Summary
この記事では、ベンチトップ3D懸濁バイオリアクターにおけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンの生成のためのプロトコルについて説明します。
Abstract
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)からの神経系譜細胞の誘導は、脳研究におけるマイルストーンを示しました。最初の登場以来、プロトコルは継続的に最適化されており、現在では研究や医薬品開発で広く使用されています。しかし、これらの従来の分化および成熟プロトコルの非常に長い期間と、高品質のhiPS細胞とその神経誘導体に対する需要の高まりにより、これらのプロトコルの大規模生産への採用、最適化、および標準化の必要性が高まっています。この研究は、ベンチトップ3次元(3D)懸濁バイオリアクターを使用して、遺伝子組み換えドキシサイクリン誘導性ニューロゲニン2(iNGN2)発現hiPS細胞をニューロンに分化させるための迅速かつ効率的なプロトコルを提示します。
簡単に言うと、iNGN2-hiPS細胞の単一細胞懸濁液は24時間以内に凝集体を形成させ、ドキシサイクリンの添加によって神経系統の関与が誘導されました。凝集体は誘導の2日後に解離し、細胞は凍結保存されるか、最終成熟のために再播種されました。生成されたiNGN2ニューロンは、早期に古典的なニューロンマーカーを発現し、リプレーティング後1週間以内に複雑な神経突起ネットワークを形成し、ニューロン培養の成熟度が高まっていることを示しました。要約すると、疾患モデリング、表現型のハイスループット薬物スクリーニング、および大規模な毒性試験の出発点として大きな可能性を秘めた、3D環境でのhiPS細胞由来ニューロンの高速生成のための詳細な段階的なプロトコルが提供されます。
Introduction
神経障害は、世界中の障害の主な原因です1。6人に1人が罹患しており、発生率は上昇し続けています。社会とその医療制度に対する関連する財政的負担は莫大です。2010年に欧州30カ国を評価したところ、精神障害および神経障害に関連する年間コストは8,000億ユーロと推定されています2。社会経済的負担の増大は効果的な治療戦略を要求し、疾患の病態生理学の理解は大幅に増加しましたが、診療所への翻訳はしばしば不十分です。一般に、臨床試験に入る医薬品はわずか12%であり、そのうち80%以上が、主に有効性または予期しない毒性のために、後の段階で失敗します3,4。理由はさまざまですが、前臨床段階の動物実験からヒト試験への移行可能性の限界がますます前面に出てきています5。ヒトin vitro細胞および組織モデルは、種間翻訳のギャップを埋める可能性があり、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)技術の進歩はこの点で大きな可能性を秘めています。hiPS細胞は基礎研究で広く使用されており、胚破壊に関連する倫理的懸念を回避しながら、ほぼ無制限の自己複製能力や3つの胚葉すべてに分化する能力など、胚性幹細胞(hESC)と本質的な特性を共有しています6。
hESCからの神経細胞の誘導、そしてその後のhiPS細胞は、脳研究におけるマイルストーンをマークしました。初期の分化プロトコルは、胚形成中の重要なステップを模倣する成長因子の適用に基づいており、それらのほとんどは、浮遊培養または付着培養のいずれかにおける二重SMAD阻害を伴う7、8、9。成熟ニューロンは正常に生成されていますが、これらのプロトコルのいくつかの欠点は、生成されたニューロンの低収率と高いバッチ間の変動性、および長い培養時間に関連する広範な作業負荷など、医薬品開発における幅広い使用を依然として妨げています。改善は、神経新生に決定的に関与する転写因子の強制発現によって達成されており、ニューロゲニン(NGN)ファミリーのメンバー、特にNGN2が有効なドライバーとして同定されている10。hiPS細胞におけるNGN2のレンチウイルス媒介異所性発現は、神経分化の初期段階を有意に加速し、わずか1週間以内に神経細胞の運命を誘導した11。その後のアストロサイトとの共培養における終末成熟は、再現性のある特性を有する高純度および量の機能的ニューロンをもたらした。次に、アデノ随伴ウイルス組み込みサイト1(AAVS1)セーフハーバー遺伝子座の部位特異的遺伝子編集を適用して、NGN212,13の安定したドキシサイクリン誘導性発現カセットを備えたhiPSC株を作成し、レンチウイルス送達の望ましくない副作用を最小限に抑えました。
ドキシサイクリン誘導性ニューロゲニン2(iNGN2)ニューロンの堅牢で効率的な分化は、ハイスループット表現型薬物スクリーニングおよび毒性アッセイに大きな可能性を秘めています10,14,15;そして、バイオプロセシングの実質的な進歩は、スケーラブルな細胞増殖および分化のためのバイオリアクターを実装する過去10年間になされた16,17,18,19。ただし、分化プロトコルの大部分は接着培養用に最適化されており、3次元(3D)環境への変換には本質的な変更が必要になることがよくあります。最近、せん断応力を低減したベンチトップ3Dバイオリアクターの使用の成功が、hiPS細胞の拡大および肝細胞、心筋細胞、およびニューロンへの再現性のある分化のために報告されています20。ここでは、同一のベンチトップ3Dバイオリアクターを使用して、iNGN2ニューロンの生成と特性評価のための詳細なプロトコルが提供されます。
Protocol
注:すべての細胞操作、ならびに培養皿および培地調製は、無菌条件下で実行する必要があります。層流フードは、使用前および処理後に、すべての表面を70%エタノールで拭いて完全に洗浄する必要があります。記載されたプロトコルは、CERO 3Dインキュベーターおよびバイオリアクター(以下ではベンチトップバイオリアクターと呼ぶ)におけるニューロン分化のために最適化されている。このベンチトップバイオリアクターは、それぞれ最大容量50mLの特殊なバイオリアクターチューブ用の4つのスロットを備えています。温度とCO2 レベルは連続的に制御され、培養パラメータ(例えば、回転速度と時間)は、各チューブごとに独立して調整されます。すべての吸引ステップは、特に明記されていない場合、吸引ピペットと真空ポンプを使用して実行されています。
1. ヒプソン細胞の培養と増殖
注:このプロトコルでは、操作されたドキシサイクリン誘導性NGN2 hiPSCラインBIONi010-C-13が使用されます。ここで提供される拡張プロトコルは、6 cmのペトリ皿用に最適化されていますが、必要に応じて代替培養フォーマットを使用できます。
- 6 cmのペトリ皿に、冷たいダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12(-/-)で最終濃度0.083 mg/mL/10 cm2で希釈した基底膜マトリックスをコーティングします。コーティングされた皿を37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。
注:基底膜マトリックス溶液を調製するための詳細なプロトコルは、製造元の説明書に記載されています。hiPS細胞は、増殖のために代替の細胞外マトリックス上で培養することができます。 - EBiSC細胞株ユーザープロトコル21 に従って、フィーダーフリーiPS細胞維持培地+10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)で凍結保存されたhiPS細胞を解凍します。60 mmディッシュあたり1×106 生細胞の播種密度が推奨されます。
- 翌日、ROCK阻害剤を含まないフィーダーフリーiPS細胞維持培地に培地交換を行い、毎日培地交換を行う。
- hiPSC培養が60%〜80%の合流点に達したら継代を開始する。分化した領域を確認し、面積が5%を超える場合は手動でコロニーを清掃します。
注:未分化のhiPS細胞は、核小体が目立ち、細胞質が少ない丸い細胞として現れます。平らで密集したコロニーは、解凍または継代後早期に形成される。hiPSC培養物の例示的な明視野画像を 図1に示す。さらなる情報は、EBiSC細胞株ユーザープロトコル21に提供される。継代のために、基底膜マトリックスコーティングディッシュとフィーダーフリーiPS細胞維持培地を準備します。 - hiPSC培養液から培地を吸引し、Ca2+ およびMg2+を含まない1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中の0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で細胞を2回すすぎます(DPS [-/-]、材料の表を参照)。
- 上清を取り除き、1x DPBS(-/-)中の0.5 mM EDTA2 mLを6 cmペトリ皿に加えます。細胞をインキュベーター内で37°Cで3分間インキュベートします。
- 1.5 mLのEDTA溶液を吸引し、3〜5分間インキュベーションを続けます。
- 皿を軽くたたいて細胞の剥離を促進します。
注意: 目視評価で取り外しを確認してください。hiPSCコロニーは5分後に剥離を開始するはずですが、コンフルエントなhiPSC培養では、より長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。コロニーが剥離しない場合は、インキュベーション時間を10分まで増やしますが、この時間枠を超えないようにしてください。 - 5 mLのフィーダーフリーiPSC維持培地を6 cmのペトリ皿に加え、10 mLの血清学的ピペットまたはワイドボアピペットチップを使用してコロニーを2回静かに再懸濁します。細胞を15 mLチューブに移します。
注:hiPS細胞は機械的ストレスに非常に敏感です。したがって、複数回の再中断は避けてください。最終的な細胞懸濁液は、小さなコロニー断片(50〜200μm)からなるべきである。 - コーティングした培養皿から上清を吸引し、6 cmディッシュあたり4 mLのフィーダーフリーiPS細胞維持培地を調製します。
- 小さなコロニー断片を1:10〜1:40の分割比で作りたての培養皿に移し、毎日培地を交換しながら37°C、5%CO2 で培養します。
注:小さなコロニーは、継代後1〜2時間以内に付着する必要があります。
図1:ヒト人工多能性幹細胞培養物の形態 。 (A,B)均質な形態と明確なエッジを持つ圧縮されたhiPSCコロニーを示す、異なるコンフルエンスの高品質のhiPSC培養。(c)コロニー縁部(白破線)の周囲に分化した細胞の新たなクラスターを有するhiPS細胞培養。スケールバー= 200μm。略称:hiPSC = ヒト人工多能性幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. ベンチトップバイオリアクターシステムにおけるhiPS細胞の事前培養(2日目)
注:hiPSC培養が60%から80%の間の合流点に達したら、前培養を開始します。分化した領域についてhiPSCコロニーを確認してください。この前培養段階では、hiPS細胞はフィーダーフリーのiPS細胞維持培地で2日間維持されます。
- フィーダーフリーのiPS細胞維持培地と10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)からなる培地を調製します。
- iPS細胞から培地を完全に吸引し、1x DPBS(-/-)で細胞を2回穏やかにすすぎます。
- 2.0 mLの予熱したトリプシン-EDTA溶液を6 cmのペトリ皿に加え、インキュベーター内で細胞を37°Cで3分間インキュベートします。
- 皿を軽くたたいて細胞の剥離を促進するか、1〜2分長くインキュベートします。
- 細胞をディッシュあたり5 mLのフィーダーフリーiPS細胞維持培地+ROCK阻害剤に再懸濁します。細胞懸濁液を15 mLまたは50 mLのチューブに移し、ピペッティングで穏やかに混合して細胞の特異化を確実にします。
- 100 μLの細胞懸濁液中の細胞数を、前述のように自動セルカウンターを用いて決定します20。バイオリアクターチューブあたり15×106 セルの対応する容量を50 mLチューブに移します。
- 細胞を300 × g で3分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、2 mLのフィーダーフリーiPS細胞維持培地+ROCK阻害剤に細胞を再懸濁します。
- 各50 mLチューブに18 mLの培地(細胞播種密度0.75 ×10 6 細胞/mL)を入れます。細胞懸濁液をバイオリアクターチューブに分注します(チューブあたり20 mL)。
- チューブをバイオリアクターシステムに配置します。次の栽培パラメータを設定します:2秒の回転周期、60rpmの回転速度、攪拌休止なし、37°C、および無制限の期間20の5%CO2。
- バイオリアクターディスプレイ から 培養プログラムを開始します。
- 翌日メディアを交換してください。凝集体をバイオリアクターチューブに~5分間落ち着かせます。上清を注意深く吸引します。
注:骨材が互いにくっついて不均一な骨材の懸濁液を構築する可能性があるため、10分以上落ち着かないでください。バイオリアクターチューブに~5 mLの培地を残すことをお勧めします。 - ROCK阻害剤を含まない新鮮なフィーダーフリーiPS細胞維持培地をチューブあたり15 mL添加し、ベンチトップバイオリアクターで24時間培養を続けます。
3. iPS細胞の早期神経細胞への分化(0日目)
- 神経基礎培地(NBM)の調製:安定化L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを含む50%DMEM/F-12、50%神経基礎培地、0.5x無血清サプリメント(50x)、ボッテンシュタインのN-1製剤に基づく0.5x無血清サプリメント(100x)、0.5x安定化L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、0.5x MEM非必須アミノ酸溶液(100x)、500 nMピルビン酸ナトリウム(100 mM)、50 nM 2-メルカプトエタノール(50 mM)、0.025%ヒトインスリン溶液、および5 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン。
注:NBMは4°Cで保存する必要があり、最大2週間使用できます。 - hiPS細胞培養物にドキシサイクリン(DOX)を添加して神経分化を開始します。このために、骨材をバイオリアクターチューブに落ち着かせます。細胞からの上清を注意深く吸引し、チューブに~5 mLを残し、NBMと2 μg/mL DOXからなる35 mLの神経誘導培地(NIM)を加えます。
注意: DOXは光に敏感であるため、作業中はライトをオフにすることをお勧めします。 - チューブをベンチトップバイオリアクターに戻し、培養を続けます。
- 手順 3.2 の説明に従って、メディアの変更を 2 日間毎日実行します。
注:浮遊培養で4日後、凝集体を解離させ、初期のニューロンを凍結保存するか、最終成熟のために直接再播種することができます。
4. 初期ニューロンの凍結保存(2日目)
注:凍結保存は必須ではなく、分化プロセスにとって重要ではありませんが、初期のニューロンの大量のストックを生成して、その後の成熟と分析のために保存できるため、強くお勧めします。
- 凝集体をバイオリアクターチューブに落ち着かせます。前述のように上清を吸引する。
- 骨材を滅菌済みの15 mLまたは50 mLチューブに移し、1x DPBS(-/-)で骨材を2回静かにすすぎます。凝集体を乱さずにできるだけ慎重に上清を吸引します。
- ペレットサイズに応じて、2〜5 mLの予温した細胞解離酵素を加え、細胞を水浴中37°Cで約10分間インキュベートします。凝集体が解離するまで、沈降した骨材を2分ごとに静かに再懸濁します。
注:ほぼ均質な細胞懸濁液は、7〜10分のインキュベーション後に取得する必要があります。 - 予温したNBM培地を3倍量加え、細胞を慎重に再懸濁して、細胞の特異化を確実にします。
- 細胞数を決定し、凍結保存用の対応する容量を15 mLまたは50 mLのチューブに移します。
注:5〜10×106 細胞/ mLの凍結培地の細胞密度が推奨されます。 - 細胞を300 × g で3分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む対応する容量の凍結培地に細胞ペレットを静かに再懸濁します。
- 凍結保存に適したバイアル(1 mL /バイアル)に細胞懸濁液を分注します。
- バイアルをすぐに2-プロパノールで満たされたプレチルドスローレート凍結容器に移し、容器を-80°Cで一晩置きます。バイアルを翌日-150°Cに置いて長期保存します。
注意: 液体2-プロパノールは非常に可燃性であり、接触すると目の損傷を引き起こす可能性があります。熱を避け、保護手袋と眼鏡を着用してください。
5. 単層培養におけるhiPS細胞由来神経細胞の成熟
- hiPS細胞由来ニューロンの長期培養のためのポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティング培養皿を準備します。
- ポリ-L-オルニチンストック溶液を1x DPBS(-/-)で0.001%に希釈し、4°Cで一晩、または37°Cで4時間ディッシュをコーティングします。 ポリ-L-オルニチン溶液を吸引し、プレートを1x DPBS(-/-)で1回洗浄します。
- ラミニン溶液を1x DPBS(-/-)で最終濃度10 μg/mLに希釈し、4°Cで一晩、または37°Cで4時間インキュベートします。
注意: コーティング手順には0.1〜0.15 mL/cm 2の容量が推奨され、すべての洗浄ステップではcm2あたり0.2 mLが推奨されます。代替のコーティング基材を使用することもできますが、細胞の付着と成熟に対する潜在的な影響を評価する必要があります。
- 凍結保存された細胞を解凍します。このために、クライオバイアルを水浴(37°Cに設定)に入れ、凍結細胞懸濁液の小さな塊が残るまで約1分間回転させます。
- 細胞懸濁液を、10 mLの予熱したNBMで調製した15 mLチューブに慎重に滴下します。クライオバイアルを1 mLのNBMですすぎ、細胞懸濁液を同じ15 mLチューブに移します。
- 細胞を300 × g で3分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を添加した1〜2 mLのNIMを追加します。
- 細胞ペレットを注意深く再懸濁し、細胞数を決定します。
- コーティングした細胞培養皿から残りのラミニン溶液を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を添加したNIMに1×105 細胞/cm2の播種密度で細胞を播種します。
- 24時間後に培地をROCK阻害剤なしのNIMに切り替えます。
- 4日間、毎日培地交換を行います。
- NGN2誘導のこの初期段階の後、DOXを省略し、NBMで細胞を培養し、成熟の所望の段階に達するまで週に2回ハーフ培地交換を行います。
注:iNGN2ニューロンとアストロサイトとの共培養は、細胞の生存、付着、成熟、および電気的活動を増加させるために推奨されます13,22。
6. ヒPS細胞由来ニューロンのキャラクタリゼーション
注:神経細胞誘導体への分化は、以下の手法によって評価することができる。
- 免疫細胞化学とイメージング
- hiPS細胞由来のニューロンから培地を吸引し、Ca2+ およびMg2+ (+/+)を含む1x DPBSで細胞を1回洗浄します。
注:細胞が表面から非常に簡単に剥がれる可能性があるため、慎重に、優先的にウェルエッジでピペットを貼ってください。1x DPBS (+/+) で細胞を完全にカバーするために、すべての洗浄ステップで 0.2 mL/cm2 の容量が推奨されます。 - DPBS中の4%パラホルムアルデヒド(+/+)を含む固定溶液を使用して、室温(RT)で15分間神経細胞を固定します。cm2 あたり0.1mLの容量が推奨されます。
注:DPBS中のパラホルムアルデヒド(4%)は、急性毒性と潜在的な発がん性を伴う危険で皮膚刺激性の溶液です。.熱を避け、保護手袋と眼鏡を着用し、吸入を避け、換気された環境でのみ溶液を使用してください。 - 細胞を1x DPBSで2回(+/+)穏やかにすすぎ、染色を続行します。
注:固定セルは、さらに処理されるまで、DPBS(+/+)で4°Cで最大1か月間保存できます。 - サンプルからDPBSを吸引(+/+)します。細胞を透過処理し、1%のBSAと0.2%のTriton-X-100を含む1x DPBS(+/+)でRTで60分間非特異的結合部位をブロックします。
注:cm2 あたり0.2mLの容量が推奨されます。 - 上清を除去し、染色バッファー(1%BSAを含む1x DPBS [+/+])で希釈した各一次抗体を用いて、細胞を4°Cで一晩インキュベートします( 材料の表を参照)。セルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。
注:cm2 あたり0.1〜0.15mLの容量が推奨されます。 - 染色バッファーを吸引し、細胞を1x DPBSで3回すすぎます(+/+)。
- 対応する二次抗体( 材料の表を参照)を染色バッファーで最終濃度1:1,000に希釈します。
- 細胞を希釈した抗体溶液中で、暗所のRTで1時間インキュベートします。セルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。
注:cm2 あたり0.1〜0.15mLの容量が推奨されます。 - 二次抗体溶液を吸引し、1x DPBSで細胞を2回すすぎます(+/+)。
- DPBSで希釈した4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でRTで5分間対比染色します。
注:cm2 あたり0.1〜0.15mLの作業容量をお勧めします。 - 細胞を1x DPBSで2回すすぎます(+/+)。
- イメージングするまで、細胞をDPBS(+/+)で4°Cで保存します。
注:明視野イメージングは、形態学的変化と神経突起の成長を追跡するのに適しています。さらに、常同型マーカー発現は、蛍光顕微鏡によって評価することができる。未分化なiPS細胞はOCT 3/4とNANOGを発現しますが、β-III-チューブリン(TUBB3)と微小管関連タンパク質2(MAP2)は、神経突起と軸索を視覚化するための神経細胞マーカーとして機能する可能性があります。神経突起ネットワークは、明視野または蛍光画像において神経突起の長さを決定することによってさらに評価することができる。
- hiPS細胞由来のニューロンから培地を吸引し、Ca2+ およびMg2+ (+/+)を含む1x DPBSで細胞を1回洗浄します。
- 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)による遺伝子発現解析
- 培地を吸引し、1x DPBS(-/-)で細胞を1回すすぎます。
注:cm2 あたり0.2mLの容量が推奨されます。 - コールドRNA溶解バッファーを添加し、スクラッチによって細胞を回収します。
- 適切なカラムベースのキットを使用してRNAを単離し、UV光分光法によりRNA濃度を測定します。
- 250 ngの総RNAと逆転写に適したキットを使用してcDNAを生成します。
- 2.5 ngのcDNAを二重に含む分子ビーコンqPCR反応を準備します。適切なマスターミックスおよび対応するプライマーアッセイ20 を使用する( 材料の表を参照されたい)。
- プライマーアニーリングを60°Cで20秒間45サイクル適用して、qPCRを実行します。
- 相対遺伝子発現レベルをハウスキーピング遺伝子GAPDH、HPRT1、およびGUSBの平均に正規化します。ΔΔCt法23を適用し、未分化ヒジプロニクスをキャリブレータとして使用します。
- 培地を吸引し、1x DPBS(-/-)で細胞を1回すすぎます。
Representative Results
最初のステップでは、hiPS細胞の接着培養物を剥離し、単離化して懸濁液に移します(図2)。凝集体は24時間以内に形成され、サイズが連続的に大きくなります。導入遺伝子誘導の2日後、初期のニューロンは、その後の実験のために凍結保存することができる。
浮遊状態での最初の数日間の持続的な増殖は、細胞数の増加をもたらし、誘導の2日後にピークに達します(図3A、B)。増殖とともに、凝集体が成長し始めます。0日目と比較して、直径は2日目に50%の増加を示し、5日目にはほぼ2倍になります(図3D)。直径が大きくなると凝集体内の栄養素供給が制限されますが、細胞の生存率は分化の2日目または5日目には影響を受けません(図3C)。しかし、懸濁液状態で4日以上長期間培養しても、凝集体は酵素的単離化に対してますます耐性になるため、細胞収量はさらに向上しません(図3B)。
凍結保存後、2日目の細胞を解凍し、ポリ-L-オルニチン(PLO)ラミニンコーティングディッシュにプレーティングして最終成熟させます。一般に、細胞は融解後に非常によく付着し、早い段階で神経突起を伸ばし始めます。時間的遺伝子発現プロファイル、ならびにニューロンマーカーTUBB3およびMAP2の免疫細胞化学的染色により、ニューロン細胞の同一性が確認される(図4A、B)。TUBB3およびMAP2のレベルの上昇に加えて、ニューロン培養物は、軸索安定化に関与するニューロンタンパク質をコードする微小管関連タンパク質タウ転写物(MAPT)に富み、同時に多能性調節転写因子POU5F1の発現の低下を示します。さらに、融解後最初の1週間以内に密な神経突起ネットワークが形成されます(図4C)。これらの形態学的変化は、転写プロファイルと関連して、ニューロン培養の成熟の増加を示唆している。
図2:ベンチトップバイオリアクターを用いたhiPS細胞由来iNGN2ニューロンの生成。 (A)分化パラダイムの概略概要、細胞培養の重要なステップを強調します。(B-F)明視野画像は、(B)hiPS細胞と(C、D)ベンチトップバイオリアクター内の凝集体の形成を視覚化します。(E,F)iNGN2ニューロンは神経突起を伸長させ、分化中に形態学的変化を受ける。スケールバー= 100μm。略語:BMM =基底膜マトリックス;iPSC-MM = iPSC維持培地;PLO = ポリ-L-オルニチン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:凝集体の形成および増殖中の細胞収量および生存率。 (A)明視野画像は、ベンチトップバイオリアクターでの培養後2日以内に凝集体が形成され、時間の経過とともに凝集体サイズが増加したことを示しています。スケールバー= 500μm。 (B)細胞収量の定量化および(C)分化過程にわたる生存率。棒グラフは、4つの独立した実験からの平均+ SDを表します。(D)骨材のサイズを示す直径は、オープンソースソフトウェアImageJ(バージョン1.53)を使用して半自動的に決定されました。まず、明視野画像をバイナリ画像に変換し、粒子分析ツールを使用して、サイズ>2,500 μm2、真円度0.45-1、エッジの除外、穴の包含などのパラメーターを適用してさらに評価しました。横線は、5つの独立した微分の平均±SDを示す。単一のドットは、時点ごとに少なくとも20個の集計を持つ個々の分化実験の平均を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hiPS細胞由来のiNGN2ニューロンの特性評価。 神経細胞遺伝子 TUBB3、MAP2、 および MAPTならびに多能性幹細胞関連遺伝子 POU5F1の時間的遺伝子発現プロファイル。相対発現レベルは、参照遺伝子 GAPDH、HPRT1、 および GUSBに対して標準化した。未分化型hiPSC(day-2)をキャリブレーターとして選択した。幾何学的記号は、4つの独立した微分の平均±SDを示します。(B)融解後7日目(2日目+7日目)のiNGN2ニューロンの代表的な画像で、β-III-チューブリン(TUBB3、マゼンタ)および微小管関連タンパク質2(MAP2、シアン)について染色した。細胞核をDAPIで対比染色した。スケールバー = 100 μm。 (C)融解後の神経細胞培養の明視野画像における神経炎ネットワークの評価。神経突起の全長は、ImageJ(バージョン1.53)を使用して930.82×698.11μm2 の領域で決定されました。明るさとコントラストを調整した後、画像を8ビット画像に変換し、色を反転させました。その後、神経突起はスケルトン化され、ImageJプラグイン「スケルトン化」と「スケルトン分析」を使用して分析されました。神経突起の全長を関心領域の体細胞の数で割って、平均神経突起長/細胞を得た。棒グラフは、3つの独立した実験の平均+ SDを表します。略語:DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
神経細胞転写因子NGN2の異所性発現は、培養後1週間以内に神経分化の初期段階を加速し、hiPS細胞における神経系統の関与を誘導することが以前に示されています12,13,20。この研究では、ベンチトップバイオリアクターを使用して、遺伝子編集されたBIONi010-C-13 hiPS細胞をiNGN2ニューロンに分化させるための詳細なプロトコルについて説明しています。
CERO 3Dバイオリアクターは、特殊チューブ用の4つのスロットを備えた少量バイオリアクターで、それぞれ最大容量は50mLです。温度とCO2レベルは連続的に制御され、培養パラメータ(回転速度や時間など)はチューブごとに調整されるため、ユーザーは独立して複数の差別化アプローチを並行して実行できます。内管壁に統合されたウェーブブレーカーは、低いせん断応力で媒体の摂動を可能にし、制御された回転中に懸濁液中の3D凝集体を維持します。栄養素へのアクセスが制限されていること、および強制的な3D細胞間および細胞-細胞外マトリックス(ECM)相互作用は、細胞の分化と行動に大きな影響を与える可能性があります24,25,26,27。
浮遊状態で3D凝集体として細胞を培養すると、これらの細胞相互作用が増加し、それによって組織または器官の生体内環境をより密接に模倣する28。媒体の付随する摂動は、機械的摩擦による凝集体のサイズを調節し、ガス交換を改善し、チューブ内の栄養素と老廃物の勾配を減少させ、骨材内の生理学的に関連する勾配を維持します29,30,31,32,33,34.培地の交換は手動で行われますが、ベンチトップバイオリアクターは静的培養フラスコと比較して労力と運用コストを削減します。また、インペラフリー設計により凝集体表面での流体力学的せん断応力を低減し、細胞の生存率を向上させるだけでなく、敏感なiPS細胞、細胞分化、および機能に対するせん断応力の影響を制限するため、全自動攪拌槽バイオリアクターに比べていくつかの利点があります35,36,37,38。
大型の垂直インペラで細胞を撹拌する垂直ホイールバイオリアクターや、電動プラットフォームに取り付けられた膨張培養バッグを使用した揺動バイオリアクターは、代替の3Dサスペンションプラットフォームです。hiPS細胞17,18,19,39,40の培養については過剰に試験されているが、神経分化アプローチへの適用性についてはほとんど知られておらず、攪拌槽バイオリアクター41,42,43,44における哺乳類およびヒトの神経前駆細胞の増殖の成功に限られており、成熟44,45。一般に、自動3Dサスペンションプラットフォームは、完全に自動化されたコンピューター制御の媒体交換の利点を提供し、それによって取り扱いのばらつきを減らし、汚染のリスクを最小限に抑えます。さらに、乳酸やグルコース濃度などの栄養素パラメータを継続的に監視できます。ただし、これらのシステムを確立するには、多くの場合、多額の初期投資、実験室スペース、および有資格者のトレーニングが必要です。ベンチトップバイオリアクターは、浮遊状態で細胞を培養するためのコンパクトで使いやすい代替品ですが、栄養素の同時モニタリングは提供していません。
3D懸濁プラットフォームでの細胞の培養に使用されるプロトコルの大部分と同様に、凝集体の初期形成は重要なステップを表します。hiPS細胞は接着性単層として培養され、その後、シングルセル懸濁液として3D環境に移されます。その段階での細胞損失を最小限に抑えるには、いくつかの側面を考慮する必要があります。ウェーブブレーカーを内蔵したチューブの設計は、最適な培地摂動を確保するために、チューブあたり10mLの最小培養量が必要であることを意味します。したがって、クリティカルボリュームは長期的にアンダーカットされるべきではありません。さらに、培養量10 mLあたり750万細胞の開始播種密度、および60 rpmの回転速度は、細胞株によっては適応が必要な場合がありますが、短期間で安定した凝集体を形成することを強くお勧めします。
hiPS細胞を懸濁液に移した後、24時間以内に凝集体が形成されるはずです。最初の中程度の変更は、アグリゲートが小さく、適切に落ち着かない可能性があるため、重要です。骨材の沈降時間は延長できますが、骨材が不均一に凝集して成長し始める可能性があるため、10分を超えてはなりません。吸引中は、5 mLの最小培養量をチューブに残し、培地の摂動を避ける必要があります。それにもかかわらず、細胞および凝集体の損失は初期段階で予想される。細胞数は、培養の最初の2日間にわたって一定の細胞収量を示し、hiPS細胞の高い増殖能力が最初の細胞損失を補うことを示しています。懸濁状態になると、穏やかな栽培と摂動により、時間の経過とともに成長し始める均質なサイズの凝集体が得られます。
神経分化は、ドキシサイクリン誘導性NGN2過剰発現13に基づく以前に発表されたプロトコルに従って実施され、個々のステップは3D培養用に最適化されました。ニューロン転写因子NGN2は、ニューロン分化におけるよく説明されたドライバーであり、ニューロン誘導を有意に加速します11、13、46。定義された成長因子を用いた従来のパターニングには数週間から数ヶ月かかりますが7、8、9、NGN2の発現は数日以内に神経細胞の運命を誘導します。培養時間の短縮に加えて、このプロトコルは、最初の浮遊培養のために高価な成長因子やコーティングマトリックスに依存しないため、培養コストをさらに削減できます。
さらに、付着培養と浮遊培養におけるNGN2による未熟ニューロンの生成を直接比較したところ、ベンチトップバイオリアクター20を用いた培養で4日後に細胞が1.36倍増加し、100万個の細胞の生成に必要な培地の量は半分になると予想されています。したがって、iNGN2ニューロンの生成にベンチトップバイオリアクターを採用することは、より少ない処理時間とコストでより多くの細胞を生産できるため、有益である可能性があります。以前の報告に沿って、ニューロン系統のコミットメントは早い段階で観察されました。NGN2誘導の2日後、TUBB3、MAP2、MAPTなどの古典的なニューロンマーカーの深い発現が明らかであり、ニューロン誘導へのベンチトップバイオリアクターの適用性を支持しました。このプロトコルに従うと、培養後4日以内に100万個のhiPS細胞から約620万個の未熟なiNGN2ニューロンを得ることができます。ただし、出力容量はバッチによって異なり、播種時の浮遊培養の量によって異なります。
収量をさらに増やすために、栽培時間はさらに3日間延長されました。しかし、凝集体は大きくなったものの、非常にコンパクトになり、凍結保存や再めっきのために適切に解離することができませんでした。3D培養アプローチの進歩にもかかわらず、接着性2Dニューロン培養は、微小電極アレイやカルシウムイメージングなどの機能分析のゴールドスタンダードです。したがって、細胞の特異化は、均質に分布したニューロン単層および神経炎ネットワークにとって重要な前提条件です。細胞のより強力な機械的剥離または粗い解離試薬は、特異化を確実にするために使用され得るが、細胞の生存率、生理機能、および再付着能力に潜在的な影響を与える可能性がある47,48。さらなる分析および成熟のための単一細胞の必要性に関して、凝集体は懸濁状態で4日後に解離し、(2日目)iNGN2ニューロンを凍結保存された。融解後のiNGN2ニューロンの分化と特性評価により、ニューロン培養の成熟度が高まり、密な神経突起ネットワークが形成されることが確認されました。
提供されたプロトコルは、多数のiNGN2ニューロンを生成します。ただし、いくつかの制限を考慮する必要があります。ほとんどの浮遊培養プラットフォームと同様に、2D接着培養から3D環境へのhiPS細胞の移行は非常に重要であり、多くの場合、深刻な細胞損失を伴います。培地交換中にさらに大きな細胞および凝集体の損失が予想されます。自動化されたプラットフォームと比較して、培地の交換を手動で行う必要があるため、ベンチトップバイオリアクターを使用した取り扱い時間と汚染リスクが高まります。自動化の欠如は別として、ベンチトップバイオリアクターは栄養素を監視する可能性を提供しておらず、チューブあたり50mLの最大容量はプロトコルのアップスケーリングの可能性を制限します。最後に、NGN2は神経系譜のコミットメントを加速しますが、終末成熟の期間は短縮されず、数週間にわたる長期培養が必要であることに注意することが重要です。神経機能、付着、および生存に対する星状細胞サポートの重要性を考えると49,50,51、共培養アプローチを検討する必要があり、長期培養に不可欠でさえあるかもしれません。
要約すると、2D分化プロトコルは、ベンチトップバイオリアクターを実装することにより、iNGN2ニューロンの迅速かつ再現性のある生成のための3D環境への変換に成功しました。記載されたプロトコルは、高品質のiPS細胞由来のニューロンを大量に生成し、複雑なモデル試験、ハイスループット薬物スクリーニング、および大規模な毒性アッセイの出発点として役立つ可能性があります。
Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
EBiSC2プロジェクトは、助成金契約No.821362に基づき、革新的医薬品イニシアチブ2共同事業(JU)から資金提供を受けています。JUは、欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムとEFPIAの支援を受けています。Nadine J. Smandzich、Helene D. M. Hemmer、Johnn-Majd Balsters、Vanessa M. Nalewajaの免疫細胞化学的および遺伝子発現解析への支援、およびHeike Arthenの優れた技術サポートに感謝します。さらに、バイオリアクタープログラムの確立についてステファニーバーに感謝します。 図2A は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
| 60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
| Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
| BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
| Biorender | Biorender.com | ||
| BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
| CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
| CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
| Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
| CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
| Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
| DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
| Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
| DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
| ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
| MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
| Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
| mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
| Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
| Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
| NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
| Origin 2021 | OriginLab | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
| Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
| RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
| Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
| StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
| TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
| Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
| X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
| Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |
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