Summary
Se necesita un modelo animal apropiado para comprender los mecanismos patológicos subyacentes a la estenosis de la válvula aórtica (EAV) y para evaluar la eficacia de las intervenciones terapéuticas. El presente protocolo describe un nuevo procedimiento para desarrollar el modelo de conejo AVS a través de una lesión directa con balón in vivo.
Abstract
Los modelos animales están emergiendo como una herramienta importante para comprender los mecanismos patológicos subyacentes a la estenosis de la válvula aórtica (EAV) debido a la falta de acceso a fuentes confiables de válvulas aórticas humanas enfermas. Entre los diversos modelos animales, los modelos de conejo AVS son uno de los más utilizados en estudios con animales grandes. Sin embargo, los modelos tradicionales de conejo AVS requieren un período prolongado de suplementación dietética y manipulación genética para inducir una estenosis significativa en la válvula aórtica, lo que limita su uso en estudios experimentales. Para abordar estas limitaciones, se propone un nuevo modelo de conejo AVS, en el que la estenosis es inducida por una lesión directa con balón en la válvula aórtica. El presente protocolo describe una técnica exitosa para la inducción de AVS en conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW), con procedimientos paso a paso para la preparación, el procedimiento quirúrgico y el cuidado postoperatorio. Este modelo simple y reproducible ofrece un enfoque prometedor para estudiar el inicio y la progresión de la AVS y proporciona una herramienta valiosa para investigar los mecanismos patológicos subyacentes de la enfermedad.
Introduction
Cada vez se reconoce más que el uso de modelos animales apropiados puede contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos patológicos subyacentes a la estenosis de la válvula aórtica (EAV) debido a la falta de acceso a fuentes fiables de válvulas aórticas humanas enfermas asociadas con la progresión de la estenosis aórtica (EA). Entre los diversos modelos animales para el estudio de la AVS, los conejos son uno de los modelos AVS de animales grandes más utilizados, y el modelo de conejo AVS se induce a través de la suplementación con colesterol/vitamina D2 o la manipulación genética 1,2,3,4.
Aunque los modelos de AVS de conejo han proporcionado información significativa sobre el desarrollo y la progresión de AVS, sigue siendo un desafío inducir AVS de manera consistente y reproducible, como se vio en nuestros experimentos preliminares.
Además de los modelos animales inducidos por la dieta y genéticamente susceptibles, se ha establecido un nuevo modelo de AVS a través de la lesión mecánica directa en ratones 5,6. El modelo de lesión mecánica induce con éxito la estenosis aórtica y representa un modelo AVS simple y reproducible en ratones de tipo salvaje. Hasta donde sabemos, no ha habido estudios previos que examinen los efectos de una lesión mecánica en la válvula aórtica en modelos de conejos. Por lo tanto, este estudio proporciona un nuevo procedimiento para inducir AVS en conejos blancos machos de Nueva Zelanda a través de una lesión directa con balón en la válvula aórtica, que puede imitar con precisión la condición de estenosis aórtica valvular. Este protocolo incluye descripciones paso a paso de la preparación, el procedimiento quirúrgico y los cuidados postoperatorios, que son útiles para inducir modelos reproducibles de conejos AVS.
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Protocol
Todos los procedimientos de investigación con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con la Ley de Bienestar de los Animales de Laboratorio, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las Directrices y Políticas para Experimentos con Animales proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica de Corea (número de aprobación: CUMC-2021-0176-05). En el presente estudio se utilizaron conejos blancos machos de Nueva Zelanda (NZW) de 3 meses de edad con un peso de 3,5-4,0 kg, que se mantuvieron en condiciones estándar en jaulas individuales. Los conejos fueron alimentados con una dieta normal o una dieta enriquecida con colesterol al 0,5% suplementada con 50.000 U de vitamina D2 (ver Tabla de Materiales). El diseño experimental y los métodos de análisis para la inducción del modelo de conejo AVS se muestran en la Figura 1.
1. Preparación para la operación
- Asegúrese de que todos los instrumentos médicos y quirúrgicos (ver Tabla de Materiales) estén esterilizados al comienzo de la operación.
- Prepare el juego de catéteres con balón de dilatación siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Conecte el dispositivo de desinflado lleno de una mezcla de solución salina y medio de contraste disponible en el mercado (1:1) a la parte Luer Lock del catéter con balón (consulte la Tabla de materiales).
- Llene el balón con solución de inflado y retire el aire del catéter del balón.
NOTA: Para el presente estudio, la solución de inflado consistió en yodixanol al 30% con solución salina al 0,9% (ver Tabla de Materiales). - Verifique el inflado adecuado del globo purgando el lumen del globo con la solución de inflado.
2. Procedimiento quirúrgico para la lesión de la válvula aórtica
- Administrar una inyección intramuscular de tiletamina y zolazepam (15 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) para anestesiar al animal.
NOTA: Antes de administrar la anestesia, los conejos fueron pretratados con una inyección subcutánea de glicopirrolato (0,05 mg/kg) como agente anticolinérgico preanestésico. El nivel adecuado de anestesia se determinó mediante una combinación de criterios, incluida la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie y una frecuencia respiratoria constante. - Insertar un catéter intravenoso (IV) de 24 G en la vena auricular marginal y conectar un equipo de infusión con solución salina heparinizada (100 U/kg de heparina).
- Conecte al conejo con un monitor veterinario multiparamétrico (ver Tabla de Materiales) para monitorear continuamente los signos vitales, como la señal de saturación de oxígeno (SpO2), la temperatura y la presión arterial.
NOTA: Para el monitoreo de SpO 2, conecte el sensor de SpO2 a la lengua del conejo. Para el control de la temperatura, inserte la sonda en el recto del conejo. Para el control de la presión arterial, coloque el manguito en la extremidad anterior. - Coloque al conejo en posición supina sobre una mesa de operaciones equipada con una fluoroscopia de arco en C (consulte la Tabla de materiales) y retire el pelo del área ventral del cuello con un cortapelos de animales (Figura 2A).
- Esterilice el área de la incisión con yodo y cubra al conejo con toallas quirúrgicas.
- Coloca el corazón del conejo en el centro de la imagen del arco en C.
NOTA: Todos los investigadores deben usar equipo de protección con dosímetros termoluminiscentes (TLD) adjuntos para reducir la exposición a la radiación mientras realizan la cirugía guiada por arco en C.- Encienda el arco en C y seleccione el modo fluoroscópico para las imágenes cardíacas.
- Ajuste la posición del conejo para asegurarse de que el corazón esté en el centro del campo de imágenes.
- Realice una incisión longitudinal de aproximadamente 3 cm en la piel del cuello, y utilice unas tijeras quirúrgicas para cortar la fascia y el tejido graso.
- Exponga la arteria carótida común izquierda (LCCA) separando cuidadosamente los músculos hasta que quede expuesta aproximadamente 3-3,5 cm de la LCCA (Figura 2B).
- Ligue el LCCA con una sutura de seda 3-0 (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior y al final del LCCA expuesto para detener el flujo sanguíneo.
- Inserte un catéter intravenoso de 22 G en el LCCA e introduzca una guía (0,016 pulgadas, consulte la Tabla de materiales) en el ventrículo izquierdo (VI) a través del catéter intravenoso, asegurándose de que la punta del catéter esté correctamente colocada en el campo de imágenes del arco en C.
NOTA: Al insertar el catéter intravenoso, afloje con cuidado la sutura de la ligadura en el camino hacia la válvula aórtica para permitir el avance del catéter. - Retire el catéter intravenoso, dejando el alambre guía, y coloque una vaina 4-F (ver Tabla de materiales) sobre el alambre guía en el LCCA para introducir el catéter con balón (Figura 2C).
NOTA: Después de reemplazar el catéter intravenoso con la vaina, se debe eliminar el aire atrapado del dispositivo de la vaina. - Inserte con cuidado el catéter con balón de 8 mm sobre la guía en la válvula aórtica bajo guía fluoroscópica del arco en C (Figura 2D).
- Coloque la punta del catéter con balón aproximadamente 1-2 cm distal a la válvula aórtica e infle el balón purgando la solución de inflado con un inflador de presión a 6 atm.
- Avance el globo hacia el vértice del VI y tire de él hacia la salida del VI. Repita este procedimiento cinco veces y luego desinfle el globo (Figura 2E, F).
- Repita los pasos 2.8-2.9 tres veces para asegurarse de que la lesión de la válvula sea adecuada.
- Retire el catéter con balón y la guía. Retire lentamente la vaina del LCCA e inmediatamente ate el LCCA con la sutura en el camino hacia la válvula aórtica.
- Limpie el área de la incisión con solución salina para eliminar los coágulos de sangre e inspeccione el sitio de la punción en busca de sangrado arterial.
- Cierre el músculo y la piel con una sutura no absorbible 3-0 y esterilice todos los lados de la herida con yodo.
3. Cuidados postoperatorios
- Retire los parches y clips de monitoreo y mantenga al conejo en una incubadora de cuidados intensivos.
NOTA: Después de la cirugía, los conejos fueron observados de cerca durante 1 día en una incubadora de cuidados intensivos y luego trasladados a una jaula doméstica. - Controlar el dolor postoperatorio con 5 mg/kg de tramadol y 3 mg/kg de ketoprofeno y administrar antibióticos (4 mg/kg de gentamicina) dos veces al día durante 3 días mediante inyección subcutánea (ver Tabla de materiales).
NOTA: El manejo del dolor postoperatorio debe cumplir con las pautas veterinarias y de la IACUC (p. ej., opioides, AINE, anestésico local o combinación). - Alimente una dieta enriquecida con colesterol al 0,5% con 50.000 U de vitamina D2 (HC + VitD2) durante 8 semanas.
4. Ecocardiografía
- Después de 8 semanas de lesión con balón, anestesiar al conejo usando el mismo procedimiento descrito en el paso 2.1.
- Visualice las válvulas aórticas mediante vistas transtorácicas bidimensionales y grabe imágenes en modo M en vistas de eje corto y eje largo.
- Coloca al conejo en posición supina sobre una mesa de eco.
- Afeita el área del pecho con una maquinilla y crema depilatoria.
- Aplique gel transductor de ultrasonido (ver Tabla de materiales) en el tórax.
- Ajuste el transductor para obtener la vista del eje largo paraesterl y la vista del eje corto paraesternal de la válvula aórtica.
- Utilice las imágenes en modo M para registrar imágenes de la válvula aórtica tanto en las vistas del eje largo como en el eje corto, y guarde las imágenes para su posterior análisis.
5. Análisis histológico
- Después de la ecocardiografía, eutanasiar al conejo administrando una inyección intravenosa de cloruro de potasio (KCl, 3 g/20 mL, 1 mL).
- Abra la cavidad torácica, extraiga el corazón con la aortaascendente 7 y colóquelo en hielo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Sumerja inmediatamente el corazón en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% e insértelo en un bloque de parafina (consulte la Tabla de materiales).
- Cortar el bloque cardíaco incluido en parafina en secciones de 4 μm de espesor con un micrótomo y teñir las secciones con tricrómico de Masson (MT), rojo de alizarina y von Kossa (ver Tabla de materiales) para evaluar la deposición de colágeno y la calcificación de la válvula, respectivamente 8,9.
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Representative Results
Modelo AVS de conejo inducido por lesión valvular aórtica
Para inducir el modelo AVS de conejo, se utilizaron conejos machos NZW con un peso de 3,5-4,0 kg para este estudio. De acuerdo con los procedimientos quirúrgicos descritos en el paso 2 (Figura 2), el modelo AVS se estableció por lesión valvular aórtica, lo que resultó en degeneración mecánica de la válvula aórtica y calcificación. El grupo de control incluyó conejos alimentados con una dieta enriquecida con 0,5% de colesterol (colesterol alto, HC) y 50.000 U de vitamina D2 (VitD2), lo que se conoce como el modelo AVS inducido por la dieta.
Valoración de la válvula aórtica
Para evaluar los cambios estructurales en la válvula aórtica, se evaluó la movilidad y el grosor de las valvas mediante vistas ecocardiográficas de eje corto y eje largo. A las 8 semanas de la lesión valvular aórtica, la ecocardiografía reveló que las cúspides estaban engrosadas y el movimiento restringido en los conejos lesionados alimentados con la dieta HC + VitD2 en comparación con los conejos control, incluidos los conejos de tipo salvaje (WT) y los conejos alimentados con la dieta HC + VitD2 sin lesión valvular (Figura 3).
Análisis histológico
Para evaluar los cambios histológicos en la válvula aórtica, los conejos fueron sacrificados a las 8 semanas después de la lesión valvular aórtica, y se realizó un análisis histológico con los corazones extirpados (Figura 4). Como se muestra en la Figura 4A, la válvula aórtica teñida con tricrómico de Masson (MT) mostró un aumento del grosor de las cúspides de la válvula aórtica en el grupo lesionado en comparación con los grupos inducidos por la dieta WT y HC + VitD2. Además, para comparar el grado de depósitos valvulares de calcio, se realizó la tinción con rojo de alizarina y la tinción de von Kossa, como se muestra en la Figura 4B,C. Mientras que el grupo inducido por la dieta HC + VitD2 exhibió depósitos de calcio insignificantes en las valvas valvulares, se observaron depósitos de calcio significativos en el grupo lesionado por balón.
Figura 1: Esquema de la línea de tiempo experimental. Se estableció un modelo de estenosis de la válvula aórtica en conejos mediante lesión directa con balón en la válvula aórtica en conejos machos blancos de Nueva Zelanda (3,5-4,0 kg), seguidos de una dieta alta en colesterol/vitamina D2 (dieta enriquecida con colesterol al 0,5% + 50.000 U de vitamina D2; HC + VitD2) durante 8 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema del procedimiento operatorio. (A) Bajo anestesia, el conejo se colocó en posición supina sobre la mesa de operaciones. (B) La arteria carótida común izquierda (LCCA) se expuso separando cuidadosamente la piel y los músculos. (C) La vaina 4-F y el alambre guía se insertaron en el LCCA. Flecha roja: vaina; Flecha amarilla: Alambre guía. (D) El catéter con balón se introdujo sobre el alambre guía en la válvula aórtica. Flecha roja: catéter con balón. (E,F) El catéter balón se infló y se avanzó/tiró hacia atrás entre el ápice del ventrículo izquierdo y la salida bajo guía fluoroscópica del arco en C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis ecocardiográfico de la estenosis valvular aórtica. Imágenes representativas de las vistas de eje largo (paneles superiores) y eje corto (paneles centrales) en el ecocardiograma y un diagrama esquemático del grado de estenosis valvular (paneles inferiores) en los grupos WT (n = 3), dieta HC + VitD2 (n = 3) y dieta HC + VitD2 con lesión valvular (n = 3). Círculo punteado: válvula aórtica; punta de flecha roja: folíolos engrosados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis histológico de las válvulas aórticas. Imágenes representativas de (A) tricrómico de Masson, (B) rojo de alizarina y (C) tinción de von Kossa en los grupos WT, dieta HC + VitD2 y dieta HC + VitD2 con lesión valvular. Punta de flecha azul: folíolos engrosados; punta de flecha roja: folíolos calcificados. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos animales de AVS se utilizan comúnmente para estudiar los aspectos patológicos de AVS, incluido el inicio y la progresión de AVS. Este protocolo introduce un nuevo modelo de AVS de conejo inducido por una lesión directa con balón en la válvula aórtica. En este estudio, el modelo de lesión valvular aórtica mostró un engrosamiento y calcificación significativo de las valvas. En comparación con el modelo AVS leve inducido por la suplementación dietética, la válvula aórtica en el modelo de lesión directa con balón se lesionó selectivamente, lo que provocó el engrosamiento de las cúspides y la restricción del movimiento, así como el engrosamiento y la calcificación de las valvas. Estos resultados son consistentes con las características generales de AVS10,11.
Los modelos de conejo AVS comúnmente utilizados inducidos por suplementación dietética y manipulación genética tienen varias limitaciones en los estudios experimentales12,13,14. El desarrollo de estenosis significativa en modelos de conejo a menudo requiere un período de alimentación más largo que en ratones, lo que puede causar inflamación significativa y toxicidad hepática. Además, la suplementación dietética, como con las dietas hipercolesterolémicas y VitD2, en estos modelos no siempre induce una estenosis valvular consistente y significativa. En comparación, la lesión directa con balón descrita en este protocolo puede causar daño mecánico a las valvas de la válvula aórtica operada, induciendo así específicamente una respuesta de remodelación reproducible. Además, este protocolo permite manipular la gravedad de la AVS ajustando la intensidad de la lesión. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se valida in vivo el efecto de la lesión mecánica sobre la válvula aórtica en modelos de conejo.
A pesar de estas ventajas, este protocolo tiene limitaciones a la hora de inducir modelos AVS consistentes y reproducibles. En primer lugar, el procedimiento quirúrgico requiere mucha experiencia quirúrgica con modelos animales. En segundo lugar, es necesario establecer condiciones detalladas para optimizar la gravedad de la AVS, por ejemplo, en términos de la intensidad de la lesión y la duración de la suplementación dietética. En tercer lugar, este protocolo tiene una capacidad limitada para proporcionar información sobre los efectos de la lesión con balón sola en la estenosis de la válvula aórtica, ya que este estudio solo investigó los efectos de la lesión con balón en combinación con una dieta enriquecida con colesterol. Incluir a un grupo que recibe la lesión del balón sin una dieta enriquecida con colesterol sería informativo, y lo consideraremos para estudios futuros. Sin embargo, este trabajo demuestra un nuevo protocolo para la lesión directa con balón en la válvula aórtica en el modelo de conejo, que es útil para estudiar los mecanismos patológicos subyacentes a la AVS y potencialmente puede ser utilizado para desarrollar opciones terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar con este trabajo.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (n.º 2020R1A4A3079570), el Ministerio de Educación (n.º 2021R1I1A1A01051425) y el Programa de Desarrollo Tecnológico Estratégico Industrial (n.º 20014873) financiado por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía de la República de Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580 (2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al.
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
