Summary
Denne artikel beskriver en protokol til generering af humane inducerede pluripotente stamcelleafledte neuroner i en benchtop 3D-suspensionsbioreaktor.
Abstract
Afledningen af neuronale afstamningsceller fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) markerede en milepæl i hjerneforskning. Siden deres første fremkomst er protokoller løbende blevet optimeret og bruges nu i vid udstrækning inden for forskning og lægemiddeludvikling. Den meget lange varighed af disse konventionelle differentierings- og modningsprotokoller og den stigende efterspørgsel efter hiPSC'er af høj kvalitet og deres neurale derivater øger imidlertid behovet for vedtagelse, optimering og standardisering af disse protokoller til storskala produktion. Dette arbejde præsenterer en hurtig og effektiv protokol til differentiering af genetisk modificerede, doxycyclin-inducerbare neurogenin 2 (iNGN2)-ekspressive hiPSC'er i neuroner ved hjælp af en benchtop tredimensionel (3D) suspension bioreaktor.
Kort fortalt fik enkeltcellesuspensioner af iNGN2-hiPSC'er lov til at danne aggregater inden for 24 timer, og neuronal afstamningsforpligtelse blev induceret ved tilsætning af doxycyclin. Aggregater blev dissocieret efter 2 dages induktion, og celler blev enten kryopræserveret eller genbelagt til terminal modning. De genererede iNGN2-neuroner udtrykte klassiske neuronale markører tidligt og dannede komplekse neuritiske netværk inden for 1 uge efter genplettering, hvilket indikerer en stigende modenhed af neuronale kulturer. Sammenfattende leveres en detaljeret trin-for-trin-protokol til hurtig generering af hiPSC-afledte neuroner i et 3D-miljø, der har stort potentiale som udgangspunkt for sygdomsmodellering, fænotypiske lægemiddelscreeninger med høj gennemstrømning og toksicitetstest i stor skala.
Introduction
Neurologiske lidelser er den hyppigste årsag til handicap på verdensplan1. En ud af seks mennesker er ramt, og forekomsten fortsætter med at stige. Den dermed forbundne økonomiske byrde for samfundene og deres sundhedssystemer er enorm. En evaluering af 30 europæiske lande i 2010 anslog årlige omkostninger på 800 mia. EUR i forbindelse med psykiske og neurologiske lidelser2. Den stigende samfundsøkonomiske byrde kræver effektive behandlingsstrategier, og selvom vores forståelse af sygdomspatofysiologi er steget betydeligt, er oversættelsen til klinikker ofte utilstrækkelig. Generelt indgår kun 12 % af lægemidlerne i kliniske forsøg, hvoraf mere end 80 % mislykkes i senere faser, primært på grund af ineffektivitet eller uventet toksicitet 3,4. Årsagerne er forskellige, men den begrænsede overførbarhed fra dyreforsøg i prækliniske stadier til forsøg på mennesker er i stigende grad kommet i forgrunden5. Humane in vitro-celle- og vævsmodeller kan bygge bro over forskellen i translationen mellem arterne, og fremskridt inden for human-induceret pluripotent stamcelleteknologi (hiPSC) har et stort potentiale i denne henseende. hiPSC'er anvendes i vid udstrækning i grundforskning og har væsentlige karakteristika til fælles med embryonale stamceller (hESC'er), såsom en næsten ubegrænset evne til selvfornyelse og evnen til at differentiere sig til alle tre kimlag6, samtidig med at de etiske betænkeligheder i forbindelse med destruktion af embryoner omgås.
Afledningen af neuronale celler fra hESC'er og senere hiPSC'er markerede en milepæl i hjerneforskning. Indledende differentieringsprotokoller var baseret på anvendelse af vækstfaktorer, der efterlignede kritiske trin under embryogenese, hvoraf de fleste involverede dobbelt SMAD-hæmning enten i suspension eller vedhængende kulturer 7,8,9. Modne neuroner er blevet genereret med succes, men flere ulemper ved disse protokoller hæmmer stadig deres brede anvendelse i lægemiddeludvikling, såsom det lave udbytte og den høje batch-til-batch-variabilitet af genererede neuroner samt den omfattende arbejdsbyrde relateret til lange dyrkningstider. Forbedringer er opnået ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer, der er kritisk involveret i neurogenese, og medlemmer af neurogenin (NGN) familien, især NGN2, er blevet identificeret som effektive drivkræfter10. Den lentiviralt medierede ektopiske ekspression af NGN2 i hiPSC'er accelererede tidlige stadier af neuronal differentiering signifikant og inducerede neuronal celleskæbne inden for kun 1 uge11. Efterfølgende terminal modning i co-kulturer med astrocytter gav funktionelle neuroner i høj renhed og mængde med reproducerbare egenskaber. Site-directed gen-redigering af adeno-associeret virus integration site 1 (AAVS1) safe-harbor locus blev derefter anvendt til at skabe hiPSC-linjer med en stabil og doxycyclin-inducerbar ekspressionskassette til NGN212,13, hvilket minimerer uønskede bivirkninger af lentiviral levering.
Den robuste og effektive differentiering af doxycyclin-inducerbare neurogenin 2 (iNGN2) neuroner har stort potentiale for fænotypiske lægemiddelscreeninger med høj kapacitet og toksicitetsassays10,14,15; og der er gjort betydelige fremskridt inden for bioforarbejdning i løbet af det sidste årti med implementering af bioreaktorer til en skalerbar celleudvidelse og differentiering16,17,18,19. Imidlertid er de fleste differentieringsprotokoller optimeret til vedhængende kulturer, og oversættelse til et tredimensionelt (3D) miljø kræver ofte væsentlige ændringer. For nylig er den vellykkede anvendelse af en benchtop 3D-bioreaktor med reducerede forskydningsspændingsfunktioner blevet rapporteret til udvidelse af hiPSC'er og til reproducerbar differentiering i hepatocytter, kardiomyocytter og neuroner20. Her tilvejebringes en detaljeret protokol til generering og karakterisering af iNGN2-neuroner ved anvendelse af den identiske stationære 3D-bioreaktor.
Protocol
BEMÆRK: Alle cellemanipulationer samt dyrkningsskåle og mediumpræparater skal udføres under sterile forhold. Den laminære strømningshætte skal rengøres grundigt før brug og efter forarbejdning ved at tørre alle overflader af med 70% ethanol. Den beskrevne protokol er optimeret til neuronale differentieringer i en CERO 3D-inkubator og bioreaktor (i det følgende benævnt benchtop bioreaktor). Denne stationære bioreaktor tilbyder fire slots til specialiserede bioreaktorrør, hver med en maksimal kapacitet på 50 ml. Temperatur- og CO2 -niveauer styres kontinuerligt, og dyrkningsparametre (f.eks. Rotationshastighed og tid) reguleres uafhængigt for hvert rør. Alle aspirationstrin er udført ved hjælp af en aspirationspipette og vakuumpumpe, medmindre andet er angivet.
1. Dyrkning og udvidelse af hiPSC'er
BEMÆRK: Den konstruerede doxycyclin-inducerbare NGN2 hiPSC-linje BIONi010-C-13 anvendes i denne protokol. Udvidelsesprotokollen, der leveres her, er optimeret til 6 cm petriskåle, men alternative kulturformater kan bruges, hvis det foretrækkes.
- Overtræk 6 cm petriskåle med kældermembranmatrix fortyndet i kold Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM)/F12 (-/-) ved en slutkoncentration på 0,083 mg/ml/10 cm2. De overtrukne skåle inkuberes ved 37 °C i mindst 30 minutter.
BEMÆRK: En detaljeret protokol til fremstilling af kældermembranmatrixopløsning findes i producentens instruktioner. hiPSC'er kan dyrkes på alternative ekstracellulære matricer til ekspansion. - Optø kryopræserverede hiPSC'er i henhold til EBiSC Cell line User Protocol21 i føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium + 10 μM ROCK-hæmmer (Y-27632). En såtæthed på 1 × 106 levedygtige celler pr. 60 mm skål anbefales.
- Skift mediet næste dag til føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium uden ROCK-hæmmer, og udfør daglige medieskift.
- Start forbikørsel, når hiPSC-kulturerne når et sammenløb på 60% -80%. Kontroller for differentierede områder, og rengør kolonierne manuelt, hvis arealet overstiger 5%.
BEMÆRK: Udifferentierede hiPSC'er fremstår som runde celler med en fremtrædende nukleolus og mindre cytoplasma. Flade og tæt pakkede kolonier dannes tidligt efter optøning eller passage. Eksempler på brightfield-billeder af hiPSC-kulturer er vist i figur 1. Yderligere oplysninger findes i EBiSC Cell line User Protocol21. Til passaging skal du forberede kældermembranmatrixbelagte tallerkener og føderfri iPSC-vedligeholdelsesmedium. - Opsug mediet fra hiPSC-kulturer og skyl cellerne 2x med 0,5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) uden Ca 2+ og Mg2+ (DPS [-/-], se materialetabel).
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 2 ml 0,5 mM EDTA i 1x DPBS (-/-) til de 6 cm petriskåle. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 3 minutter i inkubatoren.
- Der suges 1,5 ml EDTA-opløsning til destillation og inkubation fortsættes i 3-5 min.
- Tryk forsigtigt på opvasken for at lette cellefrigørelsen.
BEMÆRK: Kontroller løsrivelse ved visuel vurdering. hiPSC-kolonier bør begynde at løsne sig efter 5 min., men en længere inkubationstid kan være nødvendig ved højere sammenflydende hiPSC-kulturer. Hvis kolonierne ikke løsnes, øges inkubationstiden indtil 10 min, men overskrid ikke denne tidsramme. - Tilsæt 5 ml føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium til de 6 cm petriskåle, og resuspender forsigtigt kolonierne 2x med en 10 ml serologisk pipette eller ved hjælp af pipetter med bred boring. Overfør cellerne til et 15 ml rør.
BEMÆRK: hiPSC'er er meget følsomme over for mekanisk belastning; Derfor bør flere resuspenderinger undgås. Den endelige cellesuspension skal bestå af små kolonifragmenter (50-200 μm). - Supernatanten suges ud af de overtrukne dyrkningsskåle, og der tilberedes 4 ml føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium pr. 6 cm skål.
- Overfør små kolonifragmenter til de frisklavede dyrkningsretter i splitforhold på 1:10 til 1:40, og dyrk ved 37 °C og 5% CO2 med daglige medieskift.
BEMÆRK: Små kolonier skal fastgøres inden for 1 eller 2 timer efter passage.
Figur 1: Morfologi af humant inducerede pluripotente stamcellekulturer . (A,B) HiPSC-kulturer af god kvalitet med forskellig sammenløb, der viser komprimerede hiPSC-kolonier med en homogen morfologi og definerede kanter. C) hiPSC-kultur med nye klynger af differentierede celler omkring kolonikanterne (stiplet hvid linje). Skalabjælke = 200 μm. Forkortelse: hiPSC = human induceret pluripotent stamcelle. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Fordyrkning af hiPSC'er i benchtop-bioreaktorsystemet (dag-2)
BEMÆRK: Start fordyrkning, når hiPSC-kulturerne når et sammenløb mellem 60% og 80%. Kontroller hiPSC-kolonierne for differentierede områder. I denne fordyrkningsfase opretholdes hiPSC'erne i føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium i 2 dage.
- Forbered dyrkningsmediet, der består af føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium og 10 μM ROCK-hæmmer (Y-27632).
- Opsug mediet helt fra hiPSC'erne, og skyl forsigtigt cellerne med 1x DPBS (-/-) to gange.
- Tilsæt 2,0 ml forvarmet trypsin-EDTA-opløsning til de 6 cm petriskåle og inkuber cellerne i 3 minutter ved 37 °C i inkubatoren.
- Bank let på opvasken for at lette cellefrigørelsen, eller inkuber i 1-2 minutter længere.
- Resuspender cellerne i 5 ml føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium + ROCK-hæmmer pr. skål. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml eller 50 ml rør og bland forsigtigt ved pipettering for at sikre cellesingularisering.
- Bestem cellenumrene i 100 μL cellesuspension ved hjælp af en automatiseret celletæller som tidligere beskrevet20. Det tilsvarende volumen overføres til 15 × 106 celler pr. bioreaktorrør til et 50 ml rør.
- Centrifuger cellerne ved 300 × g i 3 min.
- Supernatanten suges op, og cellerne resuspenderes i 2 ml føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium + ROCK-hæmmer.
- Fyld hvert 50 ml rør op med 18 ml medium (cellesåtæthed på 0,75 × 106 celler / ml). Cellesuspensionen hældes i bioreaktorrørene (20 ml pr. Rør).
- Placer rørene i bioreaktorsystemet. Indstil følgende dyrkningsparametre: 2 s rotationsperiode, 60 o / min rotationshastighed, ingen omrøringspause, 37 ° C og 5% CO2 i ubegrænset varighed20.
- Start dyrkningsprogrammet via bioreaktordisplayet.
- Skift medie næste dag. Lad aggregaterne lægge sig i bioreaktorrørene i ~5 min. Sug forsigtigt supernatanten op.
BEMÆRK: Lad ikke aggregaterne lægge sig i mere end 10 minutter, da de kan klæbe til hinanden og opbygge en heterogen aggregatophæng. Det anbefales at efterlade ~ 5 ml dyrkningsmedium i bioreaktorrøret. - Tilsæt 15 ml frisk føderfrit iPSC-vedligeholdelsesmedium uden ROCK-hæmmer pr. rør, og fortsæt dyrkningen i benchtop-bioreaktoren i 24 timer.
3. Differentiering af hiPSC'er i tidlige neuroner (dag 0)
- Forbered neurobasalt medium (NBM): 50% DMEM / F-12 med stabiliseret L-alanyl-L-glutamindipeptid, 50% neurobasalt medium, 0,5x serumfrit supplement (50x), 0,5x serumfrit supplement baseret på Bottensteins N-1-formulering (100x), 0,5x stabiliseret L-alanyl-L-glutamindipeptid, 0,5x MEM ikke-essentielle aminosyrer opløsning (100x), 500 nM natriumpyruvat (100 mM), 50 nM 2-mercaptoethanol (50 mM), 0,025% human insulinopløsning og 5 U / ml penicillin-streptomycin.
BEMÆRK: NBM skal opbevares ved 4 °C og kan bruges i op til 2 uger. - Start neuronal differentiering ved at tilføje doxycyclin (DOX) til hiPSC-kulturerne. Til dette skal aggregaterne slå sig ned i bioreaktorrørene. Supernatanten suges forsigtigt ud af cellerne, så ~5 ml efterlades i glasset, og der tilsættes 35 ml neuralt induktionsmedium (NIM) bestående af NBM og 2 μg/ml DOX.
BEMÆRK: Da DOX er lysfølsom, anbefales det at slukke lyset, mens du arbejder. - Placer rørene tilbage i benchtop bioreaktoren og fortsæt dyrkningen.
- Udfør medieskift hver dag i 2 dage, som beskrevet i trin 3.2.
BEMÆRK: Efter 4 dage i suspensionskultur kan aggregaterne dissocieres, og tidlige neuroner kryopræserveres eller direkte genbelægges til terminal modning.
4. Kryopræservering af tidlige neuroner (dag 2)
BEMÆRK: Kryopræservering er ikke påkrævet og ikke kritisk for differentieringsprocessen, men anbefales stærkt, da store lagre af tidlige neuroner kan produceres og opbevares til efterfølgende modning og analyser.
- Lad aggregaterne slå sig ned i bioreaktorrøret. Supernatanten suges som tidligere beskrevet.
- Overfør aggregaterne til et sterilt 15 ml eller 50 ml rør og skyl forsigtigt aggregaterne 2x med 1x DPBS (-/-). Supernatanten suges forsigtigt så meget som muligt uden at forstyrre aggregaterne.
- Tilsæt 2-5 ml forvarmet celledissociationsenzym, afhængigt af pelletstørrelsen, og inkuber cellerne i ca. 10 minutter ved 37 °C i et vandbad. De sedimenterede aggregater resuspenderes forsigtigt hvert 2. minut, indtil aggregaterne adskilles.
BEMÆRK: En næsten homogen cellesuspension bør opnås efter 7-10 minutters inkubation. - Tilsæt det tredobbelte volumen af forvarmet NBM-medium og resuspender cellerne omhyggeligt for at sikre cellesingularisering.
- Bestem cellenumrene, og overfør det tilsvarende volumen til kryopræservering til et 15 ml eller 50 ml rør.
BEMÆRK: En celletæthed på 5-10 × 106 celler/ml frysemedium anbefales. - Centrifuger cellerne ved 300 × g i 3 min.
- Supernatanten suges til syn, og cellepellettet resuspenderes forsigtigt i det tilsvarende volumen frysemedium indeholdende 10 % dimethylsulfoxid (DMSO).
- Alikvote cellesuspensionen i egnede hætteglas til kryopræservering (1 ml/hætteglas).
- Overfør straks hætteglassene til en forkølet, langsom frysebeholder fyldt med 2-propanol, og anbring beholderen ved -80 °C natten over. Hætteglassene anbringes ved -150 °C næste dag til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Den flydende 2-Propanol er meget brandfarlig og kan forårsage øjenskade ved kontakt. Hold dig væk fra varme og brug beskyttelseshandsker samt briller.
5. Modning af hiPSC-afledte neuroner i enkeltlagskulturer
- Forbered poly-L-ornithin/laminin-coatede kulturretter til langsigtet dyrkning af hiPSC-afledte neuroner.
- Poly-L-ornithinstamopløsningen fortyndes til 0,001 % i 1x DPBS (-/-), og opvasken overtrækkes natten over ved 4 °C eller i 4 timer ved 37 °C. Opsug poly-L-ornithinopløsningen og vask pladerne en gang med 1x DPBS (-/-).
- Lamininopløsningen fortyndes i 1x DPBS (-/-) til en slutkoncentration på 10 μg/ml og inkuberes opvasken natten over ved 4 °C eller i 4 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Et volumen på 0,1-0,15 ml pr. cm 2 anbefales til belægningsprocedurerne og 0,2 ml pr. cm2 for alle respektive vasketrin. Alternative belægningssubstrater kan anvendes, men potentielle virkninger på cellebinding og modning bør evalueres.
- Optø de kryopræserverede celler. Til dette formål anbringes kryoialen i et vandbad (indstillet til 37 °C) og hvirvles rundt i ca. 1 min., indtil der er en lille klump frossen cellesuspension tilbage.
- Overfør forsigtigt cellesuspensionen dråbevis til et 15 ml rør tilberedt med 10 ml forvarmet NBM. Kryovialt skylles med 1 ml NBM og overføres cellesuspensionen til det identiske 15 ml glas.
- Centrifuger cellerne ved 300 × g i 3 min.
- Supernatanten suges til og tilsættes 1-2 ml NIM suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer.
- Resuspender cellepillen omhyggeligt og bestem cellenumrene.
- Den resterende lamininopløsning opsuges fra de coatede cellekulturskåle, og cellerne sås med en såtæthed på 1 × 105 celler/cm2 i NIM suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer.
- Skift mediet efter 24 timer til NIM uden ROCK-hæmmer.
- Udfør daglige medieændringer i 4 dage.
- Efter denne indledende fase af NGN2-induktion udelades DOX og dyrkes cellerne i NBM, med halve medieskift 2x om ugen, indtil de når det ønskede modningsstadium.
BEMÆRK: Co-dyrkning af iNGN2 neuroner med astrocytter anbefales for at øge celleoverlevelse, vedhæftning, modenhed og elektrisk aktivitet13,22.
6. Karakterisering af hiPSC-afledte neuroner
BEMÆRK: Differentiering i neuronale derivater kan evalueres ved hjælp af følgende teknikker.
- Immuncytokemi og billeddannelse
- Opsug mediet fra de hiPSC-afledte neuroner og vask cellerne en gang med 1x DPBS med Ca 2+ og Mg2+ (+/+).
BEMÆRK: Pipette forsigtigt, fortrinsvis på brøndkanterne, da celler meget let kan løsne sig fra overfladen. Et volumen på 0,2 ml pr. cm2 anbefales til alle vasketrin for at sikre en komplet dækning af celler med 1x DPBS (+/+). - Fastgør neuronceller ved hjælp af en fikseringsopløsning indeholdende 4% paraformaldehyd i DPBS (+/+) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT). Et volumen på 0,1 ml pr. cm2 anbefales.
BEMÆRK: Paraformaldehyd (4%) i DPBS er en farlig og hudirriterende opløsning med akut toksicitet og potentiel kræftfremkaldende virkning. Holdes væk fra varme, brug beskyttelseshandsker og briller, undgå indånding og brug kun opløsningen i et ventileret miljø. - Skyl forsigtigt cellerne 2x i 1x DPBS (+/+) og fortsæt med farvning.
BEMÆRK: Faste celler kan opbevares i DPBS (+/+) ved 4 °C i op til 1 måned indtil videre behandling. - Opsug DPBS (+/+) fra prøver. Permeabiliser cellerne og bloker ikke-specifikke bindingssteder med 1x DPBS (+/+) indeholdende 1% BSA og 0,2% Triton-X-100 i 60 minutter ved RT.
BEMÆRK: Et volumen på 0,2 ml pr. cm2 anbefales. - Supernatanten fjernes og inkuberes cellerne natten over ved 4 °C med de respektive primære antistoffer fortyndet i farvningsbuffer (1x DPBS [+/+] indeholdende 1 % BSA) (se materialetabellen). Sørg for, at cellerne er fuldstændigt dækket af opløsningen.
BEMÆRK: Et volumen på 0,1-0,15 ml pr. cm2 anbefales. - Opsug farvningsbufferen og skyl cellerne 3x i 1x DPBS (+/+).
- Fortynd de tilsvarende sekundære antistoffer (se materialetabel) i farvningsbuffer ved en slutkoncentration på 1:1.000.
- Inkuber cellerne i fortyndet antistofopløsning i 1 time ved RT i mørke. Sørg for, at cellerne er fuldstændigt dækket af opløsningen.
BEMÆRK: Et volumen på 0,1-0,15 ml pr. cm2 anbefales. - Opsug den sekundære antistofopløsning og skyl cellerne 2x i 1x DPBS (+/+).
- Modfarve kernerne med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), fortyndet i DPBS (+/+) i 5 minutter ved RT.
BEMÆRK: Et arbejdsvolumen på 0,1-0,15 ml pr. cm2 anbefales. - Skyl cellerne 2x i 1x DPBS (+/+).
- Opbevar cellerne i DPBS (+/+) ved 4 °C indtil billeddannelse.
BEMÆRK: Brightfield-billeddannelse er velegnet til at spore morfologiske ændringer og neuritudvækst. Derudover kan stereotypisk markørekspression vurderes ved fluorescensmikroskopi. Mens udifferentierede hiPSC'er udtrykker OCT 3/4 og NANOG, kan beta-III-tubulin (TUBB3) og mikrotubulusassocieret protein 2 (MAP2) tjene som neuronale markører til visualisering af neuritter og axoner. Det neuritiske netværk kan vurderes yderligere ved at bestemme neuritlængden i brightfield eller fluorescerende billeder.
- Opsug mediet fra de hiPSC-afledte neuroner og vask cellerne en gang med 1x DPBS med Ca 2+ og Mg2+ (+/+).
- Genekspressionsanalyser ved kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qPCR)
- Opsug mediet og skyl cellerne en gang i 1x DPBS (-/-).
BEMÆRK: Et volumen på 0,2 ml pr. cm2 anbefales. - Tilsæt kold RNA-lysebuffer og høst cellerne ved at ridse.
- Isoler RNA'et ved hjælp af et passende kolonnebaseret kit, og bestem RNA-koncentrationerne ved UV-fotospektrometri.
- Generer cDNA ved hjælp af 250 ng total RNA og et passende kit til revers transkription.
- Forbered molekylære beacon qPCR-reaktioner indeholdende 2.5 ng cDNA i to eksemplarer. Brug en passende masterblanding og tilsvarende primerassays20 (se materialetabel).
- Kør qPCR ved at anvende 45 cyklusser med primerglødning ved 60 °C i 20 sekunder.
- Normaliser relative genekspressionsniveauer til gennemsnittet af husholdningsgenerne GAPDH, HPRT1 og GUSB. Anvend ΔΔCt-metoden23 ved hjælp af udifferentierede hiPSC'er som kalibrator.
- Opsug mediet og skyl cellerne en gang i 1x DPBS (-/-).
Representative Results
Under de indledende trin løsnes klæbende kulturer af hiPSC'er, singulariseres og overføres til suspension (figur 2). Aggregater dannes inden for 24 timer og vokser kontinuerligt i størrelse. Efter 2 dages transgeninduktion kan tidlige neuroner kryopræserveres til efterfølgende forsøg.
Den vedvarende proliferation i de første dage i suspension giver en stigning i celleantallet, der når sit højdepunkt efter 2 dages induktion (figur 3A, B). Sammen med spredningen begynder aggregater at vokse. Sammenlignet med dag 0 viser diameteren en stigning på 50% på dag 2 og er næsten fordoblet på dag 5 (figur 3D). Selvom en stigende diameter begrænser næringsstoftilførslen inden for aggregaterne, påvirkes cellernes levedygtighed ikke på dag 2 eller på dag 5 af differentieringen (figur 3C). En langvarig dyrkning i mere end 4 dage i suspension forbedrer imidlertid ikke celleudbyttet yderligere, da aggregaterne bliver mere og mere resistente over for enzymatisk singularisering (figur 3B).
Ved kryopræservering optøes dag 2-celler og belægges på poly-L-ornithin (PLO)-lamininbelagte skåle til terminal modning. Generelt fastgøres celler meget godt efter optøning og begynder at udvide neuritter tidligt. Den tidsmæssige genekspressionsprofil samt immuncytokemisk farvning for neuronmarkørerne TUBB3 og MAP2 bekræfter neuronal celleidentitet (figur 4A, B). Ud over stigende niveauer af TUBB3 og MAP2 er neuronale kulturer beriget med mikrotubulusassocierede protein tau-transkripter (MAPT), der koder for et neuronalt protein involveret i axonstabilisering og viser et samtidig fald i ekspressionen af den pluripotensregulerende transkriptionsfaktor POU5F1. Desuden dannes et tæt neuritisk netværk inden for den første uge efter optøning (figur 4C). Disse morfologiske ændringer i forbindelse med transkriptionsprofilen tyder på en stigende modning af neuronale kulturer.
Figur 2: Generering af hiPSC-afledte iNGN2-neuroner ved hjælp af en benchtop bioreaktor. (A) Skematisk oversigt over differentieringsparadigmet, der fremhæver de vigtigste trin i cellekultur. (B-F) Brightfield-billeder visualiserer (B) hiPSC'er og (C,D) dannelsen af aggregater i benchtop-bioreaktoren. (E,F) iNGN2-neuroner udvider neuritter og gennemgår morfologiske ændringer under differentiering. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: BMM = kældermembranmatrix; iPSC-MM = iPSC-vedligeholdelsesmedie PLO = poly-L-ornithin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Celleudbytte og levedygtighed under samlet dannelse og vækst. (A) Brightfield-billeder viser dannelsen af aggregater inden for 2 dage efter dyrkning i benchtop-bioreaktoren samt stigningen i aggregatstørrelse over tid. Skalabjælke = 500 μm. (B) Kvantificering af celleudbyttet og (C) levedygtighed over differentieringsforløbet. Søjlediagrammer repræsenterer gennemsnittet + SD fra fire uafhængige eksperimenter. (D) Diameteren, der indikerer størrelsen af aggregater, blev bestemt halvautomatisk ved hjælp af open source-softwaren ImageJ (version 1.53). Først blev brightfield-billeder konverteret til binære billeder og derefter yderligere vurderet ved hjælp af analysepartikelværktøjet under anvendelse af følgende parametre: størrelse > 2.500 μm2, cirkularitet 0,45-1, udelukker kanter og inkluderer huller. Vandrette linjer angiver den gennemsnitlige SD ± fem uafhængige differentieringer. Enkelte prikker repræsenterer gennemsnittet af individuelle differentieringseksperimenter med mindst 20 aggregater pr. Tidspunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af hiPSC-afledte iNGN2-neuroner. Temporal genekspressionsprofil for de neuronale gener TUBB3, MAP2 og MAPT samt det pluripotente stamcelleassocierede gen POU5F1. Relative ekspressionsniveauer blev normaliseret til referencegenerne GAPDH, HPRT1 og GUSB. Udifferentierede hiPSC'er (dag-2) blev valgt som kalibrator. De geometriske symboler angiver den gennemsnitlige ± SD af fire uafhængige differentieringer. (B) Repræsentative billeder af iNGN2-neuroner på dag 7 efter optøning (dag-2 + 7), farvet for beta-III-tubulin (TUBB3, magenta) og mikrotubulusassocieret protein 2 (MAP2, cyan). Cellekerner blev modfarvet med DAPI. Skalastænger = 100 μm. (C) Evaluering af det neuritiske netværk i brightfield-billeder af neuronale kulturer efter optøning. Den samlede længde af neuritter blev bestemt i et område på 930,82 × 698,11 μm2 ved hjælp af ImageJ (version 1.53). Efter justering af lysstyrke og kontrast blev billederne konverteret til 8-bit billeder, og farverne blev inverteret. Neuritter blev efterfølgende skeletoniseret og derefter analyseret ved hjælp af henholdsvis ImageJ-plugins 'Skeletonize' og 'Analyze Skeleton'. Den samlede længde af neuritter blev divideret med antallet af somas i interesseområdet for at give den gennemsnitlige neuritlængde / celle. Søjlediagrammer repræsenterer gennemsnittet + SD fra tre uafhængige eksperimenter. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Den ektopiske ekspression af neuronal transkriptionsfaktor NGN2 har tidligere vist sig at fremskynde tidlige stadier af neuronal differentiering og inducere neuronal afstamningsforpligtelse i hiPSC'er inden for 1 uge efter dyrkning12,13,20. Dette arbejde beskriver en detaljeret protokol til differentiering af genredigerede BIONi010-C-13 hiPSC'er i iNGN2-neuroner ved hjælp af en benchtop bioreaktor.
CERO 3D-bioreaktoren er en lavvolumenbioreaktor med fire åbninger til specialiserede rør, hver med en maksimal kapacitet på 50 ml. Temperatur- og CO2 -niveauer styres kontinuerligt, og dyrkningsparametre (f.eks. rotationshastighed og tid) reguleres for hvert rør, hvilket uafhængigt gør det muligt for brugerne at køre flere differentieringsmetoder parallelt. Integrerede bølgebrydere på den indre rørvæg muliggør en forstyrrelse af mediet med lav forskydningsspænding og opretholder 3D-aggregater i suspension under kontrolleret rotation. Begrænset adgang til næringsstoffer samt håndhævede 3D-cellecelle- og celleekstracellulære matrixinteraktioner (ECM) kan påvirke cellulær differentiering og adfærdbetydeligt 24,25,26,27.
Dyrkning af celler som 3D-aggregater i suspension øger disse celleinteraktioner og efterligner derved in vivo-miljøet i væv eller organer tættere28. Den samtidige forstyrrelse af mediet regulerer aggregatstørrelsen på grund af mekanisk friktion, forbedrer gasudvekslingen og reducerer gradienten af næringsstoffer og affald i røret, samtidig med at fysiologisk relevante gradienter bevares inde i aggregaterne 29,30,31,32,33,34. Selvom mellemstore ændringer udføres manuelt, reducerer benchtop-bioreaktoren arbejds- og driftsomkostninger sammenlignet med statiske kulturkolber. Bioreaktoren tilbyder også flere fordele i forhold til fuldautomatiske omrøringstankbioreaktorer, da pumpehjulets frie design reducerer hydrodynamisk forskydningsspænding på den samlede overflade og derved ikke kun forbedrer celleoverlevelsen, men også begrænser virkningerne af forskydningsspænding på følsomme iPSC'er, celledifferentiering og funktion35,36,37,38.
Vertikale hjulbioreaktorer, hvor celler omrøres af et stort lodret løbehjul, samt rocking motion bioreaktorer ved hjælp af oppustede kulturposer fastgjort til en motoriseret platform, repræsenterer alternative 3D-ophængningsplatforme. Selvom de er overdrevent testet til dyrkning af hiPSC'er 17,18,19,39,40, vides der kun lidt om deres anvendelighed i neuronale differentieringsmetoder, og rapporter er begrænset til den vellykkede udvidelse af pattedyrs og humane neurale forløberceller i omrøringstankbioreaktorer 41,42,43,44, med et sjældent antal undersøgelser, der fokuserer på Modning44,45. Generelt tilbyder automatiserede 3D-affjedringsplatforme fordelen ved fuldautomatiske og computerstyrede medieskift, hvilket reducerer variationer i håndtering og minimerer risikoen for kontaminering. Desuden kan næringsstofparametre som laktat og glukosekoncentration overvåges kontinuerligt. Imidlertid kræver etableringen af disse systemer ofte en betydelig initialinvestering, laboratorieplads og uddannelse af kvalificeret personale. Stationære bioreaktor repræsenterer et kompakt og brugervenligt alternativ til dyrkning af celler i suspension, men giver ikke samtidig overvågning af næringsstoffer.
Som i de fleste protokoller, der anvendes til dyrkning af celler i 3D-suspensionsplatforme, repræsenterer den indledende dannelse af aggregater et kritisk trin. hiPSC'er dyrkes som klæbende monolag og overføres derefter som enkeltcellesuspensioner til et 3D-miljø. For at minimere celletab på det tidspunkt skal flere aspekter overvejes. Designet af rørene med de integrerede wavebreakers betyder, at der kræves et minimalt dyrkningsvolumen på 10 ml pr. rør for at sikre optimal medium forstyrrelse. Den kritiske mængde bør derfor ikke underbydes på lang sigt. Desuden anbefales en startsåtæthed på 7,5 millioner celler pr. 10 ml kulturvolumen og en rotationshastighed på 60 o / min stærkt for at danne stabile aggregater på kort sigt, selvom tilpasninger kan være nødvendige afhængigt af cellelinjen.
Efter overførsel af hiPSC'er til suspension bør aggregater dannes inden for 24 timer. Den første medieændring er kritisk, da aggregaterne er små og muligvis ikke sætter sig ordentligt. Tiden for sedimentering af aggregater kan forlænges, men bør ikke overstige mere end 10 min, da aggregater kan begynde at klumpe sig sammen og vokse på en heterogen måde. Under aspiration skal der efterlades et minimalt kulturvolumen på 5 ml i røret, og forstyrrelser af mediet bør undgås. Ikke desto mindre må der forventes et tab af celler og aggregater i de indledende faser. Celletal indikerer et konstant celleudbytte i løbet af de første 2 dage i kultur, hvilket indikerer, at hiPSC'ernes høje proliferative kapacitet kompenserer for det indledende celletab. Når den er i suspension, fører den blide dyrkning og forstyrrelse til aggregater af homogen størrelse, der begynder at vokse over tid.
Neuronal differentiering blev udført i henhold til en tidligere offentliggjort protokol baseret på doxycyclin-induceret NGN2-overekspression13, og de enkelte trin blev optimeret til en 3D-dyrkning. Den neuronale transkriptionsfaktor NGN2 er en velbeskrevet driver i neuronal differentiering og accelererer neuronal induktion signifikant11,13,46. Mens konventionelt mønster med definerede vækstfaktorer tager flere uger til måneder 7,8,9, inducerer NGN2-ekspression neuronal celleskæbne inden for få dage. Ud over den forkortede dyrkningstid afhænger protokollen hverken af dyre vækstfaktorer eller belægningsmatricer til den oprindelige suspensionskultur, hvilket reducerer dyrkningsomkostningerne yderligere.
Desuden afslørede en direkte sammenligning af den NGN2-drevne generation af umodne neuroner i vedhængende kulturer og suspensionskulturer en 1,36 gange stigning i celler efter 4 dage i kultur ved hjælp af benchtop-bioreaktoren20, mens mængden af medium, der kræves til generering af 1 million celler, forventes at blive halveret. Anvendelse af benchtop bioreaktoren til generering af iNGN2 neuroner kan derfor være gavnligt, da et højere antal celler kan produceres med en lavere håndteringstid og omkostninger. I overensstemmelse med tidligere rapporter blev neuronal afstamningsforpligtelse observeret tidligt. Efter 2 dages NGN2-induktion var et dybtgående udtryk for klassiske neuronale markører såsom TUBB3, MAP2 og MAPT tydeligt, hvilket understøttede anvendeligheden af benchtop-bioreaktoren til neuronal induktion. Efter denne protokol kan ca. 6,2 millioner umodne iNGN2-neuroner opnås fra 1 million hiPSC'er inden for 4 dage efter dyrkning. Produktionskapaciteten kan dog variere på tværs af batcher og afhænge af mængden af suspensionskultur ved såning.
For at øge udbyttet yderligere blev dyrkningstiden forlænget med yderligere 3 dage; Men selvom aggregaterne blev større, blev de også meget kompakte og kunne ikke adskilles korrekt til kryopræservering eller genplettering. På trods af fremskridt inden for 3D-kulturmetoder er klæbende 2D-neuronale kulturer stadig guldstandarden for funktionelle analyser som mikroelektrodearrays eller calciumbilleddannelse. Cellesingularisering er således en vigtig forudsætning for et homogent fordelt neuronalt monolag og neuritisk netværk. Stærkere mekanisk løsrivelse af cellerne eller hårde dissociationsreagenser kan anvendes til at sikre singularisering, men alligevel med potentielle virkninger på cellelevedygtighed, fysiologi og genvedhæftningskapacitet47,48. Med hensyn til behovet for enkeltceller til yderligere analyser og modning blev aggregater dissocieret efter 4 dage i suspension, og (dag 2) iNGN2-neuronerne kryopræserverede. Post-optøning differentiering og karakterisering af iNGN2 neuroner bekræftede en stigende modenhed af neuronale kulturer og dannelsen af et tæt neuritisk netværk.
Den medfølgende protokol giver et stort antal iNGN2-neuroner. Der er dog flere begrænsninger, der skal overvejes. Som for de fleste suspensionskulturplatforme er overførslen af hiPSC'er fra en 2D-klæbende kultur til et 3D-miljø kritisk og ofte forbundet med et dybtgående celletab. Yderligere betydeligt celle- og aggregattab forventes under medieændringer. Sammenlignet med automatiserede platforme øges håndteringstiden og kontamineringsrisikoen ved hjælp af benchtop-bioreaktoren, da medieskift skal udføres manuelt. Bortset fra manglen på automatisering giver benchtop-bioreaktoren ikke mulighed for at overvåge næringsstofferne, og den maksimale kapacitet på 50 ml pr. rør begrænser protokollens opskaleringspotentiale. Endelig er det vigtigt at bemærke, at selvom NGN2 fremskynder neuronal afstamningsforpligtelse, forkortes varigheden af terminal modning ikke og kræver stadig langvarig kultur over flere uger. I betragtning af vigtigheden af astrocytisk støtte til neuronal funktion, tilknytning og overlevelse 49,50,51 bør co-kulturmetoder overvejes og kan endda være afgørende for langsigtet dyrkning.
Sammenfattende blev en 2D-differentieringsprotokol med succes oversat til et 3D-miljø til hurtig og reproducerbar generering af iNGN2-neuroner ved at implementere en benchtop bioreaktor. Den beskrevne protokol giver store mængder iPSC-afledte neuroner af god kvalitet, som kan tjene som udgangspunkt for kompleks modeltestning, lægemiddelscreeninger med høj kapacitet og toksicitetsanalyser i stor skala.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
EBiSC2-projektet har modtaget støtte fra fællesforetagendet for initiativet om innovative lægemidler 2 (JU) i henhold til tilskudsaftale nr. 821362. Fællesforetagendet modtager støtte fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram og EFPIA. Vi takker Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters og Vanessa M. Nalewaja for deres hjælp med immuncytokemiske analyser og genekspressionsanalyser samt Heike Arthen for hendes fremragende tekniske support. Desuden takker vi Stephanie Bur for etableringen af bioreaktorprogrammet. Figur 2A blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
| 60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
| Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
| BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
| Biorender | Biorender.com | ||
| BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
| CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
| CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
| Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
| CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
| Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
| DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
| Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
| DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
| ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
| MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
| Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
| mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
| Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
| Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
| NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
| Origin 2021 | OriginLab | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
| Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
| RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
| Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
| StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
| TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
| Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
| X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
| Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |
References
- Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
- Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
- Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review. , Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016).
- van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
- van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
- Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
- Shih, P. -Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
- Chang, C. -Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
- Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
- Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
- Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
- Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
- Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
- Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
- User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC. , Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023).
- Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
- Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
- Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
- Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
- Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
- Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
- Liu, N., Zang, R., Yang, S. -T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
- Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
- Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
- Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
- Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
- Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
- Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
- Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
- Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
- Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
- Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
- Allen, N. J.
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L.
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).
