Summary
이 기사에서는 벤치탑 3D 현탁액 바이오리액터에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 뉴런 계통 세포의 유도는 뇌 연구의 이정표를 세웠습니다. 프로토콜은 처음 등장한 이래로 지속적으로 최적화되어 왔으며 현재 연구 및 약물 개발에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 기존 차별화 및 성숙 프로토콜의 매우 긴 기간과 고품질 hiPSC 및 신경 유도체에 대한 수요 증가로 인해 대규모 생산에 대한 이러한 프로토콜의 채택, 최적화 및 표준화의 필요성이 높아졌습니다. 이 연구는 벤치탑 3차원(3D) 현탁액 바이오리액터를 사용하여 유전자 변형된 독시사이클린 유도성 뉴로제닌 2(iNGN2) 발현 hiPSC를 뉴런으로 분화하기 위한 빠르고 효율적인 프로토콜을 제시합니다.
간단히 말해서, iNGN2-hiPSC의 단일 세포 현탁액은 24시간 이내에 응집체를 형성하도록 허용되었고, 독시사이클린의 첨가에 의해 뉴런 계통 투입이 유도되었습니다. 응집체는 유도 2일 후에 해리되었고, 세포는 냉동보존되거나 말단 성숙을 위해 재도금되었다. 생성된 iNGN2 뉴런은 초기에 고전적인 뉴런 마커를 발현하고 재도금 후 1주일 이내에 복잡한 뉴라이트 네트워크를 형성하여 뉴런 배양의 성숙도가 증가하고 있음을 나타냅니다. 요약하면, 질병 모델링, 표현형 고처리량 약물 스크리닝 및 대규모 독성 테스트의 시작점으로서 큰 잠재력을 지닌 3D 환경에서 hiPSC 유래 뉴런의 빠른 생성을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
신경계 장애는 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 6 명 중 1 명이 영향을 받고 발병률은 계속 증가하고 있습니다. 사회와 의료 시스템에 대한 재정적 부담은 엄청납니다. 2010년 유럽 30개국을 대상으로 한 평가에서 정신 및 신경 장애와 관련된 연간 비용은 8,000억 유로로 추산되었습니다2. 사회경제적 부담이 증가함에 따라 효과적인 치료 전략이 필요하며, 질병 병태생리학에 대한 이해가 크게 증가했지만 클리닉으로의 번역은 종종 불충분합니다. 일반적으로 의약품의 12%만이 임상 시험에 들어가며, 그 중 80% 이상이 주로 비효능 또는 예상치 못한 독성으로 인해 후기 단계에서 실패합니다 3,4. 그 이유는 다양하지만, 전임상 단계의 동물 실험에서 인간 실험으로의 제한된 이전 가능성이 점점 더 전면에 등장하고 있습니다5. 인간 체외 세포 및 조직 모델은 종간 번역의 격차를 해소할 수 있으며, 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 기술의 발전은 이와 관련하여 큰 잠재력을 가지고 있습니다. hiPSC는 기초 연구에 널리 사용되며, 배아 파괴와 관련된 윤리적 문제를 피하면서 거의 무제한의 자가 재생 능력과 3개의 생식층6으로 분화할 수 있는 능력과 같은 배아 줄기 세포(hESC)와 필수적인 특성을 공유한다.
hESC와 나중에 hiPSC에서 신경 세포의 유도는 뇌 연구의 이정표를 세웠습니다. 초기 분화 프로토콜은 배발생 동안 중요한 단계를 모방하는 성장 인자의 적용을 기반으로 했으며, 대부분은 현탁액 또는 부착 배양에서 이중 SMAD 억제를 포함합니다 7,8,9. 성숙한 뉴런은 성공적으로 생성되었지만 생성된 뉴런의 낮은 수율 및 높은 배치 간 가변성, 긴 배양 시간과 관련된 광범위한 작업량과 같은 이러한 프로토콜의 몇 가지 단점이 여전히 약물 개발에서의 광범위한 사용을 방해합니다. 신경 발생에 결정적으로 관여하는 전사 인자의 강제 발현에 의해 개선이 이루어졌으며, 뉴로제닌(neurogenin, NGN) 계열의 구성원, 특히 NGN2가 효과적인 동인으로 확인되었다10. hiPSC에서 NGN2의 렌티바이러스 매개 이소성 발현은 뉴런 분화의 초기 단계를 유의하게 가속화시켰고, 단 1주일 이내에 뉴런 세포의 운명을 유도했다11. 성상교세포와의 공동 배양에서의 후속 말단 성숙은 재현 가능한 특성을 가진 고순도 및 양의 기능적 뉴런을 생성했습니다. 그런 다음 아데노 관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1) 세이프 하버 유전자좌의 부위 지정 유전자 편집을 적용하여 NGN212,13에 대한 안정적이고 독시사이클린 유도성 발현 카세트가 있는 hiPSC 라인을 생성하여 렌티바이러스 전달의 원치 않는 부작용을 최소화했습니다.
독시사이클린 유도성 뉴로제닌 2(iNGN2) 뉴런의 강력하고 효율적인 분화는 고처리량 표현형 약물 스크리닝 및 독성 분석에 대한 큰 잠재력을 가지고 있습니다10,14,15; 지난 10년 동안 확장 가능한 세포 확장 및 분화를 위한 생물반응기를 구현하여 바이오프로세싱에서 상당한 진전이 이루어졌습니다16,17,18,19. 그러나 대부분의 차별화 프로토콜은 부착 문화에 최적화되어 있으며 3차원(3D) 환경으로의 변환에는 종종 필수적인 수정이 필요합니다. 최근에, hiPSCs의 확장 및 간세포, 심근세포 및 뉴런으로의 재현 가능한 분화를 위해 감소된 전단 응력 특징을 갖는 벤치탑 3D 생물반응기의 성공적인 사용이 보고되었다20. 여기서, iNGN2 뉴런의 생성 및 특성화를 위한 상세한 프로토콜은 동일한 벤치탑 3D 바이오리액터를 사용하여 제공된다.
Protocol
참고: 모든 세포 조작과 배양 접시 및 배지 준비는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 층류 후드는 사용 전과 가공 후에 모든 표면을 70% 에탄올로 닦아 철저히 청소해야 합니다. 설명된 프로토콜은 CERO 3D 인큐베이터 및 바이오리액터(이하 벤치탑 바이오리액터라고 함)의 신경 분화에 최적화되어 있습니다. 이 탁상용 바이오리액터는 각각 최대 용량이 50mL인 특수 바이오리액터 튜브를 위한 4개의 슬롯을 제공합니다. 온도 및CO2 수준은 연속적으로 제어되고, 배양 파라미터(예를 들어, 회전 속도 및 시간)는 각 튜브에 대해 독립적으로 조절된다. 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않은 경우 흡인 피펫과 진공 펌프를 사용하여 수행되었습니다.
1. hiPSC의 배양 및 확장
참고: 엔지니어링된 독시사이클린 유도성 NGN2 hiPSC 라인 BIONi010-C-13이 이 프로토콜에 사용됩니다. 여기에 제공된 확장 프로토콜은 6cm 페트리 접시에 최적화되어 있지만 원하는 경우 대체 배양 형식을 사용할 수 있습니다.
- 차가운 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)/F12(-/-)에 최종 농도 0.083mg/mL/10cm2로 희석한 기저막 매트릭스로 6cm 페트리 접시를 코팅합니다. 코팅된 접시를 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.
참고: 기저막 매트릭스 용액 준비에 대한 자세한 프로토콜은 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. hiPSC는 확장을 위해 대체 세포외 매트릭스에서 배양할 수 있습니다. - EBiSC 세포주 사용자 프로토콜21 에 따라 냉동보존된 hiPSC를 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + 10μM ROCK 억제제(Y-27632)에서 해동합니다. 60mm 접시 당 1 ×10 6 개의 생존 가능한 세포의 파종 밀도가 권장됩니다.
- 다음날 배지를 ROCK 억제제가 없는 피더가 없는 iPSC 유지 배지로 변경하고 매일 배지 교체를 수행합니다.
- hiPSC 배양이 60%-80%의 합류점에 도달하면 계대배양을 시작합니다. 차별화된 영역을 확인하고 면적이 5%를 초과하는 경우 콜로니를 수동으로 청소합니다.
참고: 미분화 hiPSC는 두드러진 핵소체와 더 적은 세포질을 가진 둥근 세포로 나타납니다. 평평하고 빽빽하게 채워진 식민지는 해동 또는 통과 후 일찍 형성됩니다. hiPSC 배양의 예시적인 명시야 이미지는 그림 1에 나와 있습니다. 추가 정보는 EBiSC 세포주 사용자 프로토콜21에 제공됩니다. 통과를 위해 기저막 매트릭스 코팅 접시와 피더가 없는 iPSC 유지 관리 매체를 준비합니다. - hiPSC 배양물로부터 배지를 흡인하고, Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 1x 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS) 중의 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 세포를 2배 헹굽니다(DPS [-/-], 재료 표 참조).
- 상층액을 제거하고 2cm 페트리 접시에 0.5x DPBS(-/-)에 1mM EDTA 6mL를 추가합니다. 세포를 인큐베이터에서 3분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
- EDTA 용액 1.5mL를 흡인하고 3-5분 동안 계속 배양합니다.
- 세포 분리를 용이하게 하기 위해 접시를 부드럽게 두드리십시오.
알림: 시각적 평가로 분리를 확인하십시오. hiPSC 콜로니는 5분 후에 분리되기 시작해야 하지만 더 높은 융합 hiPSC 배양에서는 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다. 콜로니가 분리되지 않으면 배양 시간을 10분까지 늘리되 이 시간을 초과하지 마십시오. - 5mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지를 6cm 페트리 접시에 추가하고 10mL 혈청학적 피펫 또는 광구경 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 2배 부드럽게 재현탁합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다.
참고: hiPSC는 기계적 응력에 매우 민감합니다. 따라서 여러 번 다시 일시 중단하는 것은 피해야 합니다. 최종 세포 현탁액은 작은 콜로니 단편 (50-200 μm)으로 구성되어야합니다. - 코팅된 배양 접시에서 상층액을 흡인하고 6cm 접시당 4mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지를 준비합니다.
- 작은 콜로니 조각을 1:10에서 1:40의 분할 비율로 갓 준비된 배양 접시에 옮기고 매일 배지를 교체하면서 37°C 및 5%CO2 에서 배양합니다.
참고: 작은 집락은 통과 후 1-2시간 이내에 부착해야 합니다.
그림 1: 인간 유도 만능 줄기 세포 배양의 형태. (A,B) 균질한 형태와 정의된 가장자리를 가진 압축된 hiPSC 콜로니를 보여주는 다양한 합류점의 양질의 hiPSC 배양. (c) 콜로니 가장자리 주위에 분화된 세포의 신흥 클러스터가 있는 hiPSC 배양(흰색 점선). 스케일 바 = 200 μm. 약어: hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 벤치탑 바이오리액터 시스템에서 hiPSC의 사전 배양(2일차)
참고: hiPSC 배양이 60%에서 80% 사이의 합류점에 도달하면 사전 배양을 시작합니다. 차별화된 영역에 대한 hiPSC 콜로니를 확인합니다. 이 재배 전 단계에서 hiPSC는 피더가 없는 iPSC 유지 배지에서 2일 동안 유지됩니다.
- 피더가 없는 iPSC 유지 배지와 10μM ROCK 억제제(Y-27632)로 구성된 배양 배지를 준비합니다.
- hiPSC에서 배지를 완전히 흡인하고 1x DPBS(-/-)로 세포를 두 번 부드럽게 헹굽니다.
- 예열된 트립신-EDTA 용액 2.0mL를 6cm 페트리 접시에 넣고 배양기에서 37°C에서 3분 동안 세포를 배양합니다.
- 세포 분리를 용이하게 하기 위해 접시를 부드럽게 두드리거나 1-2분 더 배양합니다.
- 접시당 5mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + ROCK 억제제에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 세포 특이화를 보장합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 자동 세포 계수기를 사용하여 100 μL의 세포 현탁액에서 세포 번호를 결정하십시오20. 바이오리액터 튜브당 15 ×10 6 셀에 해당하는 부피를 50 mL 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 2mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + ROCK 억제제에 세포를 재현탁합니다.
- 각 50mL 튜브에 18mL의 배지(세포 파종 밀도 0.75 × 106 cells/mL)를 채웁니다. 세포 현탁액을 생물반응기 튜브(튜브당 20mL)에 분주합니다.
- 튜브를 생물 반응기 시스템에 넣습니다. 다음 배양 파라미터를 설정한다: 2초 회전 주기, 60 rpm 회전 속도, 교반 휴지 없음, 37°C, 및 무제한 지속 시간동안 5%CO2 20.
- 바이오리액터 디스플레이를 통해 배양 프로그램을 시작합니다.
- 다음날 미디어를 교체하십시오. 응집체가 ~5분 동안 생물반응기 튜브에 가라앉도록 합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오.
알림: 응집체가 서로 달라붙어 이질적인 골재 현탁액을 만들 수 있으므로 10분 이상 침전시키지 마십시오. 생물 반응기 튜브에 ~5mL의 배양 배지를 그대로 두는 것이 좋습니다. - 튜브당 ROCK 억제제가 없는 신선한 피더가 없는 iPSC 유지 배지 15mL를 추가하고 벤치탑 바이오리액터에서 24시간 동안 배양을 계속합니다.
3. hiPSC의 초기 뉴런으로의 분화(0일)
- 신경기저 배지(NBM) 준비: 안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 포함된 50% DMEM/F-12, 50% 신경기저 배지, 0.5x 무혈청 보충제(50x), 0.5x 무혈청 보충제 보텐슈타인의 N-1 제형(100x), 0.5x 안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 0.5x MEM 비필수 아미노산 용액(100x), 500nM 피루브산나트륨(100mM), 50nM 2-메르캅토에탄올(50mM), 0.025% 인간 인슐린 용액 및 5U/mL 페니실린-스트렙토마이신.
알림: NBM은 4°C에서 보관해야 하며 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. - hiPSC 배양에 독시사이클린(DOX)을 추가하여 신경 분화를 시작합니다. 이를 위해 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하십시오. 튜브에 ~5mL를 남기고 세포에서 상층액을 조심스럽게 흡인하고 NBM과 2μg/mL DOX로 구성된 신경 유도 배지(NIM) 35mL를 추가합니다.
알림: DOX는 빛에 민감하므로 작업 중에는 조명을 끄는 것이 좋습니다. - 튜브를 벤치탑 생물반응기에 다시 넣고 배양을 계속합니다.
- 3.2단계에 설명된 대로 2일 동안 매일 미디어 변경을 수행합니다.
참고: 현탁 배양에서 4일 후, 응집체는 해리될 수 있고, 초기 뉴런은 냉동 보존되거나 말단 성숙을 위해 직접 재도금될 수 있습니다.
4. 초기 뉴런의 냉동보존(2일차)
참고: 냉동 보존은 분화 과정에 필요하지 않으며 중요하지도 않지만 후속 성숙 및 분석을 위해 초기 뉴런의 대량 생산 및 저장이 가능하므로 적극 권장됩니다.
- 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하십시오. 앞서 설명한 대로 상층액을 흡인합니다.
- 응집체를 멸균된 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 1x DPBS(-/-)로 응집체를 2배 부드럽게 헹굽니다. 응집체를 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오.
- 펠릿 크기에 따라 예열된 세포 해리 효소 2-5mL를 첨가하고 수조에서 37°C에서 약 10분 동안 세포를 배양합니다. 응집체가 해리될 때까지 2분마다 침전된 골재를 부드럽게 다시 부유시킵니다.
참고: 배양 7-10분 후에 거의 균질한 세포 현탁액을 얻어야 합니다. - 예열된 NBM 배지의 3배 부피를 추가하고 세포 특이화를 보장하기 위해 세포를 조심스럽게 재현탁합니다.
- 세포 번호를 결정하고 냉동 보존을 위해 해당 부피를 15mL 또는 50mL 튜브에 옮깁니다.
알림: 동결 배지의 5-10 ×10 6 cells/mL의 세포 밀도가 권장됩니다. - 세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다.
- 상청액을 흡인하고 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 해당 부피의 동결 배지에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
- 냉동 보존에 적합한 바이알(1mL/바이알)에 세포 현탁액을 분취합니다.
- 바이알을 즉시 2-프로판올로 채워진 사전 냉장된 저속 냉동 용기로 옮기고 용기를 -80°C에서 밤새 두십시오. 장기 보관을 위해 다음날 바이알을 -150°C에 두십시오.
알림: 액체 2-프로판올은 가연성이 높으며 접촉 시 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 열을 피하고 보호 장갑과 안경을 착용하십시오.
5. 단층 배양에서 hiPSC 유래 뉴런의 성숙
- hiPSC 유래 뉴런의 장기 배양을 위해 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 배양 접시를 준비합니다.
- 폴리-L-오르니틴 원액을 1x DPBS(-/-)에서 0.001%로 희석하고 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 접시를 코팅합니다. 폴리-L-오르니틴 용액을 흡인하고 플레이트를 1x DPBS(-/-)로 한 번 세척합니다.
- 라미닌 용액을 1x DPBS(-/-)에 최종 농도 10μg/mL로 희석하고 접시를 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
알림: 코팅 절차에는 cm2당 0.1-0.15mL의 부피가 권장되고 모든 세척 단계에는cm2당 0.2mL가 권장됩니다. 대체 코팅 기질을 사용할 수 있지만 세포 부착 및 성숙에 대한 잠재적 영향을 평가해야 합니다.
- 냉동보존된 세포를 해동합니다. 이를 위해 극저온 오빌을 수조(37°C로 설정)에 넣고 냉동 세포 현탁액의 작은 덩어리가 남을 때까지 약 1분 동안 소용돌이칩니다.
- 세포 현탁액을 10mL의 예열된 NBM으로 준비된 15mL 튜브에 조심스럽게 적가합니다. 1mL의 NBM으로 극저온 난을 헹구고 세포 현탁액을 동일한 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다.
- 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 NIM 1-2mL를 추가합니다.
- 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁하고 세포 번호를 결정하십시오.
- 코팅된 세포 배양 접시에서 남은 라미닌 용액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 NIM에서 1× 5 cells/cm2 의 파종 밀도로 세포를 시딩합니다.
- 24시간 후 배지를 ROCK 억제제 없이 NIM으로 전환합니다.
- 4 일 동안 매일 매체 변경을 수행하십시오.
- NGN2 유도의 초기 단계 후, DOX를 생략하고 원하는 성숙 단계에 도달할 때까지 일주일에 2회 하프 배지를 교체하면서 NBM에서 세포를 배양합니다.
참고: iNGN2 뉴런과 성상교세포의 공배양은 세포 생존, 부착, 성숙 및 전기적 활동을 증가시키는 것이 좋습니다13,22.
6. hiPSC 유래 뉴런의 특성화
참고: 뉴런 유도체로의 분화는 다음 기술로 평가할 수 있습니다.
- 면역세포화학 및 이미징
- hiPSC 유래 뉴런에서 배지를 흡인하고Ca2+ 및 Mg2+ (+/+)가 있는 1x DPBS로 세포를 한 번 세척합니다.
알림: 세포가 표면에서 매우 쉽게 분리될 수 있으므로 우선적으로 웰 가장자리에 조심스럽게 피펫을 끼우십시오. 0.2x DPBS(+/+)로 세포의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 모든 세척 단계에 cm2 당 2mL의 부피가 권장됩니다. - 상온(RT)에서 15분 동안 DPBS 중 4% 파라포름알데히드(+/+)를 함유한 고정 용액을 사용하여 신경세포를 고정한다. cm2 당 0.1mL의 부피가 권장됩니다.
참고: DPBS의 파라포름알데히드(4%)는 급성 독성 및 잠재적인 발암성이 있는 유해하고 피부 자극적인 용액입니다. 열을 피하고 보호 장갑과 안경을 착용하고 흡입을 피하고 통풍이 잘되는 환경에서만 용액을 사용하십시오. - 세포를 1x DPBS(+/+)로 2배 부드럽게 헹구고 염색을 진행합니다.
알림: 고정 셀은 추가 처리가 있을 때까지 최대 4개월 동안 1°C에서 DPBS(+/+)에 보관할 수 있습니다. - 샘플에서 DPBS(+/+)를 흡인합니다. RT에서 60분 동안 1% BSA 및 0.2% Triton-X-100을 포함하는 1x DPBS(+/+)로 세포를 투과시키고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
참고: cm2 당 0.2mL의 부피를 권장합니다. - 상청액을 제거하고, 각각의 1차 항체를 염색 완충액(1% BSA를 함유하는 1x DPBS[+/+])에 희석하여 4°C에서 밤새 세포를 인큐베이션한다( 물질 표 참조). 세포가 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 부피가 권장됩니다. - 염색 완충액을 흡인하고 세포를 1x DPBS(+/+)로 3배 헹굽니다.
- 해당 2차 항체( 재료 표 참조)를 염색 완충액에 1:1,000의 최종 농도로 희석합니다.
- 어둠 속의 RT에서 1시간 동안 희석된 항체 용액에서 세포를 배양합니다. 세포가 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 부피가 권장됩니다. - 2차 항체 용액을 흡인하고 세포를 1x DPBS(+/+)로 2배 헹굽니다.
- RT에서 5분 동안 DPBS(+/+)로 희석한 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 핵을 반대 염색합니다.
참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 작업 부피가 권장됩니다. - 세포를 2x DPBS(+/+)로 1배 헹굽니다.
- 이미징될 때까지 4°C에서 DPBS(+/+)에 세포를 보관합니다.
참고: 명시야 영상은 형태학적 변화와 신경돌기 성장을 추적하는 데 적합합니다. 또한, 입체형 마커 발현은 형광 현미경에 의해 평가될 수 있다. 미분화 hiPSC는 OCT 3/4 및 NANOG를 발현하지만 베타-III-튜불린(TUBB3) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2)는 신경돌기 및 축삭을 시각화하기 위한 신경 마커 역할을 할 수 있습니다. 신경돌기 네트워크는 명시야 또는 형광 이미지에서 신경돌기 길이를 결정하여 추가로 평가할 수 있습니다.
- hiPSC 유래 뉴런에서 배지를 흡인하고Ca2+ 및 Mg2+ (+/+)가 있는 1x DPBS로 세포를 한 번 세척합니다.
- 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)에 의한 유전자 발현 분석
- 배지를 흡인하고 세포를 1x DPBS(-/-)로 한 번 헹굽니다.
참고: cm2 당 0.2mL의 부피를 권장합니다. - 차가운 RNA 용해 완충액을 추가하고 긁어서 세포를 수확합니다.
- 적합한 컬럼 기반 키트를 사용하여 RNA를 분리하고, UV 광분광법으로 RNA 농도를 결정한다.
- 총 RNA 250ng과 역전사에 적합한 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다.
- 2.5ng의 cDNA를 이중으로 포함하는 분자 비콘 qPCR 반응을 준비합니다. 적절한 마스터 믹스 및 해당 프라이머 분석(20 )을 사용한다( 재료 표 참조).
- 60°C에서 20초 동안 프라이머 어닐링과 함께 45 사이클을 적용하여 qPCR을 실행합니다.
- 상대적 유전자 발현 수준을 하우스키핑 유전자 GAPDH, HPRT1 및 GUSB의 평균으로 정규화합니다. 미분화 hiPSC를 교정기로 사용하여 ΔΔCt 방법23을 적용합니다.
- 배지를 흡인하고 세포를 1x DPBS(-/-)로 한 번 헹굽니다.
Representative Results
초기 단계에서 hiPSC의 부착성 배양은 분리, 특이화 및 현탁액으로 옮겨집니다(그림 2). 응집체는 24 시간 이내에 형성되며 지속적으로 크기가 커집니다. 이식유전자 유도 2일 후, 초기 뉴런은 후속 실험을 위해 냉동보존될 수 있습니다.
현탁액의 초기 며칠 동안의 지속적인 증식은 세포 수의 증가를 초래하여 유도 2일 후에 최고점에 도달합니다(그림 3A, B). 확산과 함께 응집체가 증가하기 시작합니다. 0일과 비교하여 직경은 2일째에 50% 증가했으며 5일째에는 거의 두 배가 되었습니다(그림 3D). 직경이 증가하면 응집체 내부의 영양소 공급이 제한되지만 세포의 생존력은 분화 2일차 또는 분화 5일차에 영향을 받지 않습니다(그림 3C). 그러나, 현탁액에서 4일 이상 장기간 배양하는 것은 응집체가 효소적 특이화에 점점 더 내성을 갖기 때문에 세포 수율을 더 이상 향상시키지 못한다(그림 3B).
냉동 보존 시, 2일째 세포를 해동하고 말단 성숙을 위해 폴리-L-오르니틴(PLO)-라미닌 코팅 접시에 도말합니다. 일반적으로 세포는 해동 후 매우 잘 부착되어 조기에 신경돌기를 확장하기 시작합니다. 측두엽 유전자 발현 프로필과 뉴런 마커 TUBB3 및 MAP2에 대한 면역세포화학적 염색은 뉴런 세포 동일성을 확인합니다(그림 4A, B). TUBB3 및 MAP2의 상승 수준 외에도, 뉴런 배양은 축삭 안정화에 관여하는 뉴런 단백질을 암호화하는 미세소관 관련 단백질 타우 전사체(MAPT)가 풍부하고, 다능성 조절 전사 인자 POU5F1의 발현이 수반되는 감소를 보여줍니다. 또한, 해동 후 첫 주 이내에 조밀 한 신경염 네트워크가 형성됩니다 (그림 4C). 이러한 형태학적 변화는 전사 프로파일과 함께 신경 배양의 성숙이 증가하고 있음을 시사합니다.
그림 2: 벤치탑 바이오리액터를 사용한 hiPSC 유래 iNGN2 뉴런 생성. (A) 분화 패러다임의 개략도, 세포 배양의 주요 단계를 강조합니다. (BF) 명시야 이미지는 (B) hiPSC 및 (C,D) 벤치탑 바이오리액터에서 응집체 형성을 시각화합니다. (E,F) iNGN2 뉴런은 신경돌기를 확장하고 분화 과정에서 형태학적 변화를 겪습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: BMM = basement membrane matrix; iPSC-MM = iPSC 유지 매체; PLO = 폴리-L-오르니틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 응집체 형성 및 성장 중 세포 수율 및 생존력. (A) 명시야 이미지는 벤치탑 바이오리액터에서 배양 후 2일 이내에 응집체가 형성되고 시간이 지남에 따라 응집체 크기가 증가하는 것을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) 분화 과정에 걸친 세포 수율 및 (C) 생존력의 정량화. 막대 그래프는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 + SD를 나타낸다. (D) 응집체의 크기를 나타내는 직경은 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ(버전 1.53)를 사용하여 반자동으로 결정되었습니다. 먼저 명시야 이미지를 이진 이미지로 변환한 다음 입자 분석 도구를 사용하여 크기 > 2,500μm2, 원형도 0.45-1, 가장자리 제외 및 구멍 포함 매개변수를 적용하여 추가로 평가했습니다. 수평선은 5개의 독립적인 미분의 평균 ± SD를 나타냅니다. 단일 점은 시점당 최소 20개의 응집체가 있는 개별 분화 실험의 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: hiPSC 유래 iNGN2 뉴런의 특성화. 신경 유전자 TUBB3, MAP2 및 MAPT와 만능 줄기 세포 관련 유전자 POU5F1에 대한 시간적 유전자 발현 프로필. 상대적 발현 수준은 참조 유전자 GAPDH, HPRT1 및 GUSB로 표준화되었습니다. 미분화 hiPSC(day-2)가 교정기로 선택되었습니다. 기하학적 기호는 4개의 독립적인 미분의 평균± SD를 나타냅니다. (B) 해동 후 7일째(day-2 + 7)에 iNGN2 뉴런의 대표 이미지, 베타-III-튜불린(TUBB3, 마젠타) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2, 청록색)에 대해 염색됨. 세포핵은 DAPI로 대조염색하였다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 해동 후 신경 배양의 명시야 이미지에서 신경염 네트워크 평가. 신경돌기의 총 길이는 ImageJ(버전 1.53)를 사용하여 930.82 × 698.11μm2의 영역에서 결정되었습니다. 밝기와 대비를 조정한 후 이미지를 8비트 이미지로 변환하고 색상을 반전했습니다. 신경돌기는 이후 골격화한 다음 ImageJ 플러그인 'Skeletonize' 및 'Analyze Skeleton'을 사용하여 각각 분석되었습니다. 신경돌기의 총 길이를 관심 영역의 소마 수로 나누어 평균 신경돌기 길이/세포를 산출했습니다. 막대 그래프는 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 + SD를 나타낸다. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
뉴런 전사 인자 NGN2의 이소성 발현은 이전에 뉴런 분화의 초기 단계를 가속화하고 배양 후 1주일 이내에 hiPSC에서 뉴런 계통 투입을 유도하는 것으로 나타났습니다12,13,20. 이 연구는 벤치탑 바이오리액터를 사용하여 유전자 편집 BIONi010-C-13 hiPSC를 iNGN2 뉴런으로 분화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
CERO 3D 바이오리액터는 각각 최대 용량이 50mL인 특수 튜브용 슬롯 4개가 있는 저용량 바이오리액터입니다. 온도 및CO2 수준은 지속적으로 제어되고 배양 매개변수(예: 회전 속도 및 시간)는 각 튜브에 대해 조절되어 사용자가 독립적으로 여러 차별화 접근 방식을 병렬로 실행할 수 있습니다. 내부 튜브 벽에 통합된 웨이브브레이커는 낮은 전단 응력으로 매체의 섭동을 허용하고 제어된 회전 중에 서스펜션에서 3D 응집체를 유지합니다. 영양분에 대한 제한된 접근과 강제적인 3D 세포-세포 및 세포-세포외 기질(ECM) 상호작용은 세포 분화 및 행동에 상당한 영향을 미칠 수 있다24,25,26,27.
현탁액에서 3D 응집체로 세포를 배양하면 이러한 세포 상호 작용이 증가하여 조직 또는 기관의 생체 내 환경을 보다 밀접하게 모방합니다28. 매질의 수반되는 섭동은 기계적 마찰로 인한 응집체 크기를 조절하고, 가스 교환을 개선하며, 응집체 내부의 생리학적 관련 구배를 유지하면서 튜브 내의 영양분과 폐기물의 구배를 감소시킵니다 29,30,31,32,33,34. 배지 변경은 수동으로 수행되지만 탁상용 바이오리액터는 정적 배양 플라스크에 비해 인건비와 운영 비용을 절감합니다. 바이오리액터는 또한 임펠러가 없는 설계가 응집체 표면의 유체역학적 전단 응력을 감소시켜 세포 생존을 개선할 뿐만 아니라 민감한 iPSC, 세포 분화 및 기능에 대한 전단 응력의 영향을 제한하기 때문에 완전 자동화된 교반 탱크 바이오리액터에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다(35,36,37,38).
대형 수직 임펠러에 의해 세포가 교반되는 수직 휠 바이오리액터와 전동 플랫폼에 부착된 팽창된 배양 백을 사용하는 락킹 모션 바이오리액터는 대체 3D 서스펜션 플랫폼을 나타냅니다. hiPSC 17,18,19,39,40 의 배양에 대해 과도하게 테스트되었지만, 신경 분화 접근법에서의 적용 가능성에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 보고는 교반 탱크 생물반응기 41,42,43,44에서 포유류 및 인간 신경 전구체 세포의 성공적인 확장에 국한되며, 드문 수의 연구에 초점을 맞추고 있습니다. 성숙44,45. 일반적으로 자동화된 3D 서스펜션 플랫폼은 완전 자동화 및 컴퓨터 제어 매체 변경의 이점을 제공하여 취급 변동을 줄이고 오염 위험을 최소화합니다. 또한 젖산 및 포도당 농도와 같은 영양소 파라미터를 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 그러나 이러한 시스템을 구축하려면 상당한 초기 투자, 실험실 공간 및 자격을 갖춘 인력 교육이 필요한 경우가 많습니다. 탁상용 바이오리액터는 현탁액에서 세포를 배양하기 위한 작고 사용하기 쉬운 대안이지만 영양소의 동시 모니터링을 제공하지는 않습니다.
3D 현탁액 플랫폼에서 세포 배양에 사용되는 대부분의 프로토콜에서와 같이, 응집체의 초기 형성은 중요한 단계를 나타냅니다. hiPSC는 부착성 단층으로 배양된 후 단일 세포 현탁액으로 3D 환경으로 옮겨집니다. 이 단계에서 세포 손실을 최소화하려면 몇 가지 측면을 고려해야 합니다. 통합 웨이브브레이커가 있는 튜브의 설계는 최적의 배지 섭동을 보장하기 위해 튜브당 최소 10mL의 배양 부피가 필요하다는 것을 의미합니다. 따라서 임계 볼륨이 장기간에 걸쳐 감소해서는 안 됩니다. 또한, 배양 부피 10mL당 750만 개의 세포와 60rpm의 회전 속도의 시작 파종 밀도는 세포주에 따라 적응이 필요할 수 있지만 단기간에 안정적인 응집체를 형성하는 데 적극 권장됩니다.
hiPSC를 현탁액으로 옮긴 후 24시간 이내에 응집체를 형성해야 합니다. 첫 번째 중간 변화는 응집체가 작고 제대로 정착되지 않을 수 있으므로 중요합니다. 응집체의 침전 시간은 연장될 수 있지만 응집체가 이질적인 방식으로 뭉치고 성장하기 시작할 수 있으므로 10분을 초과해서는 안 됩니다. 흡인하는 동안 튜브에 최소 5mL의 배양 부피를 남겨 두어야 하며 배지의 섭동을 피해야 합니다. 그럼에도 불구하고 초기 단계에서 세포와 응집체의 손실이 예상됩니다. 세포 수는 배양 첫 2일 동안 일정한 세포 수율을 나타내며, 이는 hiPSC의 높은 증식 능력이 초기 세포 손실을 보상한다는 것을 나타냅니다. 일단 현탁 상태에 들어가면 부드러운 재배와 섭동으로 인해 시간이 지남에 따라 성장하기 시작하는 균일한 크기의 응집체가 생성됩니다.
뉴런 분화는 독시사이클린 유도 NGN2 과발현13에 기초하여 이전에 발표된 프로토콜에 따라 수행되었고, 개별 단계는 3D 배양을 위해 최적화되었다. 뉴런 전사 인자 NGN2는 뉴런 분화에서 잘 설명된 동인이며 뉴런 유도를 유의하게 가속화합니다11,13,46. 정의된 성장 인자를 사용한 기존의 패터닝은 몇 주에서수개월이 걸리지만 7,8,9, NGN2 발현은 수일 내에 신경 세포의 운명을 유도합니다. 단축된 배양 시간 외에도 프로토콜은 초기 현탁 배양을 위해 값비싼 성장 인자나 코팅 매트릭스에 의존하지 않으므로 재배 비용을 추가로 절감할 수 있습니다.
또한, 부착 및 현탁 배양에서 NGN2 구동 미성숙 뉴런 생성을 직접 비교한 결과, 벤치탑 바이오리액터20을 사용한 배양에서 4일 후 세포가 1.36배 증가한 반면, 100만 개의 세포 생성에 필요한 배지의 부피는 절반으로 줄어들 것으로 예상됩니다. 따라서 iNGN2 뉴런 생성을 위해 벤치탑 바이오리액터를 사용하는 것이 더 낮은 처리 시간과 비용으로 더 많은 수의 세포를 생산할 수 있기 때문에 도움이 될 수 있습니다. 이전 보고서와 일치하여 뉴런 혈통 헌신이 초기에 관찰되었습니다. NGN2 유도 2일 후, TUBB3, MAP2 및 MAPT와 같은 고전적인 신경 마커의 심오한 발현이 분명했으며, 이는 신경 유도를 위한 벤치탑 생물반응기의 적용 가능성을 뒷받침합니다. 이 프로토콜에 따라 배양 4일 이내에 100만 개의 hiPSC에서 약 620만 개의 미성숙 iNGN2 뉴런을 얻을 수 있습니다. 그러나 출력 용량은 배치에 따라 다를 수 있으며 파종 시 현탁 배양량에 따라 달라질 수 있습니다.
수확량을 더 증가시키기 위해, 재배 시간을 추가로 3 일 연장 하였다; 그러나 응집체가 커졌음에도 불구하고 매우 조밀해졌으며 냉동 보존 또는 재도금을 위해 적절하게 해리될 수 없었습니다. 3D 배양 접근법의 발전에도 불구하고 부착성 2D 신경 배양은 여전히 미세 전극 어레이 또는 칼슘 이미징과 같은 기능 분석의 황금 표준입니다. 따라서 세포 특이화는 균질하게 분포된 뉴런 단층 및 신경돌기 네트워크를 위한 중요한 전제 조건입니다. 세포의 더 강력한 기계적 분리 또는 가혹한 해리 시약은 특이화를 보장하기 위해 사용될 수 있지만 세포 생존력, 생리학 및 재부착 능력에 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다47,48. 추가 분석 및 성숙을 위한 단일세포의 필요성과 관련하여, 응집체는 현탁액에서 4일 후에 해리되었고, (2일째) iNGN2 뉴런을 냉동보존하였다. iNGN2 뉴런의 해동 후 분화 및 특성화는 뉴런 배양의 성숙도 증가와 조밀한 신경암 네트워크의 형성을 확인했습니다.
제공된 프로토콜은 많은 수의 iNGN2 뉴런을 생성합니다. 그러나 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 대부분의 현탁 배양 플랫폼의 경우, 2D 부착 배양에서 3D 환경으로 hiPSC를 전달하는 것이 중요하며 종종 심각한 세포 손실과 관련이 있습니다. 배지 교체 중에 더 많은 셀 및 응집체 손실이 예상됩니다. 자동화된 플랫폼과 비교할 때, 벤치탑 바이오리액터를 사용하는 경우 배지 교체를 수동으로 수행해야 하기 때문에 처리 시간과 오염 위험이 증가합니다. 자동화 부족 외에도 벤치탑 바이오리액터는 영양소를 모니터링할 수 있는 가능성을 제공하지 않으며 튜브당 최대 용량이 50mL이므로 프로토콜의 업스케일링 가능성이 제한됩니다. 마지막으로, NGN2가 신경 계통 약속을 가속화하지만 말단 성숙 기간은 단축되지 않으며 여전히 몇 주에 걸친 장기 배양이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 신경 기능, 부착 및 생존에 대한 성상세포 지원의 중요성을 감안할 때 49,50,51, 공동 배양 접근법을 고려해야 하며 장기 배양에 필수적일 수도 있습니다.
요약하면, 2D 분화 프로토콜은 벤치탑 바이오리액터를 구현하여 iNGN2 뉴런의 빠르고 재현 가능한 생성을 위해 3D 환경으로 성공적으로 변환되었습니다. 설명된 프로토콜은 복잡한 모델 테스트, 고처리량 약물 스크리닝 및 대규모 독성 분석의 시작점이 될 수 있는 양질의 iPSC 유래 뉴런을 다량 생성합니다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
EBiSC2 프로젝트는 보조금 계약 No 821362에 따라 Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU)으로부터 자금을 지원 받았습니다. JU는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램과 EFPIA의 지원을 받습니다. 면역세포화학 및 유전자 발현 분석에 도움을 주신 Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters, Vanessa M. Nalewaja와 탁월한 기술 지원을 아끼지 않은 Heike Arthen에게 감사드립니다. 또한 생물 반응기 프로그램을 설립 한 Stephanie Bur에게 감사드립니다. 그림 2A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
| 60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
| Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
| BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
| Biorender | Biorender.com | ||
| BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
| CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
| CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
| Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
| CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
| Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
| DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
| Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
| DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
| ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
| MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
| Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
| mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
| Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
| Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
| NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
| Origin 2021 | OriginLab | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
| Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
| RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
| Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
| StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
| TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
| Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
| X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
| Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |
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