Summary
En passende dyremodel er nødvendig for at forstå de patologiske mekanismer, der ligger til grund for aortaklappestenose (AVS), og for at evaluere effekten af terapeutiske indgreb. Denne protokol beskriver en ny procedure til udvikling af AVS-kaninmodellen via en direkte ballonskade in vivo.
Abstract
Dyremodeller dukker op som et vigtigt redskab til at forstå de patologiske mekanismer, der ligger til grund for aortaklappestenose (AVS) på grund af manglende adgang til pålidelige kilder til syge humane aortaklapper. Blandt de forskellige dyremodeller er AVS kaninmodeller en af de mest anvendte i store dyreforsøg. Imidlertid kræver traditionelle AVS-kaninmodeller en langvarig periode med kosttilskud og genetisk manipulation for at fremkalde signifikant stenose i aortaklappen, hvilket begrænser deres anvendelse i eksperimentelle undersøgelser. For at afhjælpe disse begrænsninger foreslås en ny AVS-kaninmodel, hvor stenose induceres af en direkte ballonskade på aortaklappen. Denne protokol beskriver en vellykket teknik til inducering af AVS hos New Zealand hvide (NZW) kaniner med trinvise procedurer for forberedelse, kirurgisk procedure og postoperativ pleje. Denne enkle og reproducerbare model tilbyder en lovende tilgang til at studere initiering og progression af AVS og giver et værdifuldt værktøj til at undersøge sygdommens underliggende patologiske mekanismer.
Introduction
Det anerkendes i stigende grad, at brugen af passende dyremodeller kan bidrage til en bedre forståelse af de patologiske mekanismer, der ligger til grund for aortaklappestenose (AVS) på grund af manglende adgang til pålidelige kilder til syge humane aortaklapper forbundet med progressionen af aortastenose (AS). Blandt de forskellige dyremodeller til undersøgelse af AVS er kaniner en af de mest anvendte AVS-modeller med store dyr, og AVS-kaninmodellen induceres enten gennem kolesterol/vitamin D2-tilskud eller genetisk manipulation 1,2,3,4.
Selvom kanin-AVS-modeller har givet betydelig indsigt i udviklingen og progressionen af AVS, er det stadig en udfordring at inducere AVS konsekvent og reproducerbart, som det ses i vores indledende eksperimenter.
Ud over diætinducerede og genetisk modtagelige dyremodeller er der etableret en ny model af AVS gennem direkte mekanisk skade i mus 5,6. Den mekaniske skademodel inducerer med succes aortastenose og repræsenterer en enkel og reproducerbar AVS-model i vildtypemus. Så vidt vi ved, har der ikke været nogen tidligere undersøgelser, der undersøger virkningerne af en mekanisk skade på aortaklappen i kaninmodeller. Denne undersøgelse giver således en ny procedure til inducering af AVS hos hvide hankaniner fra New Zealand gennem en direkte ballonskade på aortaklappen, som nøjagtigt kan efterligne tilstanden af valvulær aortastenose. Denne protokol indeholder trinvise beskrivelser af præparatet, den kirurgiske procedure og den postoperative pleje, som er nyttige til at inducere reproducerbare AVS-kaninmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforskningsprocedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med loven om laboratoriedyrs velfærd, vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr og retningslinjerne og politikkerne for dyreforsøg fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved College of Medicine ved The Catholic University of Korea (godkendelsesnummer: CUMC-2021-0176-05). Denne undersøgelse anvendte 3 måneder gamle hvide newzealandske hankaniner, der vejer 3,5-4,0 kg, og som blev opretholdt under standardbetingelser i individuelle bure. Kaninerne blev fodret med enten en normal kost eller en 0,5% kolesterolberiget kost suppleret med 50.000 E vitamin D2 (se materialetabel). De eksperimentelle design- og analysemetoder til induktion af AVS-kaninmodellen er afbildet i figur 1.
1. Forberedelse til operationen
- Sørg for, at alle medicinske og kirurgiske instrumenter (se materialetabellen) steriliseres i begyndelsen af operationen.
- Forbered dilatationsballonkatetersættet ved at følge nedenstående trin.
- Tilslut in-deflationsanordningen fyldt med en blanding af saltvand og kommercielt tilgængeligt kontrastmedium (1:1) til luerlåsdelen af ballonkateteret (se materialetabel).
- Fyld ballonen med oppustningsopløsning, og fjern eventuel luft fra ballonkateteret.
BEMÆRK: I denne undersøgelse bestod inflationsopløsningen af 30% iodixanol med 0,9% saltvand (se materialetabel). - Kontroller korrekt balloninflation ved at rense ballonlumen med oppustningsopløsningen.
2. Kirurgisk procedure for aortaklappeskaden
- Administrer en intramuskulær injektion af tiletamin & zolazepam (15 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) (se materialetabel) for at bedøve dyret.
BEMÆRK: Før anæstesien blev administreret, blev kaninerne forbehandlet med en subkutan glycopyrrolatinjektion (0,05 mg / kg) som et præ-anæstetisk antikolinergt middel. Det tilstrækkelige anæstesiniveau blev bestemt af en kombination af kriterier, herunder manglende respons på en tåklemme og en stabil respirationsfrekvens. - Indsæt et 24 G intravenøst (IV) kateter i den marginale aurikulære vene, og tilslut et infusionssæt med hepariniseret saltvand (100 E/kg heparin).
- Forbind kaninen med en multiparameter veterinærmonitor (se materialetabel) for kontinuerligt at overvåge de vitale tegn, såsom iltmætningssignalet (SpO2), temperatur og blodtryk.
BEMÆRK: Til SpO 2-overvågning skal du fastgøre SpO2-sensoren til kaninens tunge. Til temperaturovervågning indsættes sonden i kaninens endetarm. Til blodtryksovervågning skal du placere manchetten på forbenet. - Placer kaninen i liggende stilling på et operationsbord udstyret med en C-arm fluoroskopi (se materialetabellen), og fjern hårene fra det ventrale halsområde ved hjælp af dyrehårklippere (figur 2A).
- Steriliser snitområdet med jod, og dæk kaninen med kirurgiske håndklæder.
- Placer kaninens hjerte i midten af C-armbilledet.
BEMÆRK: Alle forskere skal bære beskyttelsesudstyr med vedhæftede termoluminescerende dosimetre (TLD'er) for at reducere strålingseksponeringen, mens de udfører C-arm-guidet kirurgi.- Tænd for C-armen, og vælg fluoroskopisk tilstand til hjertebilleddannelse.
- Juster kaninens position for at sikre, at hjertet er i centrum af billeddannelsesfeltet.
- Lav et langsgående snit på ca. 3 cm i nakkens hud, og brug kirurgisk saks til at skære fascia og fedtvæv.
- Udsæt den venstre fælles halspulsåre (LCCA) ved omhyggeligt at adskille musklerne, indtil ca. 3-3,5 cm af LCCA er blotlagt (figur 2B).
- Ligate LCCA med en 3-0 silkesutur (se materialetabel) øverst og i slutningen af den udsatte LCCA for at stoppe blodgennemstrømningen.
- Indsæt et 22 G IV-kateter i LCCA, og indfør en styretråd (0,016 tommer, se materialetabel) i venstre ventrikel (LV) gennem IV-kateteret, og sørg for, at spidsen af kateteret er korrekt placeret i billedfeltet på C-armen.
BEMÆRK: Når du indsætter IV-kateteret, skal du forsigtigt løsne ligatursuturen på vej ned til aortaklappen for at muliggøre kateterets fremskridt. - Træk IV-kateteret ud, lad styretråden stå, og anbring en 4-F-kappe (se materialetabellen) over styretråden i LCCA for at indføre ballonkateteret (figur 2C).
BEMÆRK: Efter udskiftning af IV-kateteret med kappen skal eventuel fanget luft fjernes fra kappeindretningen. - Sæt forsigtigt 8 mm ballonkateteret over styretråden ind i aortaklappen under C-arm fluoroskopisk vejledning (figur 2D).
- Placer ballonkateterspidsen ca. 1-2 cm distalt i forhold til aortaklappen, og pust ballonen op ved at rense oppustningsopløsningen med en trykpumpe ved 6 atm.
- Før ballonen ind i LV-toppen, og træk den tilbage i LV-stikkontakten. Gentag denne procedure fem gange, og tøm derefter ballonen (figur 2E, F).
- Gentag trin 2.8-2.9 tre gange for at sikre tilstrækkelig ventilskade.
- Træk ballonkateteret og styretråden ud. Fjern langsomt kappen fra LCCA, og bind straks LCCA med suturen på vej ned til aortaklappen.
- Rens snitområdet med saltvand for at fjerne blodpropperne, og inspicer det punkterede sted for arteriel blødning.
- Luk musklen og huden med en 3-0 ikke-absorberbar sutur, og steriliser alle sider af såret med jod.
3. Postoperativ pleje
- Fjern overvågningsplastrene og klipene, og hold kaninen i en intensivkuvøse.
BEMÆRK: Efter operationen blev kaninerne nøje observeret i 1 dag i en intensivkuvøse og derefter flyttet til et hjemmebur. - Administrer postoperative smerter med 5 mg / kg tramadol og 3 mg / kg ketoprofen og administrer antibiotika (4 mg / kg gentamicin) to gange dagligt i 3 dage via subkutan injektion (se materialetabel).
BEMÆRK: Postoperativ smertebehandling skal overholde veterinære og IACUC retningslinjer (f.eks. Opioid, NSAID, lokalbedøvelse eller kombination). - Foder en 0,5% kolesterolberiget kost med 50.000 U vitamin D2 (HC + VitD2) i 8 uger.
4. Ekkokardiografi
- Efter 8 ugers ballonskade bedøves kaninen ved hjælp af samme procedure som beskrevet i trin 2.1.
- Visualiser aortaklapperne ved hjælp af todimensionelle transthoraciske visninger, og optag M-tilstandsbilleder i kortakse- og langaksevisninger.
- Placer kaninen i liggende stilling på et ekkobord.
- Barber brystområdet ved hjælp af klippere og hårfjerningscreme.
- Påfør ultralydstransducergel (se materialetabel) på brystet.
- Juster transduceren for at opnå den parasternale langaksevisning og den parasternale kortaksevisning af aortaklappen.
- Brug M-tilstandsbilleddannelse til at optage billeder af aortaklappen i både langakse- og kortaksevisninger, og gem billederne til senere analyse.
5. Histologisk analyse
- Efter ekkokardiografien aflives kaninen ved at administrere en intravenøs injektion af kaliumchlorid (KCl, 3 g / 20 ml, 1 ml).
- Åbn brysthulen, høst hjertet med den stigende aorta7, og læg det på is i fosfatbufret saltvand (PBS).
- Nedsænk straks hjertet i en 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning, og indlejr det i en paraffinblok (se materialetabel).
- Skær den paraffinindlejrede hjerteblok i 4 μm tykke sektioner ved hjælp af et mikrotom, og pletter sektionerne med Massons trikrome (MT), Alizarin Red og von Kossa (se materialetabel) for at vurdere kollagenaflejring og ventilforkalkning henholdsvis 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kanin AVS-model induceret af aortaklappeskade
For at inducere kanin-AVS-modellen blev mandlige NZW-kaniner, der vejer 3,5-4,0 kg, anvendt til denne undersøgelse. Ifølge de kirurgiske procedurer beskrevet i trin 2 (figur 2) blev AVS-modellen etableret ved aortaklappeskade, hvilket resulterede i mekanisk aortaklappedegeneration og forkalkning. Kontrolgruppen omfattede kaniner fodret med en 0,5% kolesterolberiget diæt (højt kolesteroltal, HC) og 50.000 U vitamin D2 (VitD2), som er kendt som den diætinducerede AVS-model.
Vurdering af aortaklappen
For at vurdere strukturelle ændringer i aortaklappen blev folderens mobilitet og tykkelse evalueret ved hjælp af ekkokardiografiske kortakse- og langaksevisninger. 8 uger efter aortaklappeskaden afslørede ekkokardiografien, at cusps var fortykket, og bevægelsen var begrænset hos de skadede kaniner fodret med HC + VitD2 diæt sammenlignet med kontrolkaninerne, herunder vildtypekaninerne (WT) og kaninerne fodret HC + VitD2 diæt uden ventilskade (figur 3).
Histologisk analyse
For at evaluere de histologiske ændringer i aortaklappen blev kaninerne ofret 8 uger efter aortaklappeskaden, og en histologisk analyse blev udført med de udskårne hjerter (figur 4). Som vist i figur 4A viste aortaklappen farvet med Massons trikrom (MT) øget tykkelse af aortaklapperne i den skadede gruppe sammenlignet med WT og HC + VitD2 diætinducerede grupper. For at sammenligne graden af valvulære calciumaflejringer blev Alizarin Red-farvning og von Kossa-farvning desuden udført, som vist i figur 4B,C. Mens HC + VitD2 diætinduceret gruppe udviste ubetydelige calciumaflejringer i valvulære foldere, blev der observeret signifikante kalkaflejringer i den ballonskadede gruppe.
Figur 1: Skema for den eksperimentelle tidslinje. En kaninmodel af aortaklappestenose blev etableret ved direkte ballonskade på aortaklappen hos hvide hankaniner fra New Zealand (NZW) (3,5-4,0 kg), efterfulgt af en diæt med højt kolesteroltal/vitamin D2 (0,5% kolesterolberiget kost + 50.000 U vitamin D2; HC + VitD2) i 8 uger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over den operative procedure. (A) Under anæstesi blev kaninen anbragt i liggende stilling på operationsbordet. (B) Den venstre fælles halspulsåre (LCCA) blev blotlagt ved omhyggeligt at adskille hud og muskler. (C) 4-F-kappen og styretråden blev indsat i LCCA. Rød pil: kappe; Gul pil: styretråd. (D) Ballonkateteret blev ført over styretråden ind i aortaklappen. Rød pil: ballonkateter. (E,F) Ballonkateteret blev pustet op og avanceret/trukket tilbage mellem venstre ventrikelspids og udløb under C-arm fluoroskopisk vejledning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ekkokardiografisk analyse af aortaklappestenosen. Repræsentative billeder af visningerne med lang akse (øverste paneler) og kortakse (midterste paneler) i ekkokardiogrammet og et skematisk diagram over graden af valvulær stenose (nedre paneler) i WT (n = 3), HC + VitD2-diæt (n = 3) og HC + VitD2 diæt med ventilskade (n = 3) grupper. Stiplet cirkel: aortaklappen; Rød pilespids: fortykkede foldere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histologisk analyse af aortaklapperne. Repræsentative billeder af (A) Massons trikrome, (B) Alizarin Red og (C) von Kossa-farvning i WT-, HC + VitD2-diæt og HC + VitD2-diæt med ventilskadegrupper. Blå pilespids: fortykkede foldere; Rød pilespids: Forkalkede foldere. Vægtstænger = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyre-AVS-modeller bruges almindeligvis til at studere de patologiske aspekter af AVS, herunder initiering og progression af AVS. Denne protokol introducerer en ny kanin AVS-model induceret af en direkte ballonskade på aortaklappen. I denne undersøgelse viste aortaklappeskademodellen signifikant fortykkelse og forkalkning af folderen. Sammenlignet med den milde AVS-model induceret af kosttilskud blev aortaklappen i den direkte ballonskademodel selektivt skadet, hvilket førte til fortykkede cusps og begrænset bevægelse samt fortykkede og forkalkede foldere. Disse resultater er i overensstemmelse med de generelle karakteristika ved AVS10,11.
De almindeligt anvendte AVS-kaninmodeller induceret af kosttilskud og genetisk manipulation har flere begrænsninger i eksperimentelle undersøgelser12,13,14. Udviklingen af signifikant stenose i kaninmodeller kræver ofte en længere fodringsperiode end hos mus, hvilket kan forårsage signifikant inflammation og levertoksicitet. Derudover inducerer kosttilskud, såsom med hypercholesterolemiske kostvaner og VitD2, i disse modeller ikke altid konsistent og signifikant valvulær stenose. Til sammenligning kan den direkte ballonskade, der er beskrevet i denne protokol, forårsage mekanisk skade på de opererede aortaklappebrochurer og derved specifikt fremkalde et reproducerbart remodelleringsrespons. Desuden giver denne protokol mulighed for manipulation af sværhedsgraden af AVS ved at justere skadeintensiteten. Så vidt vi ved, er det første gang, at effekten af mekanisk skade på aortaklappen i kaninmodeller er blevet valideret in vivo.
På trods af disse fordele har denne protokol begrænsninger i at inducere konsistente og reproducerbare AVS-modeller. For det første kræver den kirurgiske procedure meget kirurgisk erfaring med dyremodeller. For det andet er det nødvendigt at fastsætte detaljerede betingelser for optimering af AVS-sværhedsgraden, såsom med hensyn til skadeintensiteten og varigheden af kosttilskuddet. For det tredje er denne protokol begrænset i sin evne til at give information om virkningerne af ballonskaden alene på aortaklappestenose, da denne undersøgelse kun undersøgte virkningerne af ballonskade i kombination med en kolesterolberiget diæt. At inkludere en gruppe, der modtager ballonskaden uden en kolesterolberiget diæt, ville være informativ, og vi vil overveje det til fremtidige undersøgelser. Ikke desto mindre demonstrerer dette arbejde en ny protokol for direkte ballonskade på aortaklappen i kaninmodellen, som er nyttig til at studere de patologiske mekanismer, der ligger til grund for AVS og potentielt kan bruges til at udvikle terapeutiske muligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære med dette værk.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIT) (nr. 2020R1A4A3079570), Undervisningsministeriet (nr. 2021R1I1A1A01051425) og Industrial Strategic Technology Development Program (nr. 20014873) finansieret af ministeriet for handel, industri og energi, Republikken Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580 (2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al.
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
