Summary
Este artigo descreve um protocolo para a geração de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em um biorreator de suspensão 3D de bancada.
Abstract
A derivação de células de linhagem neuronal a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) marcou um marco na pesquisa cerebral. Desde seu primeiro advento, os protocolos têm sido continuamente otimizados e agora são amplamente utilizados em pesquisa e desenvolvimento de medicamentos. No entanto, a longa duração desses protocolos convencionais de diferenciação e maturação e a crescente demanda por hiPSCs de alta qualidade e seus derivados neurais levantam a necessidade de adoção, otimização e padronização desses protocolos para produção em larga escala. Este trabalho apresenta um protocolo rápido e eficiente para a diferenciação de hiPSCs geneticamente modificadas, induzíveis por doxiciclina 2 (iNGN2), expressando hiPSCs em neurônios usando um biorreator de suspensão tridimensional (3D) de bancada.
Em resumo, suspensões unicelulares de iNGN2-hiPSCs foram autorizadas a formar agregados dentro de 24 h, e o comprometimento da linhagem neuronal foi induzido pela adição de doxiciclina. Os agregados foram dissociados após 2 dias da indução e as células foram criopreservadas ou replaqueadas para maturação terminal. Os neurônios iNGN2 gerados expressaram marcadores neuronais clássicos precocemente e formaram redes neuríticas complexas dentro de 1 semana após o replaqueamento, indicando uma maturidade crescente das culturas neuronais. Em resumo, um protocolo passo-a-passo detalhado para a geração rápida de neurônios derivados de hiPSC em um ambiente 3D é fornecido com grande potencial como ponto de partida para modelagem de doenças, rastreios fenotípicos de drogas de alto rendimento e testes de toxicidade em larga escala.
Introduction
As doenças neurológicas são a principal causa de incapacidade no mundo1. Uma em cada seis pessoas é afetada e a incidência continua a aumentar. O encargo financeiro associado às sociedades e aos seus sistemas de saúde é enorme. Uma avaliação de 30 países europeus em 2010 estimou custos anuais de 800 mil milhões de euros relacionados com perturbações mentais e neurológicas2. A crescente carga socioeconômica exige estratégias de tratamento eficazes e, embora nossa compreensão da fisiopatologia da doença tenha aumentado substancialmente, a tradução para a clínica muitas vezes é insuficiente. Em geral, apenas 12% dos fármacos entram em ensaios clínicos, dos quais mais de 80% falham em estágios posteriores, principalmente devido à ineficácia ou toxicidade inesperada 3,4. As razões são variadas, mas a transferibilidade limitada dos testes em animais em estágios pré-clínicos para os testes em humanos tem vindo cada vez mais à tona5. Modelos humanos in vitro de células e tecidos podem preencher a lacuna da tradução interespécies, e os avanços na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) possuem grande potencial nesse sentido. As hiPSCs são amplamente utilizadas em pesquisa básica e compartilham características essenciais com as células-tronco embrionárias (hESCs), como uma capacidade de auto-renovação quase ilimitada e a capacidade de se diferenciar em todas as três camadas germinativas6, ao mesmo tempo em que contornam as preocupações éticas associadas à destruição embrionária.
A derivação de células neuronais de hESCs, e mais tarde hiPSCs, marcou um marco na pesquisa cerebral. Os protocolos iniciais de diferenciação foram baseados na aplicação de fatores de crescimento mimetizando etapas críticas durante a embriogênese, a maioria envolvendo dupla inibição da SMAD em culturas em suspensão ou aderentes 7,8,9. Neurônios maduros têm sido gerados com sucesso, mas várias desvantagens desses protocolos ainda dificultam seu amplo uso no desenvolvimento de fármacos, como o baixo rendimento e a alta variabilidade lote a lote dos neurônios gerados, bem como a extensa carga de trabalho relacionada a longos tempos de cultivo. Melhorias têm sido alcançadas pela expressão forçada de fatores de transcrição criticamente envolvidos na neurogênese, e membros da família de neurogeninas (NGN), em particular NGN2, têm sido identificados como direcionadoresefetivos 10. A expressão ectópica de NGN2 mediada por lentivirais em hiPSCs acelerou significativamente os estágios iniciais da diferenciação neuronal e induziu o destino das células neuronais em apenas 1 semana11. A maturação terminal subsequente em co-culturas com astrócitos produziu neurônios funcionais em alta pureza e quantidade com propriedades reprodutíveis. A edição genética sítio-dirigida do locus safe-harbor adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1) foi então aplicada para criar linhas hiPSC com um de expressão estável e induzível por doxiciclina para NGN212,13, minimizando assim os efeitos colaterais indesejados da liberação lentiviral.
A diferenciação robusta e eficiente de neurônios neurogenin 2 induzíveis por doxiciclina (iNGN2) tem grande potencial para triagem fenotípica de drogas de alto rendimento e ensaios de toxicidade10,14,15; e progressos substanciais no bioprocessamento foram feitos durante a última década implementando biorreatores para uma expansão e diferenciação celular escalável16,17,18,19. No entanto, a maioria dos protocolos de diferenciação é otimizada para culturas aderentes, e a tradução para um ambiente tridimensional (3D) muitas vezes requer modificações essenciais. Recentemente, o uso bem-sucedido de um biorreator 3D de bancada com características de tensão de cisalhamento reduzida tem sido relatado para a expansão de hiPSCs e para a diferenciação reprodutível em hepatócitos, cardiomiócitos eneurônios20. Aqui, um protocolo detalhado para a geração e caracterização de neurônios iNGN2 é fornecido usando o biorreator 3D de bancada idêntico.
Protocol
NOTA: Todas as manipulações celulares, bem como preparações de cultura e meios, devem ser realizadas em condições estéreis. A capela de fluxo laminar deve ser cuidadosamente limpa antes do uso e após o processamento, limpando todas as superfícies com etanol 70%. O protocolo descrito é otimizado para diferenciações neuronais em uma Incubadora e Biorreator CERO 3D (a seguir referido como biorreator de bancada). Este biorreator de bancada oferece quatro slots para tubos de biorreatores especializados, cada um com capacidade máxima de 50 mL. A temperatura e os níveis de CO2 são continuamente controlados, e os parâmetros de cultivo (por exemplo, velocidade e tempo de rotação) são regulados para cada tubo independentemente. Todas as etapas de aspiração foram realizadas usando uma pipeta de aspiração e bomba de vácuo, se não indicado o contrário.
1. Cultura e expansão de hiPSCs
NOTA: A linha hiPSC induzível por doxiciclina NGN2 BIONi010-C-13 é usada neste protocolo. O protocolo de expansão fornecido aqui é otimizado para placas de Petri de 6 cm, mas formatos alternativos de cultura podem ser usados se preferirem.
- Revestir placas de Petri de 6 cm com matriz de membrana basal diluída em meio Eagle's modificado (DMEM)/F12 (-/-) a frio na concentração final de 0,083 mg/mL/10cm2. Incubar os pratos revestidos a 37 °C durante, pelo menos, 30 min.
NOTA: Um protocolo detalhado para a preparação da solução de matriz de membrana basal pode ser encontrado nas instruções do fabricante. hiPSCs podem ser cultivadas em matrizes extracelulares alternativas para expansão. - Descongelar hiPSCs criopreservados de acordo com o protocolo de usuário da linhagem celular EBiSC21 em meio de manutenção iPSC livre de alimentador + inibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632). Recomenda-se uma densidade de semeadura de 1 × 106 células viáveis por prato de 60 mm.
- Troque o meio no dia seguinte para o meio de manutenção iPSC sem alimentador sem inibidor de ROCK e realize trocas diárias de mídia.
- Iniciar a passagem quando as culturas hiPSC atingirem uma confluência de 60%-80%. Verifique se há áreas diferenciadas e limpe as colônias manualmente se a área exceder 5%.
NOTA: HiPSCs indiferenciadas aparecem como células redondas com um nucléolo proeminente e menos citoplasma. Colônias planas e bem compactadas são formadas precocemente após o descongelamento ou passagem. Imagens exemplares de campo claro de culturas hiPSC são mostradas na Figura 1. Mais informações são fornecidas no Protocolo de Usuário da Linha Celular EBiSC21. Para a passagem, prepare pratos revestidos com matriz de membrana basal e meio de manutenção iPSC sem alimentador. - Aspirar o meio das culturas hiPSC e enxaguar as células 2x com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mM em 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco sem Ca 2+ e Mg2+ (DPS [-/-], ver Tabela de Materiais).
- Retire o sobrenadante e adicione 2 mL de EDTA 0,5 mM em 1x DPBS (-/-) às placas de Petri de 6 cm. Incubar as células a 37 °C durante 3 min na incubadora.
- Aspirar 1,5 mL da solução de EDTA e continuar a incubação por 3-5 min.
- Bata suavemente na louça para facilitar o descolamento celular.
OBS: Verifique o distanciamento por avaliação visual. As colônias de hiPSC devem começar a se destacar após 5 min, mas um tempo de incubação maior pode ser necessário com culturas de hiPSC confluentes mais altas. Se as colônias não se destacarem, aumente o tempo de incubação até 10 min, mas não exceda esse período de tempo. - Adicionar 5 mL de meio de manutenção iPSC sem alimentador às placas de Petri de 6 cm e ressuspender suavemente as colônias 2x com uma pipeta sorológica de 10 mL ou usando pontas de pipeta de furo largo. Transfira as células para um tubo de 15 mL.
NOTA: hiPSCs são altamente sensíveis a esforços mecânicos; assim, múltiplas ressuspensões devem ser evitadas. A suspensão celular final deve consistir de pequenos fragmentos de colônia (50-200 μm). - Aspirar o sobrenadante das placas de cultura revestidas e preparar 4 mL de meio de manutenção iPSC sem alimentador por prato de 6 cm.
- Transferir pequenos fragmentos de colônia para os pratos de cultura recém-preparados em proporções fracionadas de 1:10 a 1:40, e cultivar a 37 °C e 5% CO2 com trocas diárias de meios.
NOTA: Pequenas colônias devem se anexar dentro de 1 ou 2 h após a passagem.
Figura 1: Morfologia das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos . (A,B) Culturas hiPSC de boa qualidade de diferentes confluências mostrando colônias hiPSC compactadas com morfologia homogênea e bordas definidas. (C) cultura hiPSC com aglomerados emergentes de células diferenciadas ao redor das bordas da colônia (linha branca tracejada). Barra de escala = 200 μm. Abreviação: hiPSC = célula tronco pluripotente induzida humana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Pré-cultivo de hiPSCs no sistema de biorreator de bancada (dia-2)
NOTA: Iniciar o pré-cultivo quando as culturas hiPSC atingirem uma confluência entre 60% e 80%. Verifique as colônias hiPSC para áreas diferenciadas. Durante esta fase de pré-cultivo, as hiPSCs são mantidas em meio de manutenção iPSC livre de alimentador por 2 dias.
- Preparar o meio de cultura, composto por meio de manutenção iPSC livre de alimentador e inibidor de ROCK 10 μM (Y-27632).
- Aspirar completamente o meio a partir das hiPSCs e enxaguar suavemente as células com 1x DPBS (-/-) duas vezes.
- Adicionar 2,0 mL de solução pré-aquecida de tripsina-EDTA às placas de Petri de 6 cm e incubar as células por 3 min a 37 °C na incubadora.
- Bata suavemente nos pratos para facilitar o descolamento celular, ou incube por 1-2 minutos a mais.
- Ressuspender as células em 5 mL de meio de manutenção iPSC livre de alimentador + inibidor de ROCK por placa. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL ou 50 mL e misture suavemente por pipetagem para garantir a singularização celular.
- Determinar o número de células em 100 μL de suspensão celular usando um contador de células automatizado, conforme descrito anteriormente20. Transfira o volume correspondente de 15 × 106 células por tubo de biorreator para um tubo de 50 mL.
- Centrifugar as células a 300 × g durante 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meio de manutenção iPSC livre de alimentador + inibidor de ROCK.
- Encher cada tubo de 50 mL com 18 mL de meio (densidade de semeadura celular de 0,75 × 106 células/mL). Dispensar a suspensão celular nos tubos do biorreator (20 mL por tubo).
- Coloque os tubos no sistema do biorreator. Defina os seguintes parâmetros de cultivo: período de rotação de 2 s, velocidade de rotação de 60 rpm, sem pausa de agitação, 37 °C e 5% de CO2 por uma duração ilimitada20.
- Inicie o programa de cultivo através do visor do biorreator.
- Mude a mídia no dia seguinte. Deixe os agregados se acomodarem nos tubos do biorreator por ~5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
NOTA: Não deixe os agregados se acomodarem por mais de 10 min, pois eles podem grudar uns nos outros e construir uma suspensão de agregados heterogêneos. Recomenda-se deixar ~5 mL de meio de cultura no tubo do biorreator. - Adicionar 15 mL de meio de manutenção iPSC fresco sem inibidor de ROCK por tubo e continuar o cultivo no biorreator de bancada por 24 h.
3. Diferenciação de hiPSCs em neurônios precoces (dia 0)
- Preparar meio neurobasal (NBM): 50% DMEM/F-12 com dipeptídeo L-alanil-L-glutamina estabilizado, meio neurobasal 50%, 0,5x suplemento sem soro (50x), 0,5x suplemento sem soro baseado na formulação N-1 de Bottenstein (100x), 0,5x dipeptídeo L-alanil-L-glutamina estabilizado, 0,5x solução de aminoácidos não essenciais MEM (100x), piruvato de sódio 500 nM (100 mM), 2-mercaptoetanol 50 nM (50 mM), solução de insulina humana a 0,025% e penicilina-estreptomicina 5 U/mL.
NOTA: O NBM deve ser armazenado a 4 °C e pode ser usado por até 2 semanas. - Iniciar a diferenciação neuronal adicionando doxiciclina (DOX) às culturas hiPSC. Para isso, deixe os agregados se acomodarem nos tubos do biorreator. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante das células, deixando ~5 mL no tubo, e adicionar 35 mL de meio de indução neural (NIM) composto por NBM e 2 μg/mL DOX.
NOTA: Como o DOX é sensível à luz, recomenda-se apagar a luz durante o trabalho. - Coloque os tubos de volta no biorreator de bancada e continue o cultivo.
- Execute alterações de mídia todos os dias por 2 dias, conforme descrito na etapa 3.2.
NOTA: Após 4 dias em cultura em suspensão, os agregados podem ser dissociados, sendo os neurônios precoces criopreservados ou diretamente replaqueados para maturação terminal.
4. Criopreservação de neurônios precoces (dia 2)
NOTA: A criopreservação não é necessária e não é crítica para o processo de diferenciação, mas altamente recomendada, pois grandes estoques de neurônios precoces podem ser produzidos e armazenados para posterior maturação e análises.
- Deixe os agregados se acomodarem no tubo do biorreator. Aspirar o sobrenadante conforme descrito anteriormente.
- Transfira os agregados para um tubo estéril de 15 mL ou 50 mL e lave suavemente os agregados 2x com 1x DPBS (-/-). Aspirar cuidadosamente o sobrenadante tanto quanto possível sem perturbar os agregados.
- Adicionar 2-5 mL de enzima de dissociação celular pré-aquecida, dependendo do tamanho do pellet, e incubar as células por aproximadamente 10 min a 37 °C em banho-maria. Ressuspender suavemente os agregados sedimentados a cada 2 min até que os agregados se dissociam.
NOTA: Uma suspensão celular quase homogênea deve ser obtida após 7-10 min de incubação. - Adicione o volume triplo do meio NBM pré-aquecido e ressuspenda as células cuidadosamente para garantir a singularização celular.
- Determinar o número de células e transferir o volume correspondente para criopreservação para um tubo de 15 mL ou 50 mL.
NOTA: Recomenda-se uma densidade celular de 5-10 × 106 células/mL de meio de congelamento. - Centrifugar as células a 300 × g durante 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet celular no volume correspondente de meio de congelação contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Alíquota a suspensão celular em frascos para injetáveis adequados para criopreservação (1 ml/frasco para injetáveis).
- Transfira os frascos para injetáveis imediatamente para um recipiente pré-refrigerado de congelação de velocidade lenta cheio de 2-propanol e coloque o recipiente a -80 °C durante a noite. Colocar os frascos para injetáveis a -150 °C no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.
NOTA: O 2-Propanol líquido é altamente inflamável e pode causar danos oculares ao contato. Manter longe do calor e usar luvas de proteção, bem como óculos.
5. Maturação de neurônios derivados da hiPSC em culturas de monocamadas
- Preparar pratos de cultura revestidos de poli-L-ornitina/laminina para o cultivo a longo prazo de neurônios derivados de hiPSC.
- Diluir a solução-mãe de poli-L-ornitina a 0,001% em 1x DPBS (-/-) e revestir os pratos durante a noite a 4 °C ou durante 4 h a 37 °C. Aspirar a solução de poli-L-ornitina e lavar as placas uma vez com 1x DPBS (-/-).
- Diluir a solução de laminina em 1x DPBS (-/-) até uma concentração final de 10 μg/mL e incubar as placas durante a noite a 4 °C, ou por 4 h a 37 °C.
NOTA: Um volume de 0,1-0,15 mL por cm 2 é recomendado para os procedimentos de revestimento, e 0,2 mL por cm2 para todas as respectivas etapas de lavagem. Substratos alternativos de revestimento podem ser usados, mas potenciais efeitos sobre a fixação e maturação celular devem ser avaliados.
- Descongelar as células criopreservadas. Para isso, coloque o criovial em banho-maria (regulado para 37 °C) e gire-o por aproximadamente 1 min, até que um pequeno aglomerado de suspensão de células congeladas seja deixado.
- Transfira cuidadosamente a suspensão celular gota a gota para um tubo de 15 mL preparado com 10 mL de NBM pré-aquecido. Enxaguar o criovial com 1 mL de NBM e transferir a suspensão celular para o tubo idêntico de 15 mL.
- Centrifugar as células a 300 × g durante 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 1-2 mL de NIM suplementado com 10 μM inibidor de ROCK.
- Ressuspenda a pastilha de célula cuidadosamente e determine os números de células.
- Aspirar a solução de laminina remanescente das placas de cultura celular revestidas e semear as células a uma densidade de semeadura de 1 × 105 células/cm2 em NIM suplementado com inibidor de ROCK 10 μM.
- Troque o meio após 24 h para NIM sem inibidor de ROCK.
- Realizar trocas médias diárias por 4 dias.
- Após essa fase inicial de indução com NGN2, omitir o DOX e cultivar as células em NBM, com trocas de meio-meio 2x por semana até atingir o estágio desejado de maturação.
NOTA: A co-cultura de neurônios iNGN2 com astrócitos é recomendada para aumentar a sobrevivência, apego, maturidade e atividade elétricadas células 13,22.
6. Caracterização de neurônios derivados da hiPSC
NOTA: A diferenciação em derivados neuronais pode ser avaliada pelas seguintes técnicas.
- Imunocitoquímica e imagem
- Aspirar o meio dos neurônios derivados da hiPSC e lavar as células uma vez com 1x DPBS com Ca 2+ e Mg2+ (+/+).
NOTA: Pipetar cuidadosamente, preferencialmente nas bordas do poço, pois as células podem se desprender muito facilmente da superfície. Um volume de 0,2 mL por cm2 é recomendado para todas as etapas de lavagem para garantir uma cobertura completa das células com 1x DPBS (+/+). - Fixar as células neuronais utilizando uma solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% em DPBS (+/+) durante 15 min à temperatura ambiente (TR). Recomenda-se um volume de 0,1 mL por cm2 .
NOTA: Paraformaldeído (4%) em DPBS é uma solução perigosa e irritante para a pele com toxicidade aguda e potencial carcinogenicidade. Manter longe do calor, usar luvas e óculos de proteção, evitar a inalação e usar a solução apenas em um ambiente ventilado. - Enxaguar suavemente as células 2x em 1x DPBS (+/+) e prosseguir com a coloração.
NOTA: As células fixas podem ser armazenadas em DPBS (+/+) a 4 °C por até 1 mês até processamento posterior. - Aspirar o DPBS (+/+) das amostras. Permeabilizar as células e bloquear sítios de ligação inespecíficos com 1x DPBS (+/+) contendo 1% de BSA e 0,2% de Triton-X-100 por 60 min no TR.
NOTA: Recomenda-se um volume de 0,2 mL por cm2 . - Remover o sobrenadante e incubar as células durante a noite a 4 °C, com os respectivos anticorpos primários diluídos em tampão de coloração (1x DPBS [+/+] contendo 1% de BSA) (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de que as células estão completamente cobertas pela solução.
NOTA: Recomenda-se um volume de 0,1-0,15 mL por cm2 . - Aspirar o tampão de coloração e enxaguar as células 3x em 1x DPBS (+/+).
- Diluir os anticorpos secundários correspondentes (ver Tabela de Materiais) em tampão de coloração a uma concentração final de 1:1.000.
- Incubar as células em solução de anticorpos diluída por 1 h em TR no escuro. Certifique-se de que as células estão completamente cobertas pela solução.
NOTA: Recomenda-se um volume de 0,1-0,15 mL por cm2 . - Aspirar a solução de anticorpos secundários e enxaguar as células 2x em 1x DPBS (+/+).
- Contracorar os núcleos com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), diluído em DPBS (+/+) por 5 min em TR.
NOTA: Recomenda-se um volume de trabalho de 0,1-0,15 mL por cm2 . - Enxágue as células 2x em 1x DPBS (+/+).
- Armazene as células em DPBS (+/+) a 4 °C até obter imagens.
NOTA: A imagem de campo brilhante é adequada para rastrear alterações morfológicas e crescimento de neuritos. Além disso, a expressão de marcadores estereotipados pode ser avaliada por microscopia de fluorescência. Enquanto hiPSCs indiferenciadas expressam OCT 3/4 e NANOG, beta-III-tubulina (TUBB3) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2) podem servir como marcadores neuronais para visualizar neuritos e axônios. A rede neurítica pode ser ainda avaliada determinando-se o comprimento do neurito em imagens de campo claro ou fluorescentes.
- Aspirar o meio dos neurônios derivados da hiPSC e lavar as células uma vez com 1x DPBS com Ca 2+ e Mg2+ (+/+).
- Análise da expressão gênica por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR)
- Aspirar o meio e enxaguar as células uma vez em 1x DPBS (-/-).
NOTA: Recomenda-se um volume de 0,2 mL por cm2 . - Adicione o tampão de lise de RNA frio e colete as células arranhando.
- Isolar o RNA usando um kit adequado baseado em coluna e determinar as concentrações de RNA por fotoespectrometria UV.
- Gere cDNA usando 250 ng de RNA total e um kit adequado para transcrição reversa.
- Preparar reações de qPCR de balizamento molecular contendo 2,5 ng de cDNA em duplicata. Use uma mistura mestre apropriada e ensaios de primer correspondentes20 (consulte Tabela de Materiais).
- Execute o qPCR aplicando 45 ciclos com recozimento do primer a 60 °C por 20 s.
- Normalizar os níveis relativos de expressão gênica para a média dos genes housekeeping GAPDH, HPRT1 e GUSB. Aplicar o método ΔΔCt23, utilizando hiPSCs indiferenciadas como calibrador.
- Aspirar o meio e enxaguar as células uma vez em 1x DPBS (-/-).
Representative Results
Durante os passos iniciais, culturas aderentes de hiPSCs são destacadas, singularizadas e transferidas para suspensão (Figura 2). Os agregados são formados dentro de 24 h e crescem continuamente em tamanho. Após 2 dias da indução do transgene, os neurônios iniciais podem ser criopreservados para experimentos subsequentes.
A proliferação persistente durante os primeiros dias em suspensão produz um aumento no número de células, atingindo seu pico após 2 dias de indução (Figura 3A,B). Junto com a proliferação, os agregados começam a crescer. Em relação ao dia 0, o diâmetro apresenta um aumento de 50% no dia 2, sendo quase duplicado no dia 5 (Figura 3D). Embora o aumento do diâmetro limite o suprimento de nutrientes no interior dos agregados, a viabilidade das células não é afetada no dia 2 ou no dia 5 de diferenciação (Figura 3C). Entretanto, o cultivo prolongado por mais de 4 dias em suspensão não melhora ainda mais o rendimento celular, uma vez que os agregados tornam-se cada vez mais resistentes à singularização enzimática (Figura 3B).
Após a criopreservação, as células do dia 2 são descongeladas e plaqueadas em placas revestidas de poli-L-ornitina (PLO)-laminina para maturação terminal. Em geral, as células se ligam muito bem após o descongelamento e começam a estender os neuritos logo no início. O perfil temporal de expressão gênica, bem como a coloração imunocitoquímica para os marcadores neuronais TUBB3 e MAP2, confirmam a identidade celular neuronal (Figura 4A,B). Além dos níveis crescentes de TUBB3 e MAP2, as culturas neuronais são enriquecidas em transcritos de proteína tau associados a microtúbulos (MAPT), codificando uma proteína neuronal envolvida na estabilização do axônio, e mostram um declínio concomitante na expressão do fator de transcrição regulador de pluripotência POU5F1. Além disso, uma densa rede neurítica é formada na primeira semana após o descongelamento (Figura 4C). Essas alterações morfológicas, em conjunto com o perfil transcricional, sugerem uma maturação crescente das culturas neuronais.
Figura 2: Geração de neurônios iNGN2 derivados de hiPSC usando um biorreator de bancada. (A) Visão esquemática do paradigma de diferenciação, destacando as principais etapas do cultivo celular. (B-F) Imagens de campo claro visualizam (B) hiPSCs e (C,D) a formação de agregados no biorreator de bancada. Os neurônios (E,F) iNGN2 estendem neuritos e sofrem alterações morfológicas durante a diferenciação. Barra de escala = 100 μm. Abreviações: BMM = matriz da membrana basal; iPSC-MM = meio de manutenção iPSC; PLO = poli-L-ornitina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Produtividade e viabilidade celular durante a formação e crescimento de agregados. (A) Imagens de campo claro retratam a formação de agregados em até 2 dias de cultivo no biorreator de bancada, bem como o aumento do tamanho dos agregados ao longo do tempo. Barra de escala = 500 μm. (B) Quantificação do rendimento celular e (C) viabilidade ao longo do curso de diferenciação. Os gráficos de barras representam a média + DP de quatro experimentos independentes. (D) O diâmetro, indicativo do tamanho dos agregados, foi determinado semiautomaticamente utilizando-se o software livre ImageJ (versão 1.53). Primeiramente, imagens de campo claro foram convertidas em imagens binárias e, em seguida, posteriormente avaliadas usando a ferramenta analisar partículas, aplicando-se os seguintes parâmetros: tamanho > 2.500 μm2, circularidade 0,45-1, excluir bordas e incluir furos. As linhas horizontais indicam a média ± DP de cinco diferenciações independentes. Pontos únicos representam a média dos experimentos individuais de diferenciação com pelo menos 20 agregados por ponto de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização dos neurônios iNGN2 derivados da hiPSC. Perfil temporal de expressão gênica para os genes neuronais TUBB3, MAP2 e MAPT, bem como para o gene pluripotente associado a células-tronco POU5F1. Os níveis relativos de expressão foram normalizados para os genes de referência GAPDH, HPRT1 e GUSB. HiPSCs indiferenciadas (dia-2) foram escolhidas como calibradoras. Os símbolos geométricos indicam a média ± DP de quatro diferenciações independentes. (B) Imagens representativas de neurônios iNGN2 no dia 7 após o descongelamento (dia-2 + 7), corados para beta-III-tubulina (TUBB3, magenta) e proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2, ciano). Os núcleos celulares foram contracorados com DAPI. Barras de escala = 100 μm. (C) Avaliação da rede neurítica em imagens de campo claro de culturas neuronais após o descongelamento. O comprimento total dos neuritos foi determinado em uma área de 930,82 × 698,11 μm2 usando o ImageJ (versão 1.53). Após ajuste do brilho e contraste, as imagens foram convertidas em imagens de 8 bits e as cores foram invertidas. Neurites foram posteriormente esqueletizadas e, em seguida, analisadas usando os plugins ImageJ 'Skeletonize' e 'Analyze Skeleton', respectivamente. O comprimento total dos neuritos foi dividido pelo número de somas na região de interesse para produzir o comprimento médio do neurito/célula. Os gráficos de barras representam a média + DP de três experimentos independentes. Abreviações: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A expressão ectópica do fator de transcrição neuronal NGN2 foi previamente demonstrada para acelerar os estágios iniciais da diferenciação neuronal e induzir o comprometimento da linhagem neuronal em hiPSCs dentro de 1 semana de cultivo12,13,20. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs BIONi010-C-13 editadas por genes em neurônios iNGN2 usando um biorreator de bancada.
O biorreator CERO 3D é um biorreator de baixo volume com quatro slots para tubos especializados, cada um com capacidade máxima de 50 mL. A temperatura e os níveis de CO2 são continuamente controlados e os parâmetros de cultivo (por exemplo, velocidade e tempo de rotação) são regulados para cada tubo, permitindo que os usuários executem várias abordagens de diferenciação em paralelo. Os quebra-ondas integrados na parede interna do tubo permitem uma perturbação do meio com baixa tensão de cisalhamento e mantêm os agregados 3D em suspensão durante a rotação controlada. O acesso limitado a nutrientes, bem como as interações 3D célula-célula e célula-matriz extracelular (MEC) forçadas, podem influenciar significativamente a diferenciação e o comportamento celular24,25,26,27.
O cultivo de células na forma de agregados 3D em suspensão aumenta essas interações celulares, mimetizando mais de perto o ambiente in vivo de tecidos ou órgãos28. A perturbação concomitante do meio regula o tamanho do agregado devido ao atrito mecânico, melhora as trocas gasosas e reduz o gradiente de nutrientes e resíduos no tubo, preservando gradientes fisiológicos relevantes no interior dos agregados 29,30,31,32,33,34 . Embora as trocas de meio sejam realizadas manualmente, o biorreator de bancada reduz os custos de mão de obra e operação em comparação com frascos de cultura estática. O biorreator também oferece várias vantagens em relação aos biorreatores de tanque de agitação totalmente automatizados, pois o projeto livre de impulsor reduz a tensão de cisalhamento hidrodinâmica na superfície do agregado, melhorando assim não apenas a sobrevivência celular, mas também limitando os efeitos da tensão de cisalhamento sobre iPSCs sensíveis, diferenciação celular e função35,36,37,38.
Biorreatores de roda vertical, nos quais as células são agitadas por um grande rotor vertical, bem como biorreatores de movimento de balanço usando sacos de cultura inflados acoplados a uma plataforma motorizada, representam plataformas de suspensão 3D alternativas. Embora excessivamente testados para o cultivo de hiPSCs 17,18,19,39,40, pouco se sabe sobre sua aplicabilidade em abordagens de diferenciação neuronal, e relatos são limitados à expansão bem-sucedida de células precursoras neurais de mamíferos e humanos em biorreatores de tanques de agitação41,42,43,44, com um raro número de estudos enfocando maturação44,45. Em geral, as plataformas de suspensão 3D automatizadas oferecem a vantagem de trocas de meio totalmente automatizadas e controladas por computador, reduzindo assim as variações no manuseio e minimizando o risco de contaminação. Além disso, parâmetros nutricionais como lactato e concentração de glicose podem ser continuamente monitorados. No entanto, o estabelecimento desses sistemas muitas vezes requer um investimento inicial significativo, espaço laboratorial e treinamento de pessoal qualificado. O biorreator de bancada representa uma alternativa compacta e de fácil utilização para o cultivo de células em suspensão, mas não proporciona monitoramento concomitante de nutrientes.
Como na maioria dos protocolos utilizados para o cultivo de células em plataformas de suspensão 3D, a formação inicial de agregados representa uma etapa crítica. hiPSCs são cultivadas como monocamadas aderentes e posteriormente transferidas como suspensões de célula única para um ambiente 3D. Para minimizar a perda celular nessa fase, vários aspectos precisam ser considerados. O design dos tubos com os quebra-ondas integrados significa que um volume mínimo de cultura de 10 mL por tubo é necessário para garantir a perturbação média ideal. O volume crítico não deve, por conseguinte, ser subcotado a longo prazo. Além disso, uma densidade inicial de semeadura de 7,5 milhões de células por 10 mL de volume de cultura, e uma velocidade de rotação de 60 rpm, é altamente recomendada para formar agregados estáveis em curto prazo, embora adaptações possam ser necessárias dependendo da linhagem celular.
Após a transferência de hiPSCs para suspensão, os agregados devem ser formados dentro de 24 h. A primeira mudança de meio é crítica, pois os agregados são pequenos e podem não se acomodar adequadamente. O tempo para a sedimentação dos agregados pode ser estendido, mas não deve exceder mais de 10 min, pois os agregados podem começar a se aglomerar e crescer de forma heterogênea. Durante a aspiração, um volume mínimo de cultura de 5 mL deve ser deixado no tubo e quaisquer perturbações do meio devem ser evitadas. No entanto, é de esperar uma perda de células e agregados durante as fases iniciais. A contagem celular indica um rendimento celular constante nos primeiros 2 dias em cultura, indicando que a alta capacidade proliferativa das hiPSCs compensa a perda celular inicial. Uma vez em suspensão, o cultivo suave e a perturbação levam a agregados de tamanho homogêneo que começam a crescer com o tempo.
A diferenciação neuronal foi realizada de acordo com um protocolo previamente publicado baseado na superexpressão de NGN2 induzida por doxiciclina13, e as etapas individuais foram otimizadas para um cultivo 3D. O fator de transcrição neuronal NGN2 é um driver bem descrito na diferenciação neuronal e acelera significativamente a indução neuronal11,13,46. Enquanto o padrão convencional com fatores de crescimento definidos leva várias semanas a meses 7,8,9, a expressão de NGN2 induz o destino das células neuronais em poucos dias. Além do tempo de cultivo encurtado, o protocolo não depende de fatores de crescimento dispendiosos nem de matrizes de revestimento para a cultura inicial em suspensão, reduzindo adicionalmente os custos de cultivo.
Além disso, uma comparação direta da geração de neurônios imaturos impulsionada por NGN2 em culturas aderentes e em suspensão revelou um aumento de 1,36 vezes nas células após 4 dias em cultura usando o biorreator de bancada20, enquanto o volume de meio necessário para a geração de 1 milhão de células deve ser reduzido pela metade. O emprego do biorreator de bancada para a geração de neurônios iNGN2 pode, portanto, ser benéfico, pois um número maior de células pode ser produzido com menor tempo e custo de manuseio. Em concordância com relatos anteriores, o comprometimento da linhagem neuronal foi observado precocemente. Após 2 dias de indução com NGN2, uma expressão profunda de marcadores neuronais clássicos como TUBB3, MAP2 e MAPT foi evidente, apoiando a aplicabilidade do biorreator de bancada para indução neuronal. Seguindo este protocolo, aproximadamente 6,2 milhões de neurônios imaturos iNGN2 podem ser obtidos de 1 milhão de hiPSCs dentro de 4 dias de cultura. No entanto, a capacidade de produção pode variar entre os lotes e depender do volume de cultura de suspensão na semeadura.
Para aumentar ainda mais a produtividade, o tempo de cultivo foi estendido por mais 3 dias; no entanto, embora os agregados tenham se tornado maiores, eles também se tornaram altamente compactos e não puderam ser dissociados adequadamente para criopreservação ou replaqueamento. Apesar dos avanços nas abordagens de cultura 3D, culturas neuronais 2D aderentes ainda são o padrão-ouro para análises funcionais, como arranjos de microeletrodos ou imagens de cálcio. A singularização celular é, portanto, um pré-requisito importante para uma monocamada neuronal homogeneamente distribuída e uma rede neurítica. Um descolamento mecânico mais forte das células ou reagentes de dissociação severos podem ser usados para garantir a singularização, mas com efeitos potenciais sobre a viabilidade celular, fisiologia e capacidade de re-ligação47,48. Com relação à necessidade de células isoladas para análises posteriores e maturação, os agregados foram dissociados após 4 dias de suspensão, e os neurônios iNGN2 (dia 2) criopreservados. A diferenciação e caracterização pós-descongelamento dos neurônios iNGN2 confirmaram uma maturidade crescente das culturas neuronais e a formação de uma densa rede neurítica.
O protocolo fornecido produz um número elevado de neurônios iNGN2. No entanto, várias limitações precisam ser consideradas. Como para a maioria das plataformas de cultura de suspensão, a transferência de hiPSCs de uma cultura aderente 2D para um ambiente 3D é crítica e frequentemente associada a uma profunda perda celular. Espera-se mais perdas significativas de células e agregados durante as mudanças de mídia. Em comparação com as plataformas automatizadas, o tempo de manuseio e o risco de contaminação usando o biorreator de bancada são aumentados, pois as trocas de meio devem ser realizadas manualmente. Além da falta de automação, o biorreator de bancada não oferece a possibilidade de monitorar os nutrientes, e a capacidade máxima de 50 mL por tubo limita o potencial de upscaling do protocolo. Finalmente, é importante notar que, embora a NGN2 acelere o comprometimento da linhagem neuronal, a duração da maturação terminal não é encurtada e ainda requer cultura de longo prazo ao longo de várias semanas. Dada a importância do suporte astrocitário para a função neuronal, apego e sobrevivência 49,50,51, abordagens de co-cultivo devem ser consideradas, podendo até ser essenciais para o cultivo a longo prazo.
Em resumo, um protocolo de diferenciação 2D foi traduzido com sucesso para um ambiente 3D para a geração rápida e reprodutível de neurônios iNGN2 através da implementação de um biorreator de bancada. O protocolo descrito produz altas quantidades de neurônios derivados de iPSC de boa qualidade, que podem servir como ponto de partida para testes de modelos complexos, triagens de drogas de alto rendimento e ensaios de toxicidade em larga escala.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
O projeto EBiSC2 recebeu financiamento da Empresa Comum (JU) Innovative Medicines Initiative 2 ao abrigo do acordo de subvenção n.º 821362. A Empresa Comum recebe apoio do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia e da EFPIA. Agradecemos a Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters e Vanessa M. Nalewaja por sua assistência em análises imunocitoquímicas e de expressão gênica, bem como Heike Arthen por seu excelente suporte técnico. Além disso, agradecemos a Stephanie Bur pelo estabelecimento do programa de biorreatores. A Figura 2A foi criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
| 60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
| Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
| BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
| Biorender | Biorender.com | ||
| BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
| CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
| CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
| Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
| CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
| Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
| DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
| Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
| DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
| ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
| MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
| Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
| mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
| Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
| Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
| NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
| Origin 2021 | OriginLab | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
| Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
| RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
| Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
| StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
| TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
| Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
| X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
| Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |
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