабьте лигатурный шов на пути к аортальному клапану, чтобы обеспечить продвижение катетера. - Извлеките внутривенный катетер, оставив направляющий провод, и поместите оболочку 4-F (см. Таблицу материалов) поверх направляющей проволоки в LCCA, чтобы ввести баллонный катетер (Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: После замены внутривенного катетера с оболочкой весь захваченный воздух должен быть удален из оболочки. - Осторожно введите баллонный катетер диаметром 8 мм по проводнику в аортальный клапан под рентгеноскопическим контролем С-дуги (рис. 2D).
- Поместите наконечник баллонного катетера примерно на 1-2 см дистальнее аортального клапана и надуйте баллон, продувая раствор для надувания с помощью надувного насоса под давлением 6 атм.
- Переместите баллон в вершину LV и потяните его обратно в выпускное отверстие LV. Повторите эту процедуру пять раз, а затем сдуйте баллон (рис. 2E, F).
- Повторите шаги 2.8-2.9 три раза, чтобы обеспечить адекватное повреждение клапана.
- Извлеките баллонный катетер и проводник. Медленно снимите оболочку с LCCA и сразу же завяжите LCCA швом на пути вниз к аортальному клапану.
- Очистите область разреза физиологическим раствором, чтобы удалить сгустки крови, и осмотрите место прокола на предмет артериального кровотечения.
- Закройте мышцу и кожу нерассасывающимся швом 3-0 и простерилизуйте все стороны раны йодом.
3. Послеоперационный уход
- Снимите контрольные пластыри и клипсы, и держите кролика в инкубаторе интенсивной терапии.
ПРИМЕЧАНИЕ: После операции кролики находились под пристальным наблюдением в течение 1 дня в инкубаторе интенсивной терапии, а затем были перемещены в домашнюю клетку. - Купировать послеоперационную боль с помощью 5 мг/кг трамадола и 3 мг/кг кетопрофена и вводить антибиотики (4 мг/кг гентамицина) два раза в день в течение 3 дней путем подкожной инъекции (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационное обезболивание должно проводиться в соответствии с ветеринарными рекомендациями и рекомендациями IACUC (например, опиоиды, НПВП, местный анестетик или их комбинация). - Кормите 0,5% обогащенной холестерином диетой с 50 000 ЕД витамина D2 (HC + VitD2) в течение 8 недель.
4. Эхокардиография
- Через 8 недель после травмы баллоном обезболивайте кролика, используя ту же процедуру, что описана в шаге 2.1.
- Визуализируйте аортальные клапаны с помощью двумерных трансторакальных изображений и записывайте изображения в режиме М с короткой и длинной осями.
- Поместите кролика в положение лежа на спине на эхо-столе.
- Побрейте область груди с помощью машинки для стрижки и крема для депиляции.
- Нанесите гель для ультразвукового датчика (см. Таблицу материалов) на грудную клетку.
- Отрегулируйте датчик так, чтобы получить парастернальный вид по длинной оси и парастернальный вид по короткой оси аортального клапана.
- Используйте визуализацию в М-режиме для записи изображений аортального клапана как по длинной, так и по короткой оси и сохраняйте изображения для последующего анализа.
5. Гистологический анализ
- После эхокардиографии усыпьте кролика, введя внутривенную инъекцию хлорида калия (KCl, 3 г/20 мл, 1 мл).
- Вскройте грудную полость, возьмите сердце с восходящей аортой7 и поместите его на лед в фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Сразу же погрузите сердце в 4%-ный раствор параформальдегида (PFA) и встройте его в парафиновый блок (см. таблицу материалов).
- Разрежьте залитый парафином сердечный блок на срезы толщиной 4 мкм с помощью микротома и окрасьте срезы трихромом Массона (МТ), ализариновым красным и фон Коссой (см. таблицу материалов) для оценки отложения коллагена и кальцификации клапана, соответственно 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель AVS кролика, индуцированная повреждением аортального клапана
Для индукции кроличьей модели AVS в данном исследовании использовали кроликов-самцов NZW массой 3,5-4,0 кг. В соответствии с хирургическими процедурами, описанными на этапе 2 (рис. 2), модель AVS была создана по травме аортального клапана, которая привела к механической дегенерации аортального клапана и кальцификации. Контрольная группа включала кроликов, которых кормили диетой, обогащенной 0,5% холестерином (high-cholesterol, HC) и 50 000 ЕД витамина D2 (VitD2), которая известна как модель AVS, индуцированная диетой.
Оценка состояния аортального клапана
Для оценки структурных изменений аортального клапана подвижность и толщину створок оценивали с помощью эхокардиографического изображения с короткой и длинной осями. Через 8 недель после повреждения аортального клапана эхокардиография показала, что у травмированных кроликов, получавших диету HC + VitD2, были утолщены бугорки и ограничены движения по сравнению с контрольными кроликами, включая кроликов дикого типа (WT) и кроликов, получавших диету HC + VitD2 без повреждения клапана (рис. 3).
Гистологический анализ
Для оценки гистологических изменений в аортальном клапане кроликов приносили в жертву через 8 недель после повреждения аортального клапана и проводили гистологический анализ с иссеченными сердцами (рис. 4). Как показано на рисунке 4А, аортальный клапан, окрашенный трихромом Массона (МТ), показал увеличенную толщину створок аортального клапана в травмированной группе по сравнению с группами WT и HC + VitD2, индуцированными диетой. Кроме того, для сравнения степени отложения кальция в клапанах было проведено окрашивание Alizarin Red и окрашивание по Коссе, как показано на рисунке 4B, C. В то время как в группе, получавшей ГК + VitD2 в группе, получавшей диету, наблюдались незначительные отложения кальция в клапанных створках, в группе, получавшей травму баллоном, наблюдались значительные кальцифицирующие отложения.
Рисунок 1: Схема временной шкалы эксперимента. Кроличья модель стеноза аортального клапана была создана путем прямого повреждения аортального клапана баллоном на аортальном клапане у самцов новозеландских белых кроликов (NZW) (3,5-4,0 кг) с последующей диетой с высоким содержанием холестерина/витамина D2 (диета, обогащенная холестерином 0,5% + 50 000 ед. витамина D2; HC + VitD2) в течение 8 недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема операции. (А) Под наркозом кролик был помещен в положение лежа на спине на операционном столе. (Б) Левая общая сонная артерия (ЛХКА) была обнажена путем осторожного отделения кожи и мышц. (C) Оболочка 4-F и направляющая проволока были вставлены в LCCA. Красная стрелка: ножны; Желтая стрелка: направляющая проволока. (D) Баллонный катетер вводили через направляющий провод в аортальный клапан. Красная стрелка: баллонный катетер. (Д,Ж) Баллонный катетер надували и продвигали/оттягивали назад между верхушкой левого желудочка и выходным отверстием под рентгеноскопическим контролем С-дуги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Эхокардиографический анализ стеноза аортального клапана. Репрезентативные изображения видов по длинной оси (верхние панели) и по короткой оси (средние панели) на эхокардиограмме и принципиальная диаграмма степени стеноза клапанов (нижние панели) в группах WT (n = 3), HC + VitD2-диета (n = 3) и HC + VitD2 с повреждением клапана (n = 3). Пунктирный круг: аортальный клапан; Красный стрелолист: утолщенные листочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологический анализ аортальных клапанов. Репрезентативные изображения (А) трихрома Массона, (Б) ализаринового красного и (В) окрашивания фон Коссы в группах WT, HC + VitD2-диеты и HC + VitD2-диеты с повреждением клапанов. Синий наконечник стрелы: утолщенные листочки; Красный наконечник стрелы: кальцинированные листочки. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модели AVS на животных обычно используются для изучения патологических аспектов AVS, включая начало и прогрессирование AVS. Этот протокол представляет новую модель AVS кролика, индуцированную прямым баллонным повреждением аортального клапана. В этом исследовании модель повреждения аортального клапана показала значительное утолщение створок и кальцификацию. По сравнению с моделью легкой формы АВС, индуцированной пищевыми добавками, аортальный клапан в модели прямого повреждения баллоном был избирательно поврежден, что приводило к утолщению бугорков и ограничению движений, а также к утолщению и кальцинации створок. Эти результаты согласуются с общими характеристиками АВС10,11.
Широко используемые модели кроликов AVS, индуцированные пищевыми добавками и генетическими манипуляциями, имеют ряд ограничений в экспериментальных исследованиях12,13,14. Развитие значительного стеноза у кроликов часто требует более длительного периода кормления, чем у мышей, что может вызвать значительное воспаление и печеночную токсичность. Кроме того, пищевые добавки, такие как гиперхолестеринемическая диета и VitD2, в этих моделях не всегда вызывают устойчивый и значительный клапанный стеноз. Для сравнения, прямое повреждение баллоном, описанное в этом протоколе, может вызвать механическое повреждение оперированных створок аортального клапана, тем самым специфически индуцируя воспроизводимую реакцию ремоделирования. Более того, этот протокол позволяет манипулировать тяжестью АВС путем корректировки интенсивности травмы. Насколько нам известно, это первый случай, когда влияние механической травмы на аортальный клапан на кроличьих моделях было подтверждено in vivo.
Несмотря на эти преимущества, этот протокол имеет ограничения в индуцировании согласованных и воспроизводимых моделей AVS. Во-первых, хирургическая процедура требует большого хирургического опыта на животных моделях. Во-вторых, необходимо установить детальные условия для оптимизации тяжести АВС, например, с точки зрения интенсивности травмы и продолжительности приема пищевых добавок. В-третьих, этот протокол ограничен в своей способности предоставить информацию о влиянии одной только травмы баллона на стеноз аортального клапана, поскольку в этом исследовании изучались только последствия травмы баллоном в сочетании с диетой, обогащенной холестерином. Включение группы, получившей травму от воздушного шара без диеты, обогащенной холестерином, было бы информативным, и мы рассмотрим это для будущих исследований. Тем не менее, эта работа демонстрирует новый протокол прямого повреждения аортального клапана баллоном на модели кролика, который полезен для изучения патологических механизмов, лежащих в основе AVS, и потенциально может быть использован для разработки терапевтических вариантов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не могут заявить о конфликте интересов в этой работе.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2020R1A4A3079570), Министерством образования (No 2021R1I1A1A01051425) и Программой стратегического развития промышленных технологий (No 20014873), финансируемой Министерством торговли, промышленности и энергетики Республики Корея.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580 (2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al.
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
