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Neuroscience

एक त्रि-आयामी निलंबन बायोरिएक्टर में मानव न्यूरोजेनिन 2-इंड्यूसेबल न्यूरॉन्स का उत्पादन

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65085
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 3, 1,4,5,6, 1,4
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering, Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology, Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Católica del Norte

Summary

यह लेख एक बेंचटॉप 3 डी निलंबन बायोरिएक्टर में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) से न्यूरोनल वंश कोशिकाओं की व्युत्पत्ति ने मस्तिष्क अनुसंधान में एक मील का पत्थर चिह्नित किया। उनके पहले आगमन के बाद से, प्रोटोकॉल को लगातार अनुकूलित किया गया है और अब अनुसंधान और दवा विकास में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन पारंपरिक भेदभाव और परिपक्वता प्रोटोकॉल की बहुत लंबी अवधि और उच्च गुणवत्ता वाले HIPSC और उनके तंत्रिका डेरिवेटिव की बढ़ती मांग बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इन प्रोटोकॉल को अपनाने, अनुकूलन और मानकीकरण की आवश्यकता को बढ़ाती है। यह काम आनुवंशिक रूप से संशोधित, डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल न्यूरोजेनिन 2 (आईएनजीएन 2) के भेदभाव के लिए एक तेज और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है - एक बेंचटॉप त्रि-आयामी (3 डी) निलंबन बायोरिएक्टर का उपयोग करके न्यूरॉन्स में एचआईपीएससी व्यक्त करता है।

संक्षेप में, iNGN2-HIPSC के एकल-कोशिका निलंबन को 24 घंटे के भीतर समुच्चय बनाने की अनुमति दी गई थी, और न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को डॉक्सीसाइक्लिन के अतिरिक्त प्रेरित किया गया था। प्रेरण के 2 दिनों के बाद समुच्चय को अलग कर दिया गया था और कोशिकाओं को टर्मिनल परिपक्वता के लिए या तो क्रायोसंरक्षित या फिर से चढ़ाया गया था। उत्पन्न आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स ने शास्त्रीय न्यूरोनल मार्करों को जल्दी व्यक्त किया और रीप्लेटिंग के बाद 1 सप्ताह के भीतर जटिल न्यूरिटिक नेटवर्क का गठन किया, जो न्यूरोनल संस्कृतियों की बढ़ती परिपक्वता का संकेत देता है। सारांश में, 3 डी वातावरण में एचआईपीएस-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की तेजी से पीढ़ी के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जो रोग मॉडलिंग, फेनोटाइपिक उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और बड़े पैमाने पर विषाक्तता परीक्षण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में बड़ी क्षमता रखता है।

Introduction

न्यूरोलॉजिकलविकार दुनिया भर में विकलांगता का प्रमुख कारण हैं। छह में से एक व्यक्ति प्रभावित होता है, और घटना बढ़ती जा रही है। समाजों और उनकी स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर संबंधित वित्तीय बोझ बहुत बड़ा है। 2010 में 30 यूरोपीय देशों के मूल्यांकन ने मानसिक औरन्यूरोलॉजिकल विकारों से संबंधित € 800 बिलियन की वार्षिक लागत का अनुमान लगाया। बढ़ते सामाजिक आर्थिक बोझ प्रभावी उपचार रणनीतियों की मांग करते हैं, और हालांकि रोग पैथोफिज़ियोलॉजी की हमारी समझ में काफी वृद्धि हुई है, क्लीनिकों में अनुवाद अक्सर अपर्याप्त होता है। सामान्य तौर पर, केवल 12% फार्मास्यूटिकल्स नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करते हैं, जिनमें से 80% से अधिक बाद के चरणों के दौरान विफल हो जाते हैं, मुख्य रूप से अक्षमता या अप्रत्याशित विषाक्तताके कारण 3,4। कारण अलग-अलग हैं, लेकिन प्रीक्लिनिकल चरणों में पशु परीक्षण से मानव परीक्षणों तक सीमित हस्तांतरणीयता तेजी से सामने आईहै। मानव इन विट्रो सेल और ऊतक मॉडल अंतर-प्रजाति अनुवाद की खाई को पाट सकते हैं, और मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) प्रौद्योगिकी में प्रगति में इस संबंध में बड़ी क्षमता है। HIPSC का व्यापक रूप से बुनियादी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के साथ आवश्यक विशेषताओं को साझा करता है, जैसे कि लगभग असीमित आत्म-नवीकरण क्षमता और भ्रूण विनाश से जुड़ी नैतिक चिंताओं को दरकिनार करते हुए सभी तीन रोगाणु परतों6 में अंतर करने की क्षमता।

एचईएससी से न्यूरोनल कोशिकाओं की व्युत्पत्ति, और बाद में एचआईपीएससी ने मस्तिष्क अनुसंधान में एक मील का पत्थर चिह्नित किया। प्रारंभिक भेदभाव प्रोटोकॉल भ्रूणजनन के दौरान महत्वपूर्ण चरणों की नकल करने वाले विकास कारकों के अनुप्रयोग पर आधारित थे, उनमें से अधिकांश में दोहरे एसएमएडी निषेध या तो निलंबन याअनुयायी संस्कृतियों 7,8,9 में शामिल थे। परिपक्व न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक उत्पन्न हुए हैं, लेकिन इन प्रोटोकॉल की कई कमियां अभी भी दवा के विकास में उनके व्यापक उपयोग में बाधा डालती हैं, जैसे कि उत्पन्न न्यूरॉन्स की कम उपज और उच्च बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता, साथ ही साथ लंबे संस्कृति समय से संबंधित व्यापक कार्यभार। न्यूरोजेनेसिस में गंभीर रूप से शामिल प्रतिलेखन कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा सुधार हासिल किए गए हैं, और न्यूरोजेनिन (एनजीएन) परिवार के सदस्यों, विशेष रूप से एनजीएन 2, को प्रभावी ड्राइवरोंके रूप में पहचाना गया है। HIPSC में NGN2 की लेंटिवायरल-मध्यस्थता एक्टोपिक अभिव्यक्ति ने न्यूरोनल भेदभाव के शुरुआती चरणों को काफी तेज कर दिया, और केवल 1 सप्ताह11 के भीतर न्यूरोनल सेल भाग्य को प्रेरित किया। एस्ट्रोसाइट्स के साथ सह-संस्कृतियों में बाद में टर्मिनल परिपक्वता ने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणों के साथ उच्च शुद्धता और मात्रा में कार्यात्मक न्यूरॉन्स उत्पन्न किए। एडेनो-संबद्ध वायरस एकीकरण साइट 1 (एएवीएस 1) सुरक्षित-बंदरगाह लोकस के साइट-निर्देशित जीन-संपादन को तब एनजीएन 212,13 के लिए एक स्थिर और डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल अभिव्यक्ति कैसेट के साथ हाईपीएससी लाइनों को बनाने के लिए लागू किया गया था, इस प्रकार लेंटीवायरल डिलीवरी के अवांछित दुष्प्रभावों को कम किया गया था।

डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल न्यूरोजेनिन 2 (आईएनजीएन 2) न्यूरॉन्स का मजबूत और कुशल भेदभाव उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिक दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परख10,14,15 के लिए बहुत क्षमता रखता है; और पिछले दशक के दौरान एक स्केलेबल सेल विस्तार और विभेदन16,17,18,19 के लिए बायोरिएक्टर को लागू करने में बायोप्रोसेसिंग में पर्याप्त प्रगति हुई है। हालांकि, अधिकांश भेदभाव प्रोटोकॉल अनुयायी संस्कृतियों के लिए अनुकूलित हैं, और तीन-आयामी (3 डी) वातावरण में अनुवाद के लिए अक्सर आवश्यक संशोधनों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, कम कतरनी तनाव सुविधाओं के साथ एक बेंचटॉप 3 डी बायोरिएक्टर का सफल उपयोग एचपीएससी के विस्तार और हेपेटोसाइट्स, कार्डियोमायोसाइट्स और न्यूरॉन्स20 में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भेदभाव के लिए रिपोर्ट किया गया है। यहां, समान बेंचटॉप 3 डी बायोरिएक्टर का उपयोग करके आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की पीढ़ी और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है।

Protocol

नोट: सभी सेल जोड़तोड़, साथ ही संस्कृति व्यंजन और मध्यम तैयारी, बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। लैमिनर फ्लो हुड को उपयोग से पहले और प्रसंस्करण के बाद 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों को पोंछकर अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए। वर्णित प्रोटोकॉल को सीईआरओ 3 डी इनक्यूबेटर और बायोरिएक्टर में न्यूरोनल भेदभाव के लिए अनुकूलित किया गया है (निम्नलिखित में बेंचटॉप बायोरिएक्टर के रूप में जाना जाता है)। यह बेंचटॉप बायोरिएक्टर विशेष बायोरिएक्टर ट्यूबों के लिए चार स्लॉट प्रदान करता है, जिनमें से प्रत्येक की अधिकतम क्षमता 50 एमएल है। तापमान और सीओ2 के स्तर को लगातार नियंत्रित किया जाता है, और खेती के मापदंडों (जैसे, घूर्णी गति और समय) को प्रत्येक ट्यूब के लिए स्वतंत्र रूप से विनियमित किया जाता है। सभी आकांक्षा चरणों को एक आकांक्षा पिपेट और वैक्यूम पंप का उपयोग करके किया गया है, यदि अन्यथा नहीं कहा गया है।

1. HIPSC का संवर्धन और विस्तार

नोट: इस प्रोटोकॉल में इंजीनियर डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल एनजीएन 2 एचपीएससी लाइन बायोनी010-सी -13 का उपयोग किया जाता है। यहां प्रदान किए गए विस्तार प्रोटोकॉल को 6 सेमी पेट्री व्यंजनों के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन यदि पसंद किया जाए तो वैकल्पिक संस्कृति प्रारूपों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. ठंडे डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम)/एफ12 (-/-) में 0.083 मिलीग्राम/एमएल/10 सेमी2 की अंतिम सांद्रता पर तहखाने की झिल्ली मैट्रिक्स के साथ 6 सेमी पेट्री व्यंजन कोट करें। कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लेपित व्यंजनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल निर्माता के निर्देशों में पाया जा सकता है। विस्तार के लिए वैकल्पिक बाह्य मैट्रिक्स पर एचआईपीएससी को सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  2. फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम + 10 μM रॉक अवरोधक (वाई -27632) में EBiSC सेल लाइन उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल21 के अनुसार पिघलाव क्रायोसंरक्षित HIPSC। प्रति 60 मिमी डिश में 1 ×10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व की सिफारिश की जाती है।
  3. अगले दिन माध्यम को रॉक अवरोधक के बिना फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम में बदलें, और दैनिक मीडिया परिवर्तन करें।
  4. जब HIPSC संस्कृतियां 60% -80% के संगम तक पहुंच जाती हैं तो पासिंग शुरू करें। विभेदित क्षेत्रों की जांच करें और यदि क्षेत्र 5% से अधिक हो तो कॉलोनियों को मैन्युअल रूप से साफ करें।
    नोट: अविभाजित HIPSC एक प्रमुख न्यूक्लियोलस और कम साइटोप्लाज्म के साथ गोल कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं। सपाट और कसकर भरी हुई कॉलोनियां पिघलने या गुजरने के बाद जल्दी बनती हैं। HIPSC संस्कृतियों की अनुकरणीय उज्ज्वल क्षेत्र छवियां चित्रा 1 में दिखाई गई हैं। अधिक जानकारी EBiSC सेल लाइन उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल21 में प्रदान की गई है। पासिंग के लिए, बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन और फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम तैयार करें।
  5. एचआईपीएस संस्कृतियों से माध्यम को एस्पिरेट करें और 1x डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) में सीए 2 + और एमजी2 + (डीपीएस [-/-] के बिना 0.5 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ कोशिकाओं को 2x कुल्ला करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 6 सेमी पेट्री व्यंजनों में 1x DPBS (-/-) में 0.5 mM EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर में 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  7. ईडीटीए समाधान के 1.5 एमएल को एस्पिरेट करें और 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेशन जारी रखें।
  8. सेल डिटेचमेंट की सुविधा के लिए धीरे से व्यंजनों को टैप करें।
    नोट: दृश्य मूल्यांकन द्वारा अलगाव की जांच करें। HIPSC कॉलोनियों को 5 मिनट के बाद अलग होना शुरू कर देना चाहिए, लेकिन उच्च कॉन्फ्लुएंट HIPSC संस्कृतियों के साथ लंबे समय इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता हो सकती है। यदि कॉलोनियां अलग नहीं होती हैं, तो इनक्यूबेशन समय को 10 मिनट तक बढ़ाएं, लेकिन इस समय सीमा से अधिक न करें।
  9. 6 सेमी पेट्री व्यंजनों में फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और धीरे से 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ या वाइड-बोर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके कॉलोनियों को 2x को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: HIPSC यांत्रिक तनाव के प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं; इस प्रकार, कई निलंबन से बचा जाना चाहिए। अंतिम सेल निलंबन में छोटे कॉलोनी टुकड़े (50-200 μm) शामिल होने चाहिए।
  10. लेपित संस्कृति व्यंजनों से सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें, और प्रति 6 सेमी डिश में 4 एमएल फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम तैयार करें।
  11. छोटी कॉलोनी के टुकड़ों को 1: 10 से 1: 40 के विभाजित अनुपात में ताजा तैयार संस्कृति व्यंजनों में स्थानांतरित करें, और दैनिक मीडिया परिवर्तनों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर खेती करें।
    नोट: छोटी कॉलोनियों को पासिंग के बाद 1 या 2 घंटे के भीतर संलग्न करना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल संस्कृतियों की आकृति विज्ञान। (ए, बी) विभिन्न संगमों की अच्छी गुणवत्ता वाली एचआईपीएस संस्कृतियां एक समरूप आकृति विज्ञान और परिभाषित किनारों के साथ कॉम्पैक्ट एचआईपीएससी कॉलोनियों को दिखाती हैं। (सी) कॉलोनी के किनारों के चारों ओर विभेदित कोशिकाओं के उभरते समूहों के साथ एचआईपीएस संस्कृति (डैश्ड व्हाइट लाइन)। स्केल बार = 200 μm। संक्षिप्त नाम: HIPSC = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. बेंचटॉप बायोरिएक्टर प्रणाली (दिन -2) में एचआईपीएससी की पूर्व खेती

नोट: जब HIPSC संस्कृतियां 60% और 80% के बीच संगम तक पहुंचती हैं तो प्रीकल्टीवेशन शुरू करें। विभेदित क्षेत्रों के लिए HIPSC कॉलोनियों की जाँच करें। इस प्रीकल्टीवेशन चरण के दौरान, एचआईपीएससी को 2 दिनों के लिए फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम में बनाए रखा जाता है।

  1. संस्कृति मीडिया तैयार करें, जिसमें फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम और 10 μM रॉक अवरोधक (Y-27632) शामिल हैं।
  2. माध्यम को पूरी तरह से HIPSC से अलग करें और धीरे से 1x DPBS (-/-) के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला करें।
  3. 6 सेमी पेट्री व्यंजनों में 2.0 एमएल प्रीवार्म्ड ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान जोड़ें और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. सेल डिटेचमेंट को सुविधाजनक बनाने के लिए धीरे से व्यंजनों को टैप करें, या 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम + रॉक अवरोधक प्रति डिश के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल सस्पेंशन को 15 एमएल या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेल सिंगुलराइजेशन सुनिश्चित करने के लिए पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
  6. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल निलंबन के 100 μL में सेल संख्या निर्धारित करें जैसा कि पहले वर्णित20 है। प्रति बायोरिएक्टर ट्यूब 15 ×10 6 कोशिकाओं के लिए संबंधित मात्रा को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम + रॉक अवरोधक के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब को 18 एमएल मध्यम (सेल सीडिंग घनत्व 0.75 × 106 सेल / एमएल) के साथ भरें। सेल निलंबन को बायोरिएक्टर ट्यूबों (20 एमएल प्रति ट्यूब) में वितरित करें।
  10. ट्यूबों को बायोरिएक्टर सिस्टम में रखें। निम्नलिखित खेती पैरामीटर सेट करें: 2 एस रोटेशन अवधि, 60 आरपीएम रोटेशन गति, कोई आंदोलन विराम नहीं, 37 डिग्री सेल्सियस, और असीमित अवधि20 के लिए 5% सीओ2।
  11. बायोरिएक्टर डिस्प्ले के माध्यम से खेती कार्यक्रम शुरू करें।
  12. अगले दिन मीडिया को बदल दें। समुच्चय को ~ 5 मिनट के लिए बायोरिएक्टर ट्यूबों में व्यवस्थित होने दें। सतह पर तैरने वाले को ध्यान से घुमाएं।
    नोट: समुच्चय को 10 मिनट से अधिक समय तक व्यवस्थित न होने दें, क्योंकि वे एक-दूसरे से चिपक सकते हैं और एक विषम समग्र निलंबन का निर्माण कर सकते हैं। बायोरिएक्टर ट्यूब में ~ 5 एमएल कल्चर माध्यम छोड़ने की सिफारिश की जाती है।
  13. प्रति ट्यूब रॉक अवरोधक के बिना ताजा फीडर-मुक्त आईपीएससी रखरखाव माध्यम के 15 एमएल जोड़ें, और 24 घंटे के लिए बेंचटॉप बायोरिएक्टर में खेती जारी रखें।

3. प्रारंभिक न्यूरॉन्स में HIPSC का भेदभाव (दिन 0)

  1. न्यूरोबेसल माध्यम (एनबीएम) तैयार करें: स्थिर एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड के साथ 50% डीएमईएम / एफ -12, 50% न्यूरोबेसल माध्यम, 0.5 x सीरम-मुक्त पूरक (50x), बोटेंस्टीन के एन -1 फॉर्मूलेशन (100x) के आधार पर 0.5x सीरम-मुक्त पूरक, 0.5x स्थिर एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड, 0.5x एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (100x), 500 nM सोडियम पाइरूवेट (100x), 500 mM सोडियम पाइरूवेट (100x), 50x सीरम मुक्त पूरक (100x), 0.5x स्थिर L-alanyl-L-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड, 0.5x स्थिर L-alanyl-L-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड, 0.5x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (100x), 500 nM सोडियम पाइरूवेट (100x), 500 nM सोडियम पाइरूवेट (100x), 500 mM
    नोट: एनबीएम को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और 2 सप्ताह तक उपयोग किया जा सकता है।
  2. एचआईपीएससी संस्कृतियों में डॉक्सीसाइक्लिन (डीओएक्स) जोड़कर न्यूरोनल भेदभाव शुरू करें। इसके लिए, समुच्चय को बायोरिएक्टर ट्यूबों में बसने दें। ट्यूब में ~ 5 एमएल छोड़ते हुए, कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें, और एनबीएम और 2 μg / mL DOX से युक्त 35 mL तंत्रिका प्रेरण माध्यम (NIM) जोड़ें।
    नोट: चूंकि डीओएक्स प्रकाश-संवेदनशील है, इसलिए काम करते समय प्रकाश को बंद करने की सिफारिश की जाती है।
  3. ट्यूबों को बेंचटॉप बायोरिएक्टर में वापस रखें और खेती जारी रखें।
  4. चरण 3.2 में वर्णित 2 दिनों के लिए हर दिन मीडिया परिवर्तन करें।
    नोट: निलंबन संस्कृति में 4 दिनों के बाद, समुच्चय को अलग किया जा सकता है, और प्रारंभिक न्यूरॉन्स को टर्मिनल परिपक्वता के लिए क्रायोसंरक्षित या सीधे पुन: चढ़ाया जा सकता है।

4. प्रारंभिक न्यूरॉन्स का क्रायोप्रिजर्वेशन (दिन 2)।

नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन की आवश्यकता नहीं है और भेदभाव प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन अत्यधिक अनुशंसित है क्योंकि शुरुआती न्यूरॉन्स के बड़े स्टॉक का उत्पादन किया जा सकता है और बाद में परिपक्वता और विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

  1. समुच्चय को बायोरिएक्टर ट्यूब में व्यवस्थित होने दें। जैसा कि पहले वर्णित किया गया है, सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
  2. समुच्चय को एक बाँझ 15 एमएल या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और धीरे से 1x DPBS (-/-) के साथ 2x समुच्चय को कुल्ला करें। समुच्चय को परेशान किए बिना जितना संभव हो सके सतह पर तैरने वाले को ध्यान से घुमाएं।
  3. गोली के आकार के आधार पर प्रीवार्म्ड सेल पृथक्करण एंजाइम के 2-5 एमएल जोड़ें, और पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। धीरे-धीरे हर 2 मिनट में तलछट समुच्चय को फिर से निलंबित करें जब तक कि समुच्चय अलग न हो जाएं।
    नोट: एक लगभग समरूप सेल निलंबन 7-10 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद प्राप्त किया जाना चाहिए।
  4. प्रीवार्म्ड एनबीएम माध्यम की ट्रिपल मात्रा जोड़ें और सेल एकवचन सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  5. सेल संख्या निर्धारित करें और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए संबंधित मात्रा को 15 एमएल या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: फ्रीजिंग माध्यम के 5-10 ×10 6 सेल / एमएल के सेल घनत्व की सिफारिश की जाती है।
  6. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) युक्त फ्रीजिंग माध्यम की इसी मात्रा में सेल गोली को धीरे से पुन: निलंबित करें।
  8. क्रायोप्रिजर्वेशन (1 एमएल / शीशी) के लिए उपयुक्त शीशियों में सेल निलंबन का विश्लेषण करें।
  9. शीशियों को तुरंत 2-प्रोपेनोल से भरे एक प्रीचिल्ड, धीमी गति से फ्रीजिंग कंटेनर में स्थानांतरित करें और कंटेनर को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। लंबे समय तक भंडारण के लिए अगले दिन शीशियों को -150 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: तरल 2-प्रोपेनोल अत्यधिक ज्वलनशील है और संपर्क पर आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। गर्मी से दूर रखें और सुरक्षात्मक दस्ताने के साथ-साथ चश्मा भी पहनें।

5. मोनोलेयर संस्कृतियों में एचआईपीएस-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की परिपक्वता

  1. एचआईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की दीर्घकालिक खेती के लिए पॉली-एल-ऑर्निथिन/ लैमिनिन-लेपित संस्कृति व्यंजन तैयार करें।
    1. पॉली-एल-ऑर्निथिन स्टॉक समाधान को 1x DPBS (-/-) में 0.001% तक पतला करें और व्यंजनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर या 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए कोट करें। पॉली-एल-ऑर्निथिन घोल को एस्पिरेट करें और प्लेटों को 1x DPBS (-/-) के साथ एक बार धो लें।
    2. 1x DPBS (-/-) में लैमिनिन घोल को 10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर या 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए व्यंजन ों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: कोटिंग प्रक्रियाओं के लिए 0.1-0.15 एमएल प्रति सेमी 2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है, और सभी संबंधित धोने के चरणों के लिए 0.2 एमएल प्रति सेमी2। वैकल्पिक कोटिंग सब्सट्रेट्स का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन सेल लगाव और परिपक्वता पर संभावित प्रभावों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  2. क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं को पिघलाएं। इसके लिए, क्रायोवियल को पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस पर सेट) में रखें और इसे लगभग 1 मिनट तक घुमाएं, जब तक कि जमे हुए सेल निलंबन का एक छोटा सा झुरमुट न रह जाए।
  3. सेल सस्पेंशन ड्रॉपवाइज को सावधानीपूर्वक 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जो 10 एमएल प्रीवार्म्ड एनबीएम के साथ तैयार किया गया है। क्रायोवियल को 1 एमएल एनबीएम के साथ कुल्ला करें और सेल सस्पेंशन को समान 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और 10 μM ROCK अवरोधक के साथ पूरक एनआईएम के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. सेल गोली को सावधानी से पुन: निलंबित करें और सेल संख्या निर्धारित करें।
  7. लेपित सेल कल्चर व्यंजनों से शेष लैमिनिन घोल को एस्पिरेट करें और एनआईएम में 1 × 105 कोशिकाओं / सेमी2 के सीडिंग घनत्व पर कोशिकाओं को 10 μM रॉक अवरोधक के साथ पूरक करें।
  8. रॉक अवरोधक के बिना 24 घंटे के बाद माध्यम को एनआईएम में स्विच करें।
  9. 4 दिनों के लिए दैनिक मध्यम परिवर्तन करें।
  10. एनजीएन 2 प्रेरण के इस प्रारंभिक चरण के बाद, डीओएक्स को छोड़ दें और एनबीएम में कोशिकाओं को कल्चर करें, परिपक्वता के वांछित चरण तक पहुंचने तक सप्ताह में 2 गुना आधा-मीडिया परिवर्तन होता है।
    नोट: एस्ट्रोसाइट्स के साथ iNGN2 न्यूरॉन्स के सह-संवर्धन को सेल अस्तित्व, लगाव, परिपक्वता और विद्युत गतिविधि13,22 को बढ़ाने की सिफारिश की जाती है।

6. एचआईपीएस-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का लक्षण वर्णन।

नोट: न्यूरोनल डेरिवेटिव में भेदभाव का मूल्यांकन निम्नलिखित तकनीकों द्वारा किया जा सकता है।

  1. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और इमेजिंग
    1. हाइपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स से माध्यम को एस्पिरेट करें और सीए 2 + और एमजी2 + (+ /+) के साथ 1 x डीपीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
      नोट: पिपेट सावधानीपूर्वक, अधिमानतः अच्छी तरह से किनारों पर क्योंकि कोशिकाएं सतह से बहुत आसानी से अलग हो सकती हैं। 1x DPBS (+/+) के साथ कोशिकाओं का पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करने के लिए सभी धोने के चरणों के लिए 0.2 mL प्रति सेमी2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए डीपीबीएस (+/+) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड युक्त निर्धारण समाधान का उपयोग करके न्यूरोनल कोशिकाओं को ठीक करें। 0.1 एमएल प्रति सेमी2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
      नोट: डीपीबीएस में पैराफॉर्मलडिहाइड (4%) तीव्र विषाक्तता और संभावित कार्सिनोजेनिकता के साथ एक खतरनाक और त्वचा परेशान करने वाला समाधान है। गर्मी से दूर रखें, सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पहनें, साँस लेने से बचें, और घोल का उपयोग केवल हवादार वातावरण में करें।
    3. धीरे से 1x DPBS (+/+) में 2x कोशिकाओं को कुल्ला करें और धुंधला होने के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: फिक्स्ड सेल को डीपीबीएस (+/+) में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक आगे की प्रक्रिया तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. नमूने से डीपीबीएस (+/+) को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं को स्थिर करें और आरटी पर 60 मिनट के लिए 1x DPBS (+/+) के साथ गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करें जिसमें 1% बीएसए और 0.2% ट्राइटन-एक्स -100 शामिल हैं।
      नोट: 0.2 एमएल प्रति सेमी2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    5. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें, जिसमें संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला बफर (1x DPBS [+/+] जिसमें 1% बीएसए होता है) में पतला होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर किया गया है।
      नोट: 0.1-0.15 एमएल प्रति सेमी2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    6. धुंधला बफर को एस्पिरेट करें और 1x DPBS (+/+) में 3x कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    7. 1: 1,000 की अंतिम एकाग्रता पर बफर को धुंधला करने में संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें।
    8. अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए पतला एंटीबॉडी समाधान में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर किया गया है।
      नोट: 0.1-0.15 एमएल प्रति सेमी2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    9. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और 1x DPBS (+/+) में कोशिकाओं को 2x कुल्ला करें।
    10. 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) के साथ नाभिक को काउंटरस्टेन करें, आरटी पर 5 मिनट के लिए डीपीबीएस (+/+) में पतला करें।
      नोट: 0.1-0.15 एमएल प्रति सेमी2 की कार्यशील मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    11. 1x DPBS (+/+) में कोशिकाओं को 2x कुल्ला करें।
    12. इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर डीपीबीएस (+/+) में कोशिकाओं को स्टोर करें।
      नोट: ब्राइटफील्ड इमेजिंग रूपात्मक परिवर्तन और न्यूराइट आउटग्रोथ को ट्रैक करने के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, स्टीरियोटाइपिक मार्कर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। जबकि उदासीन HIPSC OCT 3/4 और NANOG को व्यक्त करते हैं, बीटा-III-ट्यूबुलिन (TUBB3) और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) न्यूरॉइट्स और अक्षतंतु की कल्पना के लिए न्यूरोनल मार्कर के रूप में काम कर सकते हैं। ब्राइटफील्ड या फ्लोरोसेंट छवियों में न्यूराइट लंबाई का निर्धारण करके न्यूरिटिक नेटवर्क का आगे मूल्यांकन किया जा सकता है।
  2. मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
    1. माध्यम को एस्पिरेट करें और 1x DPBS (-/-) में एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें।
      नोट: 0.2 एमएल प्रति सेमी2 की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    2. ठंडा आरएनए लाइसिस बफर जोड़ें और खरोंच करके कोशिकाओं की कटाई करें।
    3. एक उपयुक्त कॉलम-आधारित किट का उपयोग करके आरएनए को अलग करें, और यूवी फोटोस्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आरएनए सांद्रता निर्धारित करें।
    4. कुल आरएनए के 250 एनजी और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए एक उपयुक्त किट का उपयोग करके सीडीएनए उत्पन्न करें।
    5. डुप्लिकेट में 2.5 एनजी सीडीएनए युक्त आणविक बीकन क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाएं तैयार करें। एक उपयुक्त मास्टर मिश्रण और संबंधित प्राइमर परख20 का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. 20 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एनीलिंग के साथ 45 चक्र लागू करके क्यूपीसीआर चलाएं।
    7. हाउसकीपिंग जीन जीएपीडीएच, एचपीआरटी 1 और जीयूएसबी के औसत से सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य करें। कैलिब्रेटर के रूप में अविभाजित HIPSC का उपयोग करते हुए, त्रिभुज विधि23 को लागू करें।

Representative Results

प्रारंभिक चरणों के दौरान, HIPSC की अनुयायी संस्कृतियों को अलग, एकवचन किया जाता है, और निलंबन में स्थानांतरित किया जाता है (चित्रा 2)। समुच्चय 24 घंटे के भीतर बनते हैं और लगातार आकार में बढ़ते हैं। ट्रांसजेन प्रेरण के 2 दिनों के बाद, शुरुआती न्यूरॉन्स को बाद के प्रयोगों के लिए क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है।

निलंबन में शुरुआती दिनों के दौरान लगातार प्रसार सेल संख्या में वृद्धि करता है, प्रेरण के 2 दिनों के बाद अपने चरम पर पहुंच जाता है (चित्रा 3 ए, बी)। प्रसार के साथ, समुच्चय बढ़ने लगते हैं। दिन 0 की तुलना में, व्यास दिन 2 पर 50% की वृद्धि दिखाता है, और दिन 5 पर लगभग दोगुना हो जाता है (चित्रा 3 डी)। यद्यपि एक बढ़ता हुआ व्यास समुच्चय के अंदर पोषक तत्वों की आपूर्ति को सीमित करता है, कोशिकाओं की व्यवहार्यता दिन 2 या भेदभाव के दिन 5 पर प्रभावित नहीं होती है (चित्रा 3 सी)। हालांकि, निलंबन में 4 दिनों से अधिक समय तक लंबे समय तक खेती सेल उपज में और सुधार नहीं करती है, क्योंकि समुच्चय एंजाइमेटिक एकवचन (चित्रा 3 बी) के लिए तेजी से प्रतिरोधी हो जाते हैं।

क्रायोप्रिजर्वेशन पर, दिन 2 कोशिकाओं को पिघलाया जाता है और टर्मिनल परिपक्वता के लिए पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ)-लैमिनिन-लेपित व्यंजनों पर चढ़ाया जाता है। सामान्य तौर पर, कोशिकाएं पिघलने के बाद बहुत अच्छी तरह से संलग्न होती हैं, और जल्दी से न्यूरॉइट्स का विस्तार करना शुरू कर देती हैं। टेम्पोरल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, साथ ही न्यूरोनल मार्कर टीयूबीबी 3 और एमएपी 2 के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधलापन, न्यूरोनल सेल पहचान (चित्रा 4 ए, बी) की पुष्टि करता है। टीयूबीबी 3 और एमएपी 2 के बढ़ते स्तर के अलावा, न्यूरोनल संस्कृतियों को सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन ताऊ ट्रांसक्रिप्ट्स (एमएपीटी) में समृद्ध किया जाता है, जो अक्षतंतु स्थिरीकरण में शामिल एक न्यूरोनल प्रोटीन को एन्कोडिंग करता है, और प्लुरिपोटेंसी-विनियमन प्रतिलेखन कारक पीओयू 5 एफ 1 की अभिव्यक्ति में सहवर्ती गिरावट दिखाता है। इसके अलावा, पिघलने के बाद पहले सप्ताह के भीतर एक घने न्यूरिटिक नेटवर्क का गठन होता है (चित्रा 4 सी)। ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के साथ संयोजन में ये रूपात्मक परिवर्तन, न्यूरोनल संस्कृतियों की बढ़ती परिपक्वता का सुझाव देते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: एक बेंचटॉप बायोरिएक्टर का उपयोग करके एचआईपीएस-व्युत्पन्न आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की पीढ़ी। (ए) सेल संस्कृति के प्रमुख चरणों पर प्रकाश डालते हुए भेदभाव प्रतिमान का योजनाबद्ध अवलोकन। (B-F) ब्राइटफील्ड छवियां (बी) एचपीएससी और (सी, डी) बेंचटॉप बायोरिएक्टर में समुच्चय के गठन की कल्पना करती हैं। (ई, एफ) आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स न्यूरॉइट्स का विस्तार करते हैं और भेदभाव के दौरान रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरते हैं। स्केल बार = 100 μm। संक्षेप: बीएमएम = तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स; आईपीएससी-एमएम = आईपीएससी रखरखाव माध्यम; पीएलओ = पॉली-एल-ऑर्निथिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कुल गठन और विकास के दौरान सेल उपज और व्यवहार्यता। (ए) ब्राइटफील्ड छवियां बेंचटॉप बायोरिएक्टर में संस्कृति के 2 दिनों के भीतर समुच्चय के गठन को दर्शाती हैं, साथ ही समय के साथ कुल आकार में वृद्धि भी दर्शाती हैं। स्केल बार = 500 μm. (B) सेल उपज का परिमाणीकरण और (C) विभेदन पाठ्यक्रम पर व्यवहार्यता। बार ग्राफ चार स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य + एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) व्यास, समुच्चय के आकार का संकेत, ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर इमेजजे (संस्करण 1.53) का उपयोग करके अर्ध-स्वचालित रूप से निर्धारित किया गया था। सबसे पहले, ब्राइटफील्ड छवियों को बाइनरी छवियों में परिवर्तित किया गया था, और फिर निम्नलिखित मापदंडों को लागू करते हुए विश्लेषण कण उपकरण का उपयोग करके आगे मूल्यांकन किया गया: आकार > 2,500 μm2, परिपत्रता 0.45-1, किनारों को छोड़कर, और छेद शामिल हैं। क्षैतिज रेखाएं पांच स्वतंत्र भेदभावों के औसत ± एसडी को इंगित करती हैं। एकल बिंदु प्रति समय बिंदु कम से कम 20 समुच्चय के साथ व्यक्तिगत भेदभाव प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: HIPSC-व्युत्पन्न iNGN2 न्यूरॉन्स का लक्षण वर्णन। न्यूरोनल जीन TUBB3, MAP2, और MAPT के साथ-साथ प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से जुड़े जीन POU5F1 के लिए अस्थायी जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल। सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को संदर्भ जीन जीएपीडीएच, एचपीआरटी 1 और जीयूएसबी के लिए सामान्यीकृत किया गया था। अविभाजित HIPSC (दिन -2) को कैलिब्रेटर के रूप में चुना गया था। ज्यामितीय प्रतीक चार स्वतंत्र भेदभावों के औसत ± एसडी को इंगित करते हैं। (बी) पिघलने (दिन -2 + 7) के बाद दिन 7 में आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छवियां, बीटा-III-ट्यूबुलिन (टीयूबीबी 3, मैजेंटा) और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2, सियान) के लिए दाग दिया गया। सेल नाभिक को DAPI के साथ प्रतिरूप किया गया था। स्केल बार = 100 μm. (C) पिघलने के बाद न्यूरोनल संस्कृतियों की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में न्यूरिटिक नेटवर्क का मूल्यांकन। न्यूरॉइट्स की कुल लंबाई इमेजजे (संस्करण 1.53) का उपयोग करके 930.82 × 698.11μm 2 के क्षेत्र में निर्धारित की गई थी। चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करने के बाद, छवियों को 8-बिट छवियों में परिवर्तित किया गया और रंगों को उल्टा कर दिया गया। न्यूरॉइट्स को बाद में कंकाल ीकृत किया गया और फिर क्रमशः इमेजजे प्लगइन्स 'स्केलेटनेज' और 'एनालाइज स्केलेटन' का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। न्यूरॉइट्स की कुल लंबाई को औसत न्यूराइट लंबाई / सेल प्राप्त करने के लिए रुचि के क्षेत्र में सोम की संख्या से विभाजित किया गया था। बार ग्राफ ़ तीन स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य + एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिललिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

न्यूरोनल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनजीएन 2 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति को पहले न्यूरोनल भेदभाव के शुरुआती चरणों में तेजी लाने और खेती के 1 सप्ताह के भीतर एचआईपीएससी में न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। यह काम एक बेंचटॉप बायोरिएक्टर का उपयोग करके जीन-संपादित बायोनी010-सी -13 एचआईपीएससी को आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स में भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

सीईआरओ 3 डी बायोरिएक्टर एक कम मात्रा वाला बायोरिएक्टर है जिसमें विशेष ट्यूबों के लिए चार स्लॉट हैं, जिनमें से प्रत्येक की अधिकतम क्षमता 50 एमएल है। तापमान और सीओ2 स्तरों को लगातार नियंत्रित किया जाता है और प्रत्येक ट्यूब के लिए खेती के मापदंडों (जैसे, घूर्णी गति और समय) को विनियमित किया जाता है, जो स्वतंत्र रूप से उपयोगकर्ताओं को समानांतर में कई भेदभाव दृष्टिकोण चलाने में सक्षम बनाता है। आंतरिक ट्यूब की दीवार पर एकीकृत वेवब्रेकर कम कतरनी तनाव के साथ माध्यम के गड़बड़ी की अनुमति देते हैं और नियंत्रित रोटेशन के दौरान निलंबन में 3 डी समुच्चय बनाए रखते हैं। पोषक तत्वों तक सीमित पहुंच, साथ ही लागू 3 डी सेल-सेल और सेल-एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) इंटरैक्शन, सेलुलर भेदभाव और व्यवहार24,25,26,27 को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं।

निलंबन में 3 डी समुच्चय के रूप में कोशिकाओं का संवर्धन इन सेल इंटरैक्शन को बढ़ाता है, जिससे ऊतक या अंगों के विवो वातावरण की अधिक बारीकी से नकल की जाती है। माध्यम का सहवर्ती क्षोभ यांत्रिक घर्षण के कारण कुल आकार को नियंत्रित करता है, गैस विनिमय में सुधार करता है, और ट्यूब में पोषक तत्वों और अपशिष्ट की ढाल को कम करता है, जबकि समुच्चय 29,30,31,32,33,34 के अंदर शारीरिक प्रासंगिक ग्रेडिएंट को संरक्षित करता है।. यद्यपि मध्यम परिवर्तन मैन्युअल रूप से किए जाते हैं, बेंचटॉप बायोरिएक्टर स्थिर संस्कृति फ्लास्क की तुलना में श्रम और परिचालन लागत को कम करता है। बायोरिएक्टर पूरी तरह से स्वचालित स्टर-टैंक बायोरिएक्टर पर कई फायदे भी प्रदान करता है, क्योंकि इम्पेलर मुक्त डिजाइन समग्र सतह पर हाइड्रोडायनामिक कतरनी तनाव को कम करता है, जिससे न केवल सेल अस्तित्व में सुधार होता है, बल्कि संवेदनशील आईपीएससी, सेल भेदभाव और फ़ंक्शन35,36,37,38 पर कतरनी तनाव के प्रभाव को भी सीमित किया जाता है।

ऊर्ध्वाधर पहिया बायोरिएक्टर, जिसमें कोशिकाओं को एक बड़े ऊर्ध्वाधर इम्पेलर द्वारा उत्तेजित किया जाता है, साथ ही मोटर चालित प्लेटफॉर्म से जुड़े फुलाए गए कल्चर बैग का उपयोग करके रॉकिंग मोशन बायोरिएक्टर, वैकल्पिक 3 डी निलंबन प्लेटफार्मों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि HIPSC 17,18,19,39,40 की खेती के लिए अत्यधिक परीक्षण किया गया है, न्यूरोनल भेदभाव दृष्टिकोण में उनकी प्रयोज्यता के बारे में बहुत कम जानकारी है, और रिपोर्ट स्टिर-टैंक बायोरिएक्टर 41,42,43,44 में स्तनधारी और मानव तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के सफल विस्तार तक सीमित हैं, जिसमें दुर्लभ संख्या में अध्ययन ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। परिपक्वता44,45. सामान्य तौर पर, स्वचालित 3 डी निलंबन प्लेटफ़ॉर्म पूरी तरह से स्वचालित और कंप्यूटर-नियंत्रित माध्यम परिवर्तनों का लाभ प्रदान करते हैं, जिससे संदूषण के जोखिम को संभालने और कम करने में भिन्नता कम हो जाती है। इसके अलावा, लैक्टेट और ग्लूकोज एकाग्रता जैसे पोषक तत्व मापदंडों की लगातार निगरानी की जा सकती है। हालांकि, इन प्रणालियों की स्थापना के लिए अक्सर एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक निवेश, प्रयोगशाला स्थान और योग्य कर्मियों के प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। बेंचटॉप बायोरिएक्टर निलंबन में कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक कॉम्पैक्ट और उपयोग में आसान विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन पोषक तत्वों की समवर्ती निगरानी प्रदान नहीं करता है।

3 डी निलंबन प्लेटफार्मों में कोशिकाओं की खेती के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश प्रोटोकॉल के रूप में, समुच्चय का प्रारंभिक गठन एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। HIPSC को अनुयायी मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है और बाद में एकल-सेल निलंबन के रूप में 3 D वातावरण में स्थानांतरित किया जाता है। उस स्तर पर सेल हानि को कम करने के लिए, कई पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। एकीकृत वेवब्रेकर के साथ ट्यूबों के डिजाइन का मतलब है कि इष्टतम मध्यम गड़बड़ी सुनिश्चित करने के लिए प्रति ट्यूब 10 एमएल की न्यूनतम संस्कृति मात्रा की आवश्यकता होती है। इसलिए महत्वपूर्ण मात्रा को लंबी अवधि में कम नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कल्चर वॉल्यूम के प्रति 10 एमएल में 7.5 मिलियन कोशिकाओं का शुरुआती सीडिंग घनत्व, और 60 आरपीएम की घूर्णी गति, अल्पावधि में स्थिर समुच्चय बनाने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है, हालांकि अनुकूलन सेल लाइन पर निर्भर हो सकते हैं।

HIPSC को निलंबन में स्थानांतरित करने के बाद, 24 घंटे के भीतर समुच्चय का गठन किया जाना चाहिए। पहला मध्यम परिवर्तन महत्वपूर्ण है, क्योंकि समुच्चय छोटे हैं और ठीक से व्यवस्थित नहीं हो सकते हैं। समुच्चय के अवसादन के लिए समय बढ़ाया जा सकता है लेकिन 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि समुच्चय एक विषम तरीके से टकराना और बढ़ना शुरू कर सकते हैं। आकांक्षा के दौरान, ट्यूब में 5 एमएल की न्यूनतम संस्कृति मात्रा छोड़ी जानी चाहिए, और माध्यम के किसी भी गड़बड़ी से बचा जाना चाहिए। फिर भी, प्रारंभिक चरणों के दौरान कोशिकाओं और समुच्चय के नुकसान की उम्मीद की जाती है। सेल की गिनती संस्कृति में पहले 2 दिनों में एक निरंतर सेल उपज का संकेत देती है, यह दर्शाता है कि एचपीएससी की उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमता प्रारंभिक सेल हानि की भरपाई करती है। एक बार निलंबन में, कोमल खेती और गड़बड़ी समरूप आकार के समुच्चय की ओर ले जाती है जो समय के साथ बढ़ने लगते हैं।

न्यूरोनल भेदभाव डॉक्सीसाइक्लिन-प्रेरित एनजीएन 2 ओवरएक्प्रेशन13 के आधार पर पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था, और व्यक्तिगत चरणों को 3 डी खेती के लिए अनुकूलित किया गया था। न्यूरोनल ट्रांसक्रिप्शन कारक एनजीएन 2 न्यूरोनल भेदभाव में एक अच्छी तरह से वर्णित चालक है और न्यूरोनल प्रेरण को काफी तेज करता है11,13,46। जबकि परिभाषित विकास कारकों के साथ पारंपरिक पैटर्निंग में कई हफ्तों से महीनों तक 7,8,9 लगते हैं, एनजीएन 2 अभिव्यक्ति दिनों के भीतर न्यूरोनल सेल भाग्य को प्रेरित करती है। कम खेती के समय के अलावा, प्रोटोकॉल प्रारंभिक निलंबन संस्कृति के लिए न तो महंगे विकास कारकों और न ही कोटिंग मैट्रिसेस पर निर्भर करता है, इस प्रकार खेती की लागत को अतिरिक्त रूप से कम करता है।

इसके अलावा, अनुगामी और निलंबन संस्कृतियों में अपरिपक्व न्यूरॉन्स की एनजीएन 2-संचालित पीढ़ी की सीधी तुलना से बेंचटॉप बायोरिएक्टर20 का उपयोग करके संस्कृति में 4 दिनों के बाद कोशिकाओं में 1.36 गुना वृद्धि का पता चला, जबकि 1 मिलियन कोशिकाओं के उत्पादन के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा आधी होने की उम्मीद है। इसलिए आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए बेंचटॉप बायोरिएक्टर को नियोजित करना फायदेमंद हो सकता है, क्योंकि कम हैंडलिंग समय और लागत के साथ अधिक संख्या में कोशिकाओं का उत्पादन किया जा सकता है। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को जल्दी देखा गया था। एनजीएन 2 प्रेरण के 2 दिनों के बाद, शास्त्रीय न्यूरोनल मार्करों जैसे टीयूबीबी 3, एमएपी 2 और एमएपीटी की एक गहन अभिव्यक्ति स्पष्ट थी, जो न्यूरोनल प्रेरण के लिए बेंचटॉप बायोरिएक्टर की प्रयोज्यता का समर्थन करती है। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, संस्कृति के 4 दिनों के भीतर 1 मिलियन HIPSC से लगभग 6.2 मिलियन अपरिपक्व iNGN2 न्यूरॉन्स प्राप्त किए जा सकते हैं। हालांकि, आउटपुट क्षमता अलग-अलग बैचों में भिन्न हो सकती है और सीडिंग पर निलंबन संस्कृति की मात्रा पर निर्भर करती है।

उपज को और बढ़ाने के लिए, खेती का समय 3 अतिरिक्त दिनों के लिए बढ़ाया गया था; हालांकि, हालांकि समुच्चय बड़े हो गए, वे भी अत्यधिक कॉम्पैक्ट हो गए और क्रायोप्रिजर्वेशन या रीप्लेटिंग के लिए ठीक से अलग नहीं किए जा सके। 3 डी संस्कृति दृष्टिकोण में प्रगति के बावजूद, अनुयायी 2 डी न्यूरोनल संस्कृतियां अभी भी माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी या कैल्शियम इमेजिंग जैसे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए स्वर्ण मानक हैं। सेल एकवचन इस प्रकार एक समरूप रूप से वितरित न्यूरोनल मोनोलेयर और न्यूरिटिक नेटवर्क के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है। कोशिकाओं की मजबूत यांत्रिक टुकड़ी या कठोर पृथक्करण अभिकर्मकों का उपयोग एकवचन सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है, फिर भी सेल व्यवहार्यता, शरीर विज्ञान और पुन: लगाव क्षमता47,48 पर संभावित प्रभाव के साथ। आगे के विश्लेषण और परिपक्वता के लिए एकल कोशिकाओं की आवश्यकता के संबंध में, निलंबन में 4 दिनों के बाद समुच्चय को अलग कर दिया गया था, और (दिन 2) iNGN2 न्यूरॉन्स क्रायोसंरक्षित थे। आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स के पोस्ट-पिघलने भेदभाव और लक्षण वर्णन ने न्यूरोनल संस्कृतियों की बढ़ती परिपक्वता और घने न्यूरिटिक नेटवर्क के गठन की पुष्टि की।

प्रदान किए गए प्रोटोकॉल से उच्च संख्या में iNGN2 न्यूरॉन्स उत्पन्न होते हैं। हालांकि, कई सीमाओं पर विचार करने की आवश्यकता है। अधिकांश निलंबन संस्कृति प्लेटफार्मों के लिए, 2 डी अनुयायी संस्कृति से 3 डी वातावरण में एचआईपीएससी का स्थानांतरण महत्वपूर्ण है और अक्सर एक गहन सेल हानि से जुड़ा होता है। मीडिया परिवर्तनों के दौरान आगे महत्वपूर्ण सेल और कुल नुकसान की उम्मीद है। स्वचालित प्लेटफार्मों की तुलना में, बेंचटॉप बायोरिएक्टर का उपयोग करके हैंडलिंग समय और संदूषण जोखिम बढ़ जाता है, क्योंकि मध्यम परिवर्तन मैन्युअल रूप से किए जाने चाहिए। स्वचालन की कमी के अलावा, बेंचटॉप बायोरिएक्टर पोषक तत्वों की निगरानी करने की संभावना प्रदान नहीं करता है, और प्रति ट्यूब 50 एमएल की अधिकतम क्षमता प्रोटोकॉल की अपस्केलिंग क्षमता को सीमित करती है। अंत में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, हालांकि एनजीएन 2 न्यूरोनल वंश प्रतिबद्धता को तेज करता है, टर्मिनल परिपक्वता की अवधि कम नहीं होती है और अभी भी कई हफ्तों में दीर्घकालिक संस्कृति की आवश्यकता होती है। न्यूरोनल फ़ंक्शन, अटैचमेंट और उत्तरजीविता49,50,51 के लिए एस्ट्रोसाइटिक समर्थन के महत्व को देखते हुए, सह-संस्कृति दृष्टिकोण पर विचार किया जाना चाहिए, और दीर्घकालिक खेती के लिए भी आवश्यक हो सकता है।

सारांश में, एक बेंचटॉप बायोरिएक्टर को लागू करके आईएनजीएन 2 न्यूरॉन्स की तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी के लिए एक 2 डी भेदभाव प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक 3 डी वातावरण में अनुवाद किया गया था। वर्णित प्रोटोकॉल अच्छी गुणवत्ता वाले, आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की उच्च मात्रा उत्पन्न करता है, जो जटिल मॉडल परीक्षण, उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और बड़े पैमाने पर विषाक्तता परख के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

EBISC2 परियोजना को अनुदान समझौते संख्या 10 के तहत इनोवेटिव मेडिसिन इनिशिएटिव 2 संयुक्त उपक्रम (जेयू) से वित्त पोषण प्राप्त हुआ 821362। जेयू को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम और ईएफपीआईए से समर्थन प्राप्त होता है। हम इम्यूनोसाइटोकेमिकल और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में उनकी सहायता के लिए नादिन जे स्मैंडज़िच, हेलेन डीएम हेमर, जॉन-माजद बाल्स्टर्स और वैनेसा एम नलेवाजा को धन्यवाद देते हैं, साथ ही साथ हेइके आर्थेन को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम बायोरिएक्टर कार्यक्रम की स्थापना के लिए स्टेफ़नी बर को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 2 ए BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol 50 mM Gibco  11528926
60 mm Nunclon Delta Surface Nunc 734-2040
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) Abcam   ab7751 
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific   10400745
B-27 Supplement (50x)  Gibco 11530536 serum-free Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC line European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor SAMEA103988285 Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line.
Biorender  Biorender.com
BSA Cell Culture grade Thermo Fisher Scientific   12330023
CERO 3D Incubator & Bioreactor OLS OMNI Life Science 2800000
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL OLS OMNI Life Science 2800005
Citavi 6 Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell 7930 freezing medium containing 10% DMSO
Cytofix Fixation Solution BD Biosciences  554655 fixation solution containing 4% paraformaldehyde 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)  Thermo Fisher Scientific   12333553
Doxycycline hydrochloride (DOX) Sigma-Aldrich D3447
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-)  Gibco 14190250
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+)  Gibco 11580456
DMEM/F12 (-/-) Gibco 21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement Gibco 31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific   A21424
GlutaMAX supplement  Gibco  35050-038 stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid
ImageJ 1.51v  National Institute of Health
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278l
Laminin Merck L2020
MACSQuant Analyzer Miltenyi
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free  Corning Life Science  356231 basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco  11140035
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit  Thermo Fisher Scientific   10095714
mTeSR1 Stemcell 85850 feeder-free iPSC maintenance medium 
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048 serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation
Neurobasal Medium Gibco 11570556
Nikon Eclipse TS2 Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200 ChemoMetec A/S
Origin 2021 OriginLab
Penicillin-Streptomycin Gibco 11548876
Perm/Wash Buffer  BD Biosciences  554723
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) Thermo Fisher Scientific 11620099
Poly-L-ornithine 0.01% Merck P4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit Qiagen 74034 column-based RNA isolation kit
RLT Buffer Qiagen 79216 cell lysis buffer
Sodium Pyruvat (100 mM) Gibco 12539059
StemPro Accutase Gibco 11599686 cell dissociation enzyme
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX Thermo Fisher Scientific   11380912 qPCR master mix
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
TrypLE Select Enzym Gibco 12563-011 Trypsin-EDTA solution
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
Via1-Cassette ChemoMetec A/S 941-0012
Wide Bore Filtered Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 10088880
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES  Thermo Fisher Scientific 15206343
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) Abcam ab120129

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Wihan, J., Karnatz, I., Sébastien, I., Kettenhofen, R., Schmid, B., Clausen, C., Fischer, B., Steeg, R., Zimmermann, H., Neubauer, J. C. Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor. J. Vis. Exp. (193), e65085, doi:10.3791/65085 (2023).

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