Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for generering av humane induserte pluripotente stamcelleavledede nevroner i en stasjonær 3D-suspensjonsbioreaktor.
Abstract
Avledningen av nevronale avstamningsceller fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) markerte en milepæl i hjerneforskningen. Siden deres første advent har protokoller blitt kontinuerlig optimalisert og er nå mye brukt i forskning og stoffutvikling. Den svært lange varigheten av disse konvensjonelle differensierings- og modningsprotokollene og den økende etterspørselen etter høykvalitets hiPSCer og deres nevrale derivater øker imidlertid behovet for adopsjon, optimalisering og standardisering av disse protokollene til storskala produksjon. Dette arbeidet presenterer en rask og effektiv protokoll for differensiering av genetisk modifiserte, doxycyklininduserbare neurogenin 2 (iNGN2) -uttrykkende hissc i nevroner ved hjelp av en stasjonær tredimensjonal (3D) suspensjonsbioreaktor.
Kort fortalt fikk encellede suspensjoner av iNGN2-hiPSCs lov til å danne aggregater innen 24 timer, og nevronavstamningsforpliktelse ble indusert ved tilsetning av doksycyklin. Aggregater ble dissosiert etter 2 dagers induksjon og celler ble enten kryopreservert eller replisert for terminal modning. De genererte iNGN2-nevronene uttrykte klassiske nevronmarkører tidlig og dannet komplekse nevrittiske nettverk innen 1 uke etter replating, noe som indikerer en økende modenhet av nevronkulturer. Oppsummert er det gitt en detaljert trinnvis protokoll for rask generering av hiPSC-avledede nevroner i et 3D-miljø som har stort potensial som utgangspunkt for sykdomsmodellering, fenotypiske legemiddelscreeninger med høy gjennomstrømning og toksisitetstesting i stor skala.
Introduction
Nevrologiske lidelser er den ledende årsaken til funksjonshemming over hele verden1. En av seks personer rammes, og forekomsten fortsetter å stige. Den tilhørende økonomiske byrden på samfunn og deres helsevesen er enorm. En evaluering av 30 europeiske land i 2010 anslåtte årlige kostnader på € 800 milliarder knyttet til psykiske og nevrologiske lidelser2. Den økende sosioøkonomiske byrden krever effektive behandlingsstrategier, og selv om vår forståelse av sykdomspatofysiologien har økt betydelig, er omsettingen til klinikk ofte utilstrekkelig. Generelt går bare 12% av legemidlene inn i kliniske studier, hvorav mer enn 80% mislykkes i senere stadier, hovedsakelig på grunn av ineffektivitet eller uventet toksisitet 3,4. Årsakene er varierte, men den begrensede overførbarheten fra dyreforsøk i prekliniske stadier til forsøk på mennesker har i økende grad kommet til syne5. Humane in vitro-celle- og vevsmodeller kan bygge bro over gapet mellom artsoversettelser, og fremskritt innen menneskeindusert pluripotent stamcelleteknologi (hiPSC) har stort potensial i denne forbindelse. hiPSCs er mye brukt i grunnforskning og deler viktige egenskaper med embryonale stamceller (hESCs), for eksempel en nesten ubegrenset selvfornyelseskapasitet og evnen til å differensiere i alle tre kimlag6, mens man omgår etiske bekymringer knyttet til embryodestruksjon.
Avledningen av nevronceller fra hESCs, og senere hiPSCs, markerte en milepæl i hjerneforskningen. Innledende differensieringsprotokoller var basert på anvendelse av vekstfaktorer som etterlignet kritiske trinn under embryogenese, de fleste av dem involverte dobbel SMAD-hemming enten i suspensjon eller adherentkulturer 7,8,9. Eldre nevroner har blitt generert, men flere ulemper ved disse protokollene hindrer fortsatt deres brede bruk i stoffutvikling, for eksempel lavt utbytte og høy batch-til-batch-variabilitet av genererte nevroner, samt den omfattende arbeidsbelastningen knyttet til lange kulturtider. Forbedringer har blitt oppnådd ved tvungen ekspresjon av transkripsjonsfaktorer som er kritisk involvert i nevrogenese, og medlemmer av nevrogeninfamilien (NGN), spesielt NGN2, har blitt identifisert som effektive drivere10. Det lentiviralmedierte ektopiske uttrykket av NGN2 i hiPSCs akselererte tidlige stadier av nevrondifferensiering signifikant, og induserte nevroncelleskjebne innen bare 1 uke11. Etterfølgende terminal modning i kokulturer med astrocytter ga funksjonelle nevroner i høy renhet og mengde med reproduserbare egenskaper. Stedsrettet genredigering av adenoassosiert virusintegrasjonssted 1 (AAVS1) safe-harbor locus ble deretter brukt for å lage hiPSC-linjer med en stabil og doksycyklininduserbar ekspresjonskassett for NGN212,13, og dermed minimere uønskede bivirkninger av lentiviral levering.
Den robuste og effektive differensieringen av doksysyklininduserbare neurogenin 2 (iNGN2) nevroner har stort potensial for fenotypiske medikamentscreeninger med høy gjennomstrømning og toksisitetsanalyser10,14,15; Og det er gjort betydelige fremskritt i bioprosessering i løpet av det siste tiåret med implementering av bioreaktorer for en skalerbar celleutvidelse og differensiering16,17,18,19. Imidlertid er de fleste differensieringsprotokoller optimalisert for adherente kulturer, og oversettelse til et tredimensjonalt (3D) miljø krever ofte viktige modifikasjoner. Nylig har vellykket bruk av en stasjonær 3D-bioreaktor med reduserte skjærspenningsfunksjoner blitt rapportert for utvidelse av hissc og for reproduserbar differensiering i hepatocytter, kardiomyocytter og nevroner20. Her er en detaljert protokoll for generering og karakterisering av iNGN2-nevroner gitt ved hjelp av den identiske benchtop 3D-bioreaktoren.
Protocol
MERK: Alle cellemanipulasjoner, samt kulturretter og mediumpreparater, skal utføres under sterile forhold. Avtrekkshetten for laminær luftstrøm bør rengjøres grundig før bruk og etter bearbeiding ved å tørke av alle overflatene med 70 % etanol. Den beskrevne protokollen er optimalisert for nevrondifferensieringer i en CERO 3D-inkubator og bioreaktor (i det følgende referert til som stasjonær bioreaktor). Denne stasjonære bioreaktoren tilbyr fire spor for spesialiserte bioreaktorrør, hver med en maksimal kapasitet på 50 ml. Temperatur og CO2 -nivåer kontrolleres kontinuerlig, og dyrkingsparametere (f.eks. rotasjonshastighet og tid) reguleres for hvert rør uavhengig. Alle aspirasjonstrinn er utført ved hjelp av en aspirasjonspipette og vakuumpumpe, hvis ikke annet er angitt.
1. Dyrking og utvidelse av hiPSCer
MERK: Den konstruerte doxycyklininduserbare NGN2 hiPSC-linjen BIONi010-C-13 brukes i denne protokollen. Utvidelsesprotokollen som er gitt her er optimalisert for 6 cm petriskåler, men alternative kulturformater kan brukes hvis ønskelig.
- Strøk 6 cm petriskåler med kjellermembranmatrise fortynnet i kaldt Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM)/F12 (-/-) ved en endelig konsentrasjon på 0,083 mg/ml/10 cm2. Inkuber de bestrøkne ved 37 °C i minst 30 minutter.
MERK: En detaljert protokoll for fremstilling av kjellermembranmatriseløsning finnes i produsentens instruksjoner. hiPSCs kan dyrkes på alternative ekstracellulære matriser for ekspansjon. - Tine kryopreserverte hiPSCer i henhold til EBiSC Cell line User Protocol21 i materfritt iPSC vedlikeholdsmedium + 10 μM ROCK-hemmer (Y-27632). En såtetthet på 1 × 106 levedyktige celler per 60 mm tallerken anbefales.
- Bytt medium neste dag til materfritt iPSC vedlikeholdsmedium uten ROCK-hemmer, og utfør daglige mediebytter.
- Begynn å passere når hiPSC-kulturene når et sammenløp på 60% -80%. Sjekk for differensierte områder og rengjør koloniene manuelt hvis området overstiger 5%.
MERK: Udifferensierte hiPSCer vises som runde celler med en fremtredende nukleolus og mindre cytoplasma. Flate og tettpakkede kolonier dannes tidlig etter tining eller passering. Eksempler på lysfeltbilder av hiPSC-kulturer er vist i figur 1. Ytterligere informasjon er gitt i EBiSC Cell line User Protocol21. For passering, tilbered kjellermembranmatrisebelagte retter og materfritt iPSC-vedlikeholdsmedium. - Aspirer mediet fra hiPSC-kulturer og skyll cellene 2x med 0,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) uten Ca 2+ og Mg2+ (DPS [-/-], se materialtabell).
- Fjern supernatanten og tilsett 2 ml 0,5 mM EDTA i 1x DPBS (-/-) til 6 cm petriskålene. Inkuber cellene ved 37 °C i 3 minutter i inkubatoren.
- Aspirer 1,5 ml av EDTA-løsningen og fortsett inkubasjonen i 3-5 minutter.
- Trykk forsiktig på oppvasken for å lette celleløsningen.
MERK: Sjekk løsrivelse ved visuell vurdering. hiPSC-kolonier bør begynne å løsne etter 5 min, men en lengre inkubasjonstid kan være nødvendig med høyere konfluente hiPSC-kulturer. Hvis koloniene ikke løsner, øker inkubasjonstiden til 10 minutter, men ikke overskride denne tidsrammen. - Tilsett 5 ml materfritt iPSC vedlikeholdsmedium til 6 cm petriskålene, og resuspender koloniene forsiktig 2x med en 10 ml serologisk pipette eller ved å bruke brede pipettespisser. Overfør cellene til et 15 ml rør.
MERK: hiPSCs er svært følsomme for mekanisk stress; Dermed bør flere resuspendering unngås. Den endelige cellesuspensjonen skal bestå av små kolonifragmenter (50-200 μm). - Aspirer supernatanten fra de belagte kulturfatene, og tilbered 4 ml materfritt iPSC vedlikeholdsmedium per 6 cm tallerken.
- Overfør små kolonifragmenter til de nylagde kulturrettene i delte forhold på 1:10 til 1:40, og dyrk ved 37 ° C og 5% CO2 med daglige medieendringer.
MERK: Små kolonier bør feste innen 1 eller 2 timer etter passering.
Figur 1: Morfologi av humane induserte pluripotente stamcellekulturer . (A,B) HiPSC-kulturer av god kvalitet med ulik sammenløp som viser komprimerte hiPSC-kolonier med homogen morfologi og definerte kanter. (C) hiPSC-kultur med nye klynger av differensierte celler rundt kolonikantene (stiplet hvit linje). Skala bar = 200 μm. Forkortelse: hiPSC = humanindusert pluripotent stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Prekultivering av hiPSCs i det stasjonære bioreaktorsystemet (dag-2)
MERK: Start prekultivering når hiPSC-kulturene når et sammenløp mellom 60% og 80%. Sjekk hiPSC-koloniene for differensierte områder. I løpet av denne prekultiveringsfasen opprettholdes hissc-ene i materfritt iPSC vedlikeholdsmedium i 2 dager.
- Forbered dyrkningsmediet, bestående av materfritt iPSC vedlikeholdsmedium og 10 μM ROCK-hemmer (Y-27632).
- Aspirer mediet helt fra hiPSCene og skyll forsiktig cellene med 1x DPBS (-/-) to ganger.
- Tilsett 2,0 ml forvarmet trypsin-EDTA-oppløsning til 6 cm petriskålene og inkuber cellene i 3 minutter ved 37 °C i inkubatoren.
- Bank forsiktig på oppvasken for å lette celleløsningen, eller rug i 1-2 minutter lenger.
- Resuspender cellene i 5 ml materfritt iPSC vedlikeholdsmedium + ROCK-hemmer per tallerken. Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml eller 50 ml rør og bland forsiktig ved pipettering for å sikre cellesingularisering.
- Bestem cellenumrene i 100 μL cellesuspensjon ved hjelp av en automatisert celleteller som tidligere beskrevet20. Overfør tilsvarende volum for 15 × 106 celler per bioreaktorrør til et 50 ml rør.
- Sentrifuge cellene ved 300 × g i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 2 ml materfritt iPSC vedlikeholdsmedium + ROCK-hemmer.
- Fyll opp hvert 50 ml rør med 18 ml medium (cellesåtetthet på 0,75 × 106 celler/ml). Dispenser cellesuspensjonen i bioreaktorrørene (20 ml per rør).
- Plasser rørene i bioreaktorsystemet. Still inn følgende dyrkingsparametere: 2 s rotasjonsperiode, 60 o / min rotasjonshastighet, ingen omrøringspause, 37 ° C og 5% CO2 for ubegrenset varighet20.
- Start dyrkingsprogrammet via bioreaktordisplayet.
- Bytt media neste dag. La aggregatene slå seg ned i bioreaktorrørene i ~5 min. Aspirer supernatanten forsiktig.
MERK: Ikke la aggregatene slå seg ned i mer enn 10 minutter, da de kan feste seg til hverandre og bygge en heterogen aggregatfjæring. Det anbefales å la ~ 5 ml kulturmedium ligge i bioreaktorrøret. - Tilsett 15 ml ferskt materfritt iPSC vedlikeholdsmedium uten ROCK-hemmer per rør, og fortsett dyrkingen i den stasjonære bioreaktoren i 24 timer.
3. Differensiering av hiPSCs i tidlige nevroner (dag 0)
- Forbered nevrobasalt medium (NBM): 50% DMEM / F-12 med stabilisert L-alanyl-L-glutamindipeptid, 50% nevrobasalt medium, 0,5x serumfritt supplement (50x), 0,5x serumfritt tilskudd basert på Bottensteins N-1-formulering (100x), 0,5x stabilisert L-alanyl-L-glutamindipeptid, 0,5x MEM ikke-essensielle aminosyreoppløsning (100x), 500 nM natriumpyruvat (100 mM), 50 nM 2-merkaptoetanol (50 mM), 0,025% human insulinoppløsning og 5 U / ml penicillin-streptomycin.
MERK: NBM må oppbevares ved 4 °C og kan brukes i opptil 2 uker. - Start nevrondifferensiering ved å tilsette doksycyklin (DOX) til hiPSC-kulturene. For dette, la aggregatene slå seg ned i bioreaktorrørene. Aspirer supernatanten forsiktig fra cellene, etterlat ~5 ml i røret, og tilsett 35 ml nevrale induksjonsmedium (NIM) bestående av NBM og 2 μg/ml DOX.
MERK: Siden DOX er lysfølsom, anbefales det å slå av lyset mens du arbeider. - Plasser rørene tilbake i den stasjonære bioreaktoren og fortsett dyrkingen.
- Utfør medieendringer hver dag i 2 dager, som beskrevet i trinn 3.2.
MERK: Etter 4 dager i suspensjonskultur kan aggregatene dissosieres, og tidlige nevroner kryopreserveres eller repliseres direkte for terminal modning.
4. Kryopreservering av tidlige nevroner (dag 2)
MERK: Kryopreservering er ikke nødvendig og ikke kritisk for differensieringsprosessen, men sterkt anbefalt da store lagre av tidlige nevroner kan produseres og lagres for senere modning og analyser.
- La aggregatene slå seg ned i bioreaktorrøret. Aspirer supernatanten som tidligere beskrevet.
- Overfør aggregatene til et sterilt 15 ml eller 50 ml rør og skyll aggregatene forsiktig 2x med 1x DPBS (-/-). Aspirer supernatanten forsiktig så mye som mulig uten å forstyrre aggregatene.
- Tilsett 2-5 ml forvarmet celledissosiasjonsenzym, avhengig av pelletsstørrelsen, og inkuber cellene i ca. 10 minutter ved 37 °C i et vannbad. Forsiktig resuspendere de sedimenterte aggregatene hvert 2. minutt til aggregatene dissosieres.
MERK: En nesten homogen cellesuspensjon bør oppnås etter 7-10 min inkubasjon. - Legg til trippelvolumet av forvarmet NBM-medium og resuspender cellene forsiktig for å sikre cellesingularisering.
- Bestem cellenumrene og overfør det tilsvarende volumet for kryopreservering til et 15 ml eller 50 ml rør.
MERK: En celletetthet på 5-10 × 106 celler / ml frysemedium anbefales. - Sentrifuge cellene ved 300 × g i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten forsiktig i det tilsvarende volumet av frysemedium inneholdende 10 % dimetylsulfoksid (DMSO).
- Aliquot cellesuspensjonen i egnede hetteglass for kryopreservering (1 ml/hetteglass).
- Overfør hetteglassene umiddelbart til en forkjølt, sakte frysebeholder fylt med 2-propanol og sett beholderen ved -80 °C over natten. Sett hetteglassene ved -150 °C neste dag for langtidsoppbevaring.
MERK: Væsken 2-Propanol er svært brannfarlig og kan forårsake øyeskader ved kontakt. Holdes borte fra varme og bruk vernehansker samt briller.
5. Modning av hiPSC-avledede nevroner i monolagskulturer
- Forbered poly-L-ornitin / lamininbelagte kulturretter for langsiktig dyrking av hiPSC-avledede nevroner.
- Fortynn poly-L-ornitinstamløsningen til 0,001 % i 1x DPBS (-/-) og belegg oppvasken over natten ved 4 °C, eller i 4 timer ved 37 °C. Aspirer poly-L-ornitinoppløsningen og vask platene en gang med 1x DPBS (-/-).
- Fortynn lamininoppløsningen i 1x DPBS (-/-) til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml og inkuber oppvasken over natten ved 4 °C, eller i 4 timer ved 37 °C.
MERKNAD: Et volum på 0,1-0,15 ml per cm 2 anbefales for beleggprosedyrene, og 0,2 ml per cm2 for alle respektive vasketrinn. Alternative beleggsubstrater kan brukes, men potensielle effekter på cellefeste og modning bør vurderes.
- Tine de kryopreserverte cellene. For dette, plasser cryovialet i et vannbad (satt til 37 ° C) og virvle det i ca. 1 min, til en liten klump av frossen cellesuspensjon er igjen.
- Overfør forsiktig cellesuspensjonen dråpevis til et 15 ml rør tilberedt med 10 ml forvarmet NBM. Skyll kryovialet med 1 ml NBM og overfør cellesuspensjonen til det identiske 15 ml røret.
- Sentrifuge cellene ved 300 × g i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten og tilsett 1-2 ml NIM supplert med 10 μM ROCK-hemmer.
- Resuspender cellepelleten nøye og bestem cellenumrene.
- Aspirer den gjenværende lamininoppløsningen fra de belagte cellekulturfatene og frø cellene med en såtetthet på 1 × 105 celler/cm2 i NIM supplert med 10 μM ROCK-hemmer.
- Bytt medium etter 24 timer til NIM uten ROCK-hemmer.
- Utfør daglige middelendringer i 4 dager.
- Etter denne innledende fasen av NGN2-induksjon, utelater DOX og dyrker cellene i NBM, med halvmedieendringer 2x i uken til du når ønsket modningsstadium.
MERK: Samdyrking av iNGN2-nevroner med astrocytter anbefales for å øke celleoverlevelse, tilknytning, modenhet og elektrisk aktivitet13,22.
6. Karakterisering av hiPSC-avledede nevroner
MERK: Differensiering i nevronderivater kan evalueres ved hjelp av følgende teknikker.
- Immunocytokjemi og bildediagnostikk
- Aspirer mediet fra de hiPSC-avledede nevronene og vask cellene en gang med 1x DPBS med Ca 2+ og Mg2+ (+/+).
MERK: Pipett forsiktig, fortrinnsvis på brønnkantene, da cellene kan løsne veldig lett fra overflaten. Et volum på 0,2 ml per cm2 anbefales for alle vasketrinn for å sikre en fullstendig dekning av celler med 1x DPBS (+/+). - Fest nevroncellene ved hjelp av en fikseringsløsning som inneholder 4% paraformaldehyd i DPBS (+/+) i 15 minutter ved romtemperatur (RT). Et volum på 0,1 ml per cm2 anbefales.
MERK: Paraformaldehyd (4%) i DPBS er en farlig og hudirriterende løsning med akutt toksisitet og potensiell kreftfremkallende. Holdes borte fra varme, bruk vernehansker og briller, unngå innånding, og bruk løsningen bare i ventilerte omgivelser. - Skyll forsiktig cellene 2x i 1x DPBS (+/+) og fortsett med farging.
MERK: Faste celler kan lagres i DPBS (+/+) ved 4 °C i opptil 1 måned inntil videre behandling. - Aspirer DPBS (+/+) fra prøver. Permeabiliser cellene og blokker ikke-spesifikke bindingssteder med 1x DPBS (+/+) som inneholder 1% BSA og 0,2% Triton-X-100 i 60 minutter ved RT.
MERK: Et volum på 0,2 ml per cm2 anbefales. - Fjern supernatanten og inkuber cellene over natten ved 4 °C, med respektive primære antistoffer fortynnet i fargebuffer (1x DPBS [+/+] inneholdende 1 % BSA) (se materialfortegnelse). Forsikre deg om at cellene er helt dekket av løsningen.
MERK: Et volum på 0,1-0,15 ml per cm2 anbefales. - Aspirer fargebufferen og skyll cellene 3x i 1x DPBS (+/+).
- Fortynn de tilsvarende sekundære antistoffene (se materialtabell) i fargebuffer ved en endelig konsentrasjon på 1:1,000.
- Inkuber cellene i fortynnet antistoffoppløsning i 1 time ved RT i mørket. Forsikre deg om at cellene er helt dekket av løsningen.
MERK: Et volum på 0,1-0,15 ml per cm2 anbefales. - Aspirer den sekundære antistoffløsningen og skyll cellene 2x i 1x DPBS (+/+).
- Motflekk kjernene med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), fortynnet i DPBS (+/+) i 5 min ved RT.
MERK: Et arbeidsvolum på 0,1-0,15 ml per cm2 anbefales. - Skyll cellene 2x i 1x DPBS (+/+).
- Oppbevar cellene i DPBS (+/+) ved 4 °C til avbildning.
MERK: Brightfield-avbildning er egnet til å spore morfologiske endringer og nevrittutvekst. I tillegg kan stereotypt markøruttrykk vurderes ved fluorescensmikroskopi. Mens udifferensierte hiPSCs uttrykker OCT 3/4 og NANOG, kan beta-III-tubulin (TUBB3) og mikrotubuli assosiert protein 2 (MAP2) tjene som nevronale markører for visualisering av nevritter og axoner. Det nevrittiske nettverket kan vurderes videre ved å bestemme nevrittlengden i lysfelt eller fluorescerende bilder.
- Aspirer mediet fra de hiPSC-avledede nevronene og vask cellene en gang med 1x DPBS med Ca 2+ og Mg2+ (+/+).
- Genekspresjonsanalyser ved kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qPCR)
- Aspirer mediet og skyll cellene en gang i 1x DPBS (-/-).
MERK: Et volum på 0,2 ml per cm2 anbefales. - Legg til kald RNA-lysisbuffer og høst cellene ved å skrape.
- Isoler RNA ved hjelp av et egnet kolonnebasert sett, og bestem RNA-konsentrasjonene ved UV-fotospektrometri.
- Generer cDNA ved hjelp av 250 ng totalt RNA og et passende sett for revers transkripsjon.
- Forbered molekylære fyr qPCR -reaksjoner som inneholder 2.5 ng cDNA i duplikat. Bruk en passende masterblanding og tilsvarende primeranalyser20 (se Materialfortegnelse).
- Kjør qPCR ved å påføre 45 sykluser med primerglødning ved 60 °C i 20 s.
- Normaliser relative genuttrykksnivåer til gjennomsnittet av husholdningsgenene GAPDH, HPRT1 og GUSB. Bruk ΔΔCt-metoden23 ved å bruke udifferensierte hiPSCer som kalibrator.
- Aspirer mediet og skyll cellene en gang i 1x DPBS (-/-).
Representative Results
Under de første trinnene blir adherente kulturer av hissc løsrevet, singularisert og overført til suspensjon (figur 2). Aggregater dannes innen 24 timer og vokser kontinuerlig i størrelse. Etter 2 dager med transgen induksjon kan tidlige nevroner kryopreserveres for påfølgende eksperimenter.
Den vedvarende spredningen i løpet av de første dagene i suspensjon gir en økning i celleantall, og når sitt høydepunkt etter 2 dagers induksjon (figur 3A,B). Sammen med spredningen begynner aggregatene å vokse. Sammenlignet med dag 0 viser diameteren en økning på 50 % på dag 2, og er nesten doblet på dag 5 (figur 3D). Selv om en økende diameter begrenser næringstilførselen inne i aggregatene, påvirkes ikke cellens levedyktighet på dag 2 eller ved dag 5 av differensiering (figur 3C). En langvarig dyrking i mer enn 4 dager i suspensjon forbedrer imidlertid ikke celleutbyttet ytterligere, da aggregatene blir stadig mer motstandsdyktige mot enzymatisk singularisering (figur 3B).
Ved kryopreservering tines dag 2-celler og belegges på poly-L-ornitin (PLO)-laminbelagte retter for terminal modning. Generelt fester cellene seg veldig godt etter tining, og begynner å utvide nevritter tidlig. Den temporale genuttrykksprofilen, samt immuncytokjemisk farging for nevronmarkørene TUBB3 og MAP2, bekrefter nevroncelleidentitet (figur 4A,B). I tillegg til stigende nivåer av TUBB3 og MAP2, er nevronkulturer beriket i mikrotubuli-assosiert protein tau-transkripter (MAPT), som koder for et nevronprotein involvert i aksonstabilisering, og viser en samtidig nedgang i uttrykket av den pluripotensregulerende transkripsjonsfaktoren POU5F1. Videre dannes et tett nevrittisk nettverk innen den første uken etter tining (figur 4C). Disse morfologiske endringene, i forbindelse med transkripsjonsprofilen, antyder en økende modning av nevronkulturer.
Figur 2: Generering av hiPSC-deriverte iNGN2-nevroner ved hjelp av en stasjonær bioreaktor. (A) Skjematisk oversikt over differensieringsparadigmet, som fremhever nøkkeltrinnene i cellekultur. (VG Nett) Brightfield-bilder visualiserer (B) hiPSCs og (C,D) dannelsen av aggregater i den stasjonære bioreaktoren. (E,F) iNGN2-nevroner utvider nevritter og gjennomgår morfologiske endringer under differensiering. Skala bar = 100 μm. Forkortelser: BMM = kjellermembranmatrise; iPSC-MM = iPSC vedlikeholdsmedium; PLO = poly-L-ornitin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Celleutbytte og levedyktighet under aggregatdannelse og vekst. (A) Brightfield-bilder viser dannelsen av aggregater innen 2 dager etter kultur i benchtop-bioreaktoren, samt økningen i samlet størrelse over tid. Skala bar = 500 μm. (B) Kvantifisering av celleutbyttet og (C) levedyktighet over differensieringskurset. Søylediagrammer representerer gjennomsnittet + SD fra fire uavhengige eksperimenter. (D) Diameteren, som indikerer størrelsen på aggregater, ble bestemt halvautomatisk ved hjelp av åpen kildekode-programvaren ImageJ (versjon 1.53). Først ble lysfeltbilder konvertert til binære bilder, og deretter vurdert videre ved hjelp av analysepartikkelverktøyet, ved å bruke følgende parametere: størrelse > 2,500 μm2, sirkularitet 0,45-1, ekskluder kanter og inkluderer hull. Horisontale linjer angir gjennomsnittlig ± SD av fem uavhengige differensieringer. Enkeltpunkter representerer gjennomsnittet av individuelle differensieringseksperimenter med minst 20 aggregater per tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av hiPSC-deriverte iNGN2-nevroner. Temporal genuttrykksprofil for nevrongenene TUBB3, MAP2 og MAPT, samt det pluripotente stamcelleassosierte genet POU5F1. Relative ekspresjonsnivåer ble normalisert til referansegenene GAPDH, HPRT1 og GUSB. Udifferensierte hiPSCer (dag-2) ble valgt som kalibrator. De geometriske symbolene indikerer gjennomsnittlig ± SD av fire uavhengige differensieringer. (B) Representative bilder av iNGN2-nevroner ved dag 7 etter tining (dag-2 + 7), farget for beta-III-tubulin (TUBB3, magenta) og mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2, cyan). Cellekjerner ble kontrafarget med DAPI. Skalastenger = 100 μm. (C) Evaluering av det nevrittiske nettverket i lysfeltbilder av nevronkulturer etter tining. Den totale lengden på nevritter ble bestemt i et område på 930,82 × 698,11 μm2 ved bruk av ImageJ (versjon 1.53). Etter å ha justert lysstyrken og kontrasten, ble bildene konvertert til 8-bits bilder og fargene ble invertert. Nevritter ble deretter skjelettisert og deretter analysert ved hjelp av henholdsvis ImageJ-pluginene 'Skeletonize' og 'Analyze Skeleton'. Den totale lengden av nevritter ble delt på antall somas i regionen av interesse for å gi gjennomsnittlig nevittlengde / celle. Søylediagrammer representerer gjennomsnittet + SD fra tre uavhengige eksperimenter. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Det ektopiske uttrykket av den nevronale transkripsjonsfaktoren NGN2 har tidligere vist seg å akselerere tidlige stadier av nevronal differensiering og indusere nevronavstamningsforpliktelse i hissc innen 1 uke etter dyrking12,13,20. Dette arbeidet beskriver en detaljert protokoll for differensiering av genredigerte BIONi010-C-13 hiPSCs til iNGN2-nevroner ved hjelp av en stasjonær bioreaktor.
CERO 3D bioreaktor er en lavvolum bioreaktor med fire spor for spesialiserte rør, hver med en maksimal kapasitet på 50 ml. Temperatur og CO2 -nivåer kontrolleres kontinuerlig og dyrkingsparametere (f.eks. rotasjonshastighet og tid) reguleres for hvert rør, uavhengig av hverandre slik at brukerne kan kjøre flere differensieringsmetoder parallelt. Integrerte bølgebrytere på den indre rørveggen tillater forstyrrelse av mediet med lav skjærspenning og opprettholder 3D-aggregater i suspensjon under kontrollert rotasjon. Begrenset tilgang til næringsstoffer, samt påtvungne 3D-celle- og celleekstracellulære matriseinteraksjoner (ECM), kan påvirke cellulær differensiering og oppførselbetydelig 24,25,26,27.
Dyrking av celler som 3D-aggregater i suspensjon øker disse celleinteraksjonene, og etterligner dermed in vivo-miljøet i vev eller organer nærmere28. Den samtidige forstyrrelsen av mediet regulerer aggregatstørrelsen på grunn av mekanisk friksjon, forbedrer gassutvekslingen og reduserer gradienten av næringsstoffer og avfall i røret, samtidig som fysiologiske relevante gradienter inne i aggregatene bevares 29,30,31,32,33,34. Selv om middels endringer utføres manuelt, reduserer den stasjonære bioreaktoren arbeids- og driftskostnader sammenlignet med statiske kulturkolber. Bioreaktoren gir også flere fordeler i forhold til helautomatiske omrøringsbioreaktorer, da impellerfri design reduserer hydrodynamisk skjærspenning på den samlede overflaten, og dermed ikke bare forbedrer celleoverlevelse, men begrenser også effekten av skjærspenning på følsomme iPSCer, celledifferensiering og funksjon35,36,37,38.
Vertikale hjulbioreaktorer, hvor celler omrøres av et stort vertikalt løpehjul, samt gyngebevegelsesbioreaktorer ved hjelp av oppblåste kulturposer festet til en motorisert plattform, representerer alternative 3D-fjæringsplattformer. Selv om det er overdrevent testet for dyrking av hiPSCs 17,18,19,39,40, er lite kjent om deres anvendelighet i nevrondifferensieringstilnærminger, og rapporter er begrenset til vellykket utvidelse av pattedyrs og humane nevrale forløperceller i røretankbioreaktorer 41,42,43,44, med et sjeldent antall studier som fokuserer på modning44,45. Generelt gir automatiserte 3D-hengeplattformer fordelen av helautomatiske og datastyrte mediumendringer, og reduserer dermed variasjoner i håndtering og minimerer risikoen for kontaminering. Videre kan næringsparametere som laktat- og glukosekonsentrasjon overvåkes kontinuerlig. Imidlertid krever etableringen av disse systemene ofte en betydelig innledende investering, laboratorieplass og opplæring av kvalifisert personell. Den stasjonære bioreaktoren representerer et kompakt og brukervennlig alternativ for dyrking av celler i suspensjon, men gir ikke samtidig overvåking av næringsstoffer.
Som i de fleste protokoller som brukes til dyrking av celler i 3D-suspensjonsplattformer, representerer den første dannelsen av aggregater et kritisk trinn. hiPSCer dyrkes som adherente monolag og overføres deretter som encellesuspensjoner til et 3D-miljø. For å minimere celletap på det stadiet, må flere aspekter vurderes. Utformingen av rørene med de integrerte bølgebryterne betyr at et minimalt kulturvolum på 10 ml per rør er nødvendig for å sikre optimal medium forstyrrelse. Det kritiske volumet bør derfor ikke undergraves på lang sikt. Videre anbefales en startsåingstetthet på 7,5 millioner celler per 10 ml kulturvolum, og en rotasjonshastighet på 60 o / min, for å danne stabile aggregater på kort sikt, selv om tilpasninger kan være nødvendige avhengig av cellelinjen.
Etter overføring av hiPSCs til suspensjon, bør aggregater dannes innen 24 timer. Den første medieendringen er kritisk, da aggregatene er små og kanskje ikke legger seg ordentlig. Tiden for sedimentering av aggregater kan forlenges, men bør ikke overstige mer enn 10 min, da aggregater kan begynne å klumpe seg og vokse på en heterogen måte. Under aspirasjon bør et minimalt kulturvolum på 5 ml være igjen i røret, og eventuelle forstyrrelser i mediet bør unngås. Likevel må man forvente tap av celler og aggregater i de innledende fasene. Celletall indikerer et konstant celleutbytte i løpet av de første 2 dagene i kultur, noe som indikerer at den høye proliferative kapasiteten til hiPSCs kompenserer for det første celletapet. Når den er i suspensjon, fører den milde dyrkingen og forstyrrelsen til homogent store aggregater som begynner å vokse over tid.
Neuronal differensiering ble utført i henhold til en tidligere publisert protokoll basert på doksysyklinindusert NGN2-overekspresjon13, og de enkelte trinnene ble optimalisert for en 3D-dyrking. Den neuronale transkripsjonsfaktoren NGN2 er en velbeskrevet driver i nevronal differensiering og akselererer nevroninduksjon signifikant11,13,46. Mens konvensjonelt mønster med definerte vekstfaktorer tar flere uker til måneder 7,8,9, induserer NGN2-ekspresjon nevroncelleskjebne i løpet av dager. I tillegg til den forkortede dyrkingstiden er protokollen verken avhengig av dyre vekstfaktorer eller beleggmatriser for den første opphengskulturen, og reduserer dermed dyrkingskostnadene ytterligere.
Videre viste en direkte sammenligning av den NGN2-drevne generasjonen av umodne nevroner i adherente og suspensjonskulturer en 1,36 ganger økning i celler etter 4 dager i kultur ved bruk av den stasjonære bioreaktoren20, mens volumet av medium som kreves for generering av 1 million celler forventes å bli halvert. Bruk av stasjonær bioreaktor for generering av iNGN2-nevroner kan derfor være fordelaktig, da et høyere antall celler kan produseres med lavere håndteringstid og kostnad. I tråd med tidligere rapporter ble nevronal avstamningsforpliktelse observert tidlig. Etter 2 dager med NGN2-induksjon var et dypt uttrykk for klassiske nevronmarkører som TUBB3, MAP2 og MAPT tydelig, noe som støttet anvendeligheten av den stasjonære bioreaktoren for nevronal induksjon. Etter denne protokollen kan omtrent 6,2 millioner umodne iNGN2-nevroner fås fra 1 million hissc innen 4 dager etter kultur. Utgangskapasiteten kan imidlertid variere mellom partier og avhenge av volumet av suspensjonskultur ved såing.
For å øke utbyttet ytterligere ble dyrkingstiden forlenget i ytterligere 3 dager; Men selv om aggregatene ble større, ble de også svært kompakte og kunne ikke ordentlig dissosieres for kryopreservering eller replating. Til tross for fremskritt innen 3D-kulturtilnærminger, er adherente 2D-nevronkulturer fortsatt gullstandarden for funksjonelle analyser som mikroelektroderader eller kalsiumavbildning. Cellesingularisering er dermed en viktig forutsetning for et homogent fordelt nevronalt monolag og nevrittisk nettverk. Sterkere mekanisk løsrivelse av cellene eller harde dissosiasjonsreagenser kan brukes til å sikre singularisering, men med potensielle effekter på celle levedyktighet, fysiologi og re-vedleggskapasitet47,48. Med hensyn til behovet for enkeltceller for videre analyser og modning, ble aggregater dissosiert etter 4 dager i suspensjon, og (dag 2) iNGN2-nevronene kryopreservert. Post-tine differensiering og karakterisering av iNGN2 nevroner bekreftet en økende modenhet av nevronkulturer og dannelsen av et tett neurittisk nettverk.
Den medfølgende protokollen gir et høyt antall iNGN2-nevroner. Det er imidlertid flere begrensninger som må vurderes. Som for de fleste suspensjonskulturplattformer, er overføringen av hiPSCs fra en 2D-tilhengerkultur til et 3D-miljø kritisk og ofte forbundet med et dypt celletap. Ytterligere betydelig celle- og aggregert tap forventes under medieendringer. Sammenlignet med automatiserte plattformer økes håndteringstiden og forurensningsrisikoen ved bruk av den stasjonære bioreaktoren, da middels endringer må utføres manuelt. Bortsett fra mangel på automatisering, tilbyr ikke den stasjonære bioreaktoren muligheten til å overvåke næringsstoffene, og den maksimale kapasiteten på 50 ml per rør begrenser oppskaleringspotensialet til protokollen. Til slutt er det viktig å merke seg at selv om NGN2 akselererer neuronal avstamningsforpliktelse, blir varigheten av terminal modning ikke forkortet og krever fortsatt langsiktig kultur over flere uker. Gitt viktigheten av astrocytisk støtte for nevronfunksjon, tilknytning og overlevelse 49,50,51, bør samkulturtilnærminger vurderes, og kan til og med være avgjørende for langsiktig dyrking.
Oppsummert ble en 2D-differensieringsprotokoll vellykket oversatt til et 3D-miljø for rask og reproduserbar generering av iNGN2-nevroner ved å implementere en stasjonær bioreaktor. Den beskrevne protokollen gir høye mengder av iPSC-avledede nevroner av god kvalitet, som kan tjene som utgangspunkt for kompleks modelltesting, legemiddelscreeninger med høy gjennomstrømning og toksisitetsanalyser i stor skala.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
EBiSC2-prosjektet har mottatt støtte fra Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) under tilskuddsavtale No 821362. JU mottar støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 og EFPIA. Vi takker Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters og Vanessa M. Nalewaja for deres hjelp med immuncytokjemiske og genuttrykksanalyser, samt Heike Arthen for hennes utmerkede tekniske støtte. Videre takker vi Stephanie Bur for etableringen av bioreaktorprogrammet. Figur 2A ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
| 60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
| Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
| BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
| Biorender | Biorender.com | ||
| BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
| CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
| CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
| Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
| CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
| Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
| DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
| Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
| DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
| ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
| MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
| Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
| mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
| Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
| Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
| NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
| Origin 2021 | OriginLab | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
| Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
| RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
| Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
| StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
| TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
| Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
| X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
| Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |
References
- Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
- Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
- Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review. , Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016).
- van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
- van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
- Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
- Shih, P. -Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
- Chang, C. -Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
- Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
- Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
- Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
- Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
- Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
- Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
- User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC. , Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023).
- Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
- Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
- Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
- Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
- Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
- Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
- Liu, N., Zang, R., Yang, S. -T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
- Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
- Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
- Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
- Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
- Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
- Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
- Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
- Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
- Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
- Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
- Allen, N. J.
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L.
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).
