Summary
Denna artikel beskriver ett protokoll för generering av humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda neuroner i en bänkskiva 3D-suspensionsbioreaktor.
Abstract
Härledningen av neuronala härstamningsceller från humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) markerade en milstolpe i hjärnforskningen. Sedan deras första tillkomst har protokoll kontinuerligt optimerats och används nu i stor utsträckning inom forskning och läkemedelsutveckling. Den mycket långa varaktigheten av dessa konventionella differentierings- och mognadsprotokoll och den ökande efterfrågan på högkvalitativa hiPSC och deras neurala derivat ökar dock behovet av att anta, optimera och standardisera dessa protokoll till storskalig produktion. Detta arbete presenterar ett snabbt och effektivt protokoll för differentiering av genetiskt modifierade, doxycyklininducerbara neurogenin 2 (iNGN2)-uttryckande hiPSC till neuroner med användning av en bänkskiva tredimensionell (3D) suspension bioreaktor.
I korthet tilläts encellssuspensioner av iNGN2-hiPSC bilda aggregat inom 24 timmar, och neuronalt härstamningsengagemang inducerades genom tillsats av doxycyklin. Aggregat dissocierades efter 2 dagars induktion och cellerna frystes antingen eller ompläterades för terminal mognad. De genererade iNGN2-neuronerna uttryckte klassiska neuronala markörer tidigt och bildade komplexa neuritiska nätverk inom 1 vecka efter omplätering, vilket indikerar en ökande mognad av neuronala kulturer. Sammanfattningsvis tillhandahålls ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för snabb generering av hiPSC-härledda neuroner i en 3D-miljö som har stor potential som utgångspunkt för sjukdomsmodellering, fenotypiska läkemedelsscreeningar med hög genomströmning och storskalig toxicitetstestning.
Introduction
Neurologiska störningar är den främsta orsaken till funktionshinder över hela världen1. En av sex personer drabbas, och förekomsten fortsätter att öka. Den ekonomiska bördan för samhällen och deras hälso- och sjukvårdssystem är enorm. I en utvärdering av 30 europeiska länder 2010 uppskattades årliga kostnader på 800 miljarder euro för psykiska och neurologiska störningar2. Den ökande samhällsekonomiska bördan kräver effektiva behandlingsstrategier, och även om vår förståelse för sjukdomspatofysiologi har ökat kraftigt är översättningen till kliniker ofta otillräcklig. I allmänhet går endast 12 % av läkemedlen in i kliniska prövningar, varav mer än 80 % misslyckas under senare skeden, främst på grund av ineffektivitet eller oförutsedd toxicitet 3,4. Orsakerna varierar, men den begränsade överförbarheten från djurförsök i prekliniska stadier till försök på människor har i allt högre grad aktualiserats5. Humana in vitro-cell- och vävnadsmodeller kan överbrygga klyftan mellan arttranslation, och framsteg inom humaninducerad pluripotent stamcellsteknik (hiPSC) har stor potential i detta avseende. hiPSC används i stor utsträckning inom grundforskning och delar väsentliga egenskaper med embryonala stamceller (hESC), såsom en nästan obegränsad självförnyelsekapacitet och förmågan att differentiera till alla tre könsskikt6, samtidigt som man kringgår etiska problem i samband med embryoförstöring.
Härledningen av neuronala celler från hESC, och senare hiPSCs, markerade en milstolpe i hjärnforskningen. Initiala differentieringsprotokoll baserades på tillämpningen av tillväxtfaktorer som efterliknar kritiska steg under embryogenesen, de flesta av dem involverade dubbel SMAD-hämning antingen i suspension eller vidhäftande kulturer 7,8,9. Mogna neuroner har framgångsrikt genererats, men flera nackdelar med dessa protokoll hindrar fortfarande deras breda användning i läkemedelsutveckling, såsom det låga utbytet och den höga batch-till-batch-variationen hos genererade neuroner, liksom den omfattande arbetsbelastningen relaterad till långa odlingstider. Förbättringar har uppnåtts genom forcerat uttryck av transkriptionsfaktorer som är kritiskt involverade i neurogenes, och medlemmar av neurogeninfamiljen (NGN), särskilt NGN2, har identifierats som effektiva drivkrafter10. Det lentiviralmedierade ektopiska uttrycket av NGN2 i hiPSC accelererade tidiga stadier av neuronal differentiering signifikant och inducerade neuronalt cellöde inom endast 1 vecka11. Efterföljande terminal mognad i samkulturer med astrocyter gav funktionella neuroner i hög renhet och kvantitet med reproducerbara egenskaper. Platsstyrd genredigering av den adenoassocierade virusintegrationsplatsen 1 (AAVS1) safe-harbor-locus applicerades sedan för att skapa hiPSC-linjer med en stabil och doxycyklininducerbar expressionskassett för NGN212,13, vilket minimerar oönskade biverkningar av lentiviral leverans.
Den robusta och effektiva differentieringen av doxycyklininducerbara neurogenin 2 (iNGN2) neuroner har stor potential för fenotypiska läkemedelsscreeningar och toxicitetsanalyser10,14,15; och betydande framsteg inom bioprocessing har gjorts under det senaste decenniet och implementerat bioreaktorer för en skalbar cellexpansion och differentiering16,17,18,19. Majoriteten av differentieringsprotokollen är dock optimerade för vidhäftande kulturer, och översättning till en tredimensionell (3D) miljö kräver ofta väsentliga modifieringar. Nyligen har framgångsrik användning av en bänkskiva 3D-bioreaktor med reducerade skjuvspänningsfunktioner rapporterats för expansion av hiPSC och för reproducerbar differentiering till hepatocyter, kardiomyocyter och neuroner20. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för generering och karakterisering av iNGN2-neuroner med användning av den identiska bänkskivan 3D-bioreaktorn.
Protocol
OBS: Alla cellmanipulationer, såväl som odlingsrätter och medelberedningar, bör utföras under sterila förhållanden. Den laminära flödeshuven ska rengöras noggrant före användning och efter bearbetning genom att torka av alla ytor med 70% etanol. Det beskrivna protokollet är optimerat för neuronala differentieringar i en CERO 3D-inkubator och bioreaktor (nedan kallad benchtop bioreaktor). Denna bänkbioreaktor erbjuder fyra slitsar för specialiserade bioreaktorrör, var och en med en maximal kapacitet på 50 ml. Temperatur- och CO2-nivåer kontrolleras kontinuerligt och odlingsparametrar (t.ex. rotationshastighet och tid) regleras för varje rör oberoende. Alla aspirationssteg har utförts med aspirationspipett och vakuumpump, om inte annat anges.
1. Odling och utvidgning av hiPSC
OBS: Den konstruerade doxycyklininducerbara NGN2 hiPSC-linjen BIONi010-C-13 används i detta protokoll. Expansionsprotokollet som tillhandahålls här är optimerat för 6 cm petriskålar, men alternativa kulturformat kan användas om så önskas.
- Täck 6 cm petriskålar med basalmembranmatris utspädd i kallt Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM)/F12 (-/-) vid en slutlig koncentration av 0,083 mg/ml/10 cm2. Inkubera de överdragna faten vid 37 °C i minst 30 minuter.
OBS: Ett detaljerat protokoll för beredning av basalmembranmatrislösning finns i tillverkarens instruktioner. hiPSC kan odlas på alternativa extracellulära matriser för expansion. - Tina kryokonserverade hiPSC enligt EBiSC Cell Line User Protocol21 i matarfritt iPSC-underhållsmedium + 10 μM ROCK-hämmare (Y-27632). En sådddensitet på 1 × 106 livskraftiga celler per 60 mm maträtt rekommenderas.
- Byt mediet nästa dag till matarfritt iPSC-underhållsmedium utan ROCK-hämmare och utför dagliga medieändringar.
- Börja passera när hiPSC-kulturerna når ett sammanflöde på 60% -80%. Kontrollera om det finns differentierade områden och rengör kolonierna manuellt om området överstiger 5%.
OBS: Odifferentierade hiPSC visas som runda celler med en framträdande nukleolus och mindre cytoplasma. Plana och tätt packade kolonier bildas tidigt efter upptining eller passering. Exempel på ljusfältsbilder av hiPSC-kulturer visas i figur 1. Mer information finns i EBiSC Cell Line User Protocol21. För passering, förbered matrisbelagda diskar med basalmembran och matarfritt iPSC-underhållsmedium. - Aspirera mediet från hiPSC-kulturer och skölj cellerna 2x med 0,5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) utan Ca 2+ och Mg2+ (DPS [-/-], se materialtabell).
- Ta bort supernatanten och tillsätt 2 ml 0,5 mM EDTA i 1x DPBS (-/-) till 6 cm petriskålarna. Inkubera cellerna vid 37 °C i 3 minuter i inkubatorn.
- Aspirera 1,5 ml av EDTA-lösningen och fortsätt inkubationen i 3-5 minuter.
- Knacka försiktigt på diskarna för att underlätta cellavlossning.
OBS: Kontrollera frigöring genom visuell bedömning. hiPSC-kolonier bör börja lossna efter 5 minuter, men en längre inkubationstid kan krävas med högre konfluenta hiPSC-kulturer. Om kolonierna inte lossnar, öka inkubationstiden till 10 minuter, men överskrid inte denna tidsram. - Tillsätt 5 ml matarfritt iPSC-underhållsmedium till de 6 cm petriskålarna och suspendera försiktigt kolonierna 2x med en 10 ml serologisk pipett eller genom att använda pipettspetsar med bred borrning. Överför cellerna till ett 15 ml rör.
OBS: hiPSC är mycket känsliga för mekanisk påfrestning; Därför bör flera återsuspenderingar undvikas. Den slutliga cellsuspensionen bör bestå av små kolonifragment (50-200 μm). - Aspirera supernatanten från de belagda odlingsskålarna och förbered 4 ml matarfritt iPSC-underhållsmedium per 6 cm skål.
- Överför små kolonifragment till de nyberedda odlingsrätterna i delade förhållanden mellan 1:10 och 1:40 och odla vid 37 ° C och 5% CO2 med dagliga medieförändringar.
OBS: Små kolonier bör fästa inom 1 eller 2 h efter passering.
Figur 1: Morfologi hos humant inducerade pluripotenta stamcellskulturer . (A,B) HiPSC-kulturer av god kvalitet med olika sammanflöde som visar komprimerade hiPSC-kolonier med homogen morfologi och definierade kanter. (C) hiPSC-kultur med framväxande kluster av differentierade celler runt kolonikanterna (streckad vit linje). Skalstapel = 200 μm. Förkortning: hiPSC = human induced pluripotent stem cell. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Förodling av hiPSC i bioreaktorsystemet för bänkskivor (dag-2)
OBS: Börja förodling när hiPSC-kulturerna når ett sammanflöde mellan 60% och 80%. Kontrollera hiPSC-kolonierna för differentierade områden. Under denna förodlingsfas hålls hiPSC i matarfritt iPSC-underhållsmedium i 2 dagar.
- Bered odlingsmediet, bestående av ett matarfritt iPSC-underhållsmedium och 10 μM ROCK-hämmare (Y-27632).
- Aspirera mediet helt från hiPSCs och skölj försiktigt cellerna med 1x DPBS (-/-) två gånger.
- Tillsätt 2,0 ml förvärmd trypsin-EDTA-lösning till de 6 cm petriskålarna och inkubera cellerna i 3 minuter vid 37 °C i inkubatorn.
- Knacka försiktigt på diskarna för att underlätta cellavlossning, eller inkubera i 1-2 minuter längre.
- Resuspendera cellerna i 5 ml matarfritt iPSC-underhållsmedium + ROCK-hämmare per maträtt. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml eller 50 ml rör och blanda försiktigt genom pipettering för att säkerställa cellsingularisering.
- Bestäm cellnumren i 100 μL cellsuspension med hjälp av en automatiserad cellräknare som tidigare beskrivits20. Överför motsvarande volym för 15 × 106 celler per bioreaktorrör till ett 50 ml rör.
- Centrifugera cellerna vid 300 × g i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 2 ml matarfritt iPSC-underhållsmedium + ROCK-hämmare.
- Fyll varje 50 ml rör med 18 ml medium (cellsådddensitet på 0,75 × 106 celler / ml). Fördela cellsuspensionen i bioreaktorrören (20 ml per rör).
- Placera rören i bioreaktorsystemet. Ställ in följande odlingsparametrar: 2 s rotationsperiod, 60 rpm rotationshastighet, ingen omrörningspaus, 37 ° C och 5% CO2 under obegränsad tid20.
- Starta odlingsprogrammet via bioreaktorns display.
- Byt media nästa dag. Låt aggregaten slå sig ner i bioreaktorrören i ~5 min. Aspirera försiktigt supernatanten.
OBS: Låt inte ballasten slå sig ner längre än 10 minuter, eftersom de kan fastna vid varandra och bygga en heterogen ballastsuspension. Det rekommenderas att lämna ~ 5 ml odlingsmedium i bioreaktorröret. - Tillsätt 15 ml färskt matarfritt iPSC-underhållsmedium utan ROCK-hämmare per rör och fortsätt odlingen i bänkbioreaktorn i 24 timmar.
3. Differentiering av hiPSC till tidiga neuroner (dag 0)
- Förbered neurobasalt medium (NBM): 50% DMEM / F-12 med stabiliserad L-alanyl-L-glutamindipeptid, 50% neurobasalmedium, 0,5x serumfritt tillskott (50x), 0,5x serumfritt tillskott baserat på Bottensteins N-1-formulering (100x), 0,5x stabiliserad L-alanyl-L-glutamindipeptid, 0,5x MEM icke-essentiell aminosyralösning (100x), 500 nM natriumpyruvat (100 mM), 50 nM 2-merkaptoetanol (50 mM), 0,025% human insulinlösning och 5 U / ml penicillin-streptomycin.
OBS: NBM måste förvaras vid 4 °C och kan användas i upp till 2 veckor. - Starta neuronal differentiering genom att tillsätta doxycyklin (DOX) till hiPSC-kulturerna. För detta, låt aggregaten slå sig ner i bioreaktorrören. Aspirera försiktigt supernatanten från cellerna, lämna ~ 5 ml i röret och tillsätt 35 ml neuralt induktionsmedium (NIM) bestående av NBM och 2 μg / ml DOX.
OBS: Eftersom DOX är ljuskänslig rekommenderas att stänga av ljuset medan du arbetar. - Sätt tillbaka rören i bänkbioreaktorn och fortsätt odlingen.
- Utför medieändringar varje dag i 2 dagar, enligt beskrivningen i steg 3.2.
OBS: Efter 4 dagar i suspensionskultur kan aggregaten dissocieras och tidiga neuroner kryokonserveras eller direkt ompläteras för terminal mognad.
4. Kryokonservering av tidiga neuroner (dag 2)
OBS: Kryokonservering krävs inte och är inte kritisk för differentieringsprocessen, men rekommenderas starkt eftersom stora lager av tidiga neuroner kan produceras och lagras för efterföljande mognad och analyser.
- Låt aggregaten slå sig ner i bioreaktorröret. Aspirera supernatanten enligt tidigare beskrivet.
- Överför aggregaten till ett sterilt 15 ml eller 50 ml rör och skölj försiktigt aggregaten 2x med 1x DPBS (-/-). Aspirera försiktigt supernatanten så mycket som möjligt utan att störa aggregaten.
- Tillsätt 2-5 ml förvärmt celldissociationsenzym, beroende på pelletsstorlek, och inkubera cellerna i cirka 10 minuter vid 37 °C i ett vattenbad. Resuspendera försiktigt de sedimenterade ballasten var 2:e minut tills ballasten dissocierar.
OBS: En nästan homogen cellsuspension bör erhållas efter 7-10 min inkubation. - Tillsätt den tredubbla volymen av förvärmt NBM-medium och suspendera cellerna försiktigt för att säkerställa cellsingularisering.
- Bestäm cellnumren och överför motsvarande volym för kryokonservering till ett 15 ml eller 50 ml rör.
OBS: En celldensitet på 5-10 × 106 celler/ml frysmedium rekommenderas. - Centrifugera cellerna vid 300 × g i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera försiktigt cellpelleten i motsvarande volym frysmedium innehållande 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Alikvot cellsuspensionen i lämpliga injektionsflaskor för kryokonservering (1 ml/injektionsflaska).
- Överför injektionsflaskorna omedelbart till en förkyld, långsam frysbehållare fylld med 2-propanol och placera behållaren vid -80 °C över natten. Placera injektionsflaskorna vid -150 °C nästa dag för långtidsförvaring.
OBS: Vätskan 2-Propanol är mycket brandfarlig och kan orsaka ögonskador vid kontakt. Håll dig borta från värme och använd skyddshandskar och glasögon.
5. Mognad av hiPSC-härledda neuroner i monolagerkulturer
- Förbered poly-L-ornitin / lamininbelagda odlingsrätter för långsiktig odling av hiPSC-härledda neuroner.
- Späd stamlösningen av poly-L-ornitin till 0,001 % i 1x DPBS (-/-) och täck disken över natten vid 4 °C eller 4 timmar vid 37 °C. Aspirera poly-L-ornitinlösningen och tvätta plattorna en gång med 1x DPBS (-/-).
- Späd lamininlösningen i 1x DPBS (-/-) till en slutlig koncentration på 10 μg/ml och inkubera disken över natten vid 4 °C, eller i 4 timmar vid 37 °C.
OBS: En volym på 0,1-0,15 ml per cm 2 rekommenderas för beläggningsprocedurerna och 0,2 ml per cm2 för alla respektive tvättsteg. Alternativa beläggningssubstrat kan användas, men potentiella effekter på cellbindning och mognad bör utvärderas.
- Tina de kryokonserverade cellerna. För detta, placera kryovialen i ett vattenbad (inställt på 37 ° C) och snurra det i cirka 1 minut tills en liten klump av frusen cellsuspension är kvar.
- Överför försiktigt cellsuspensionen droppvis till ett 15 ml rör berett med 10 ml förvärmd NBM. Skölj kryovialen med 1 ml NBM och överför cellsuspensionen till samma 15 ml rör.
- Centrifugera cellerna vid 300 × g i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 1-2 ml NIM kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare.
- Resuspendera cellpelleten försiktigt och bestäm cellnumren.
- Aspirera den återstående lamininlösningen från de belagda cellodlingsskålarna och frö cellerna vid en sådddensitet av 1 × 105 celler/cm2 i NIM kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare.
- Byt mediet efter 24 timmar till NIM utan ROCK-hämmare.
- Utför dagliga medelförändringar i 4 dagar.
- Efter denna inledande fas av NGN2-induktion, utelämna DOX och odla cellerna i NBM, med halvmediaförändringar 2x i veckan tills de når önskat mognadsstadium.
Samodling av iNGN2-neuroner med astrocyter rekommenderas för att öka cellöverlevnad, bindning, mognad och elektrisk aktivitet13,22.
6. Karakterisering av hiPSC-härledda neuroner
OBS: Differentiering till neuronala derivat kan utvärderas med följande tekniker.
- Immunocytokemi och avbildning
- Aspirera mediet från hiPSC-härledda neuroner och tvätta cellerna en gång med 1x DPBS med Ca 2+ och Mg2+ (+/+).
OBS: Pipettera försiktigt, helst på brunnskanter eftersom celler kan lossna mycket lätt från ytan. En volym på 0,2 ml per cm2 rekommenderas för alla tvättsteg för att säkerställa en fullständig täckning av celler med 1x DPBS (+/+). - Fixera neuroncellerna med en fixeringslösning innehållande 4% paraformaldehyd i DPBS (+/+) i 15 minuter vid rumstemperatur (RT). En volym på 0,1 ml per cm2 rekommenderas.
Paraformaldehyd (4%) i DPBS är en farlig och hudirriterande lösning med akut toxicitet och potentiell cancerogenicitet. Håll dig borta från värme, använd skyddshandskar och glasögon, undvik inandning och använd lösningen endast i en ventilerad miljö. - Skölj försiktigt cellerna 2x i 1x DPBS (+/+) och fortsätt med färgning.
OBS: Fasta celler kan lagras i DPBS (+/+) vid 4 °C i upp till 1 månad tills vidare bearbetning. - Aspirera DPBS (+/+) från prover. Permeabilisera cellerna och blockera icke-specifika bindningsställen med 1x DPBS (+/+) innehållande 1% BSA och 0,2% Triton-X-100 i 60 minuter vid RT.
OBS: En volym på 0,2 ml per cm2 rekommenderas. - Avlägsna supernatanten och inkubera cellerna över natten vid 4 °C, med respektive primära antikroppar utspädda i färgningsbuffert (1x DPBS [+/+] innehållande 1 % BSA) (se Materialförteckning). Se till att cellerna är helt täckta av lösning.
OBS: En volym på 0,1-0,15 ml per cm2 rekommenderas. - Aspirera färgningsbufferten och skölj cellerna 3x i 1x DPBS (+/+).
- Späd motsvarande sekundära antikroppar (se materialtabell) i färgningsbuffert vid en slutlig koncentration på 1:1 000.
- Inkubera cellerna i utspädd antikroppslösning i 1 timme vid RT i mörker. Se till att cellerna är helt täckta av lösning.
OBS: En volym på 0,1-0,15 ml per cm2 rekommenderas. - Aspirera den sekundära antikroppslösningen och skölj cellerna 2x i 1x DPBS (+/+).
- Motfärga kärnorna med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), utspädd i DPBS (+/+) i 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: En arbetsvolym på 0,1-0,15 ml per cm2 rekommenderas. - Skölj cellerna 2x i 1x DPBS (+/+).
- Förvara cellerna i DPBS (+/+) vid 4 °C tills avbildning.
OBS: Brightfield imaging är lämplig för att spåra morfologiska förändringar och neurit utväxt. Dessutom kan stereotypt marköruttryck bedömas genom fluorescensmikroskopi. Medan odifferentierade hiPSC uttrycker OCT 3/4 och NANOG, kan beta-III-tubulin (TUBB3) och mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2) fungera som neuronala markörer för visualisering av neuriter och axoner. Det neuritiska nätverket kan utvärderas ytterligare genom att bestämma neuritlängden i ljusfält eller fluorescerande bilder.
- Aspirera mediet från hiPSC-härledda neuroner och tvätta cellerna en gång med 1x DPBS med Ca 2+ och Mg2+ (+/+).
- Genuttrycksanalyser genom kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qPCR)
- Aspirera mediet och skölj cellerna en gång i 1x DPBS (-/-).
OBS: En volym på 0,2 ml per cm2 rekommenderas. - Tillsätt kall RNA-lysbuffert och skörda cellerna genom att skrapa.
- Isolera RNA med hjälp av ett lämpligt kolonnbaserat kit och bestäm RNA-koncentrationerna med UV-fotospektrometri.
- Generera cDNA med 250 ng totalt RNA och ett lämpligt kit för omvänd transkription.
- Förbered molekylära beacon qPCR-reaktioner innehållande 2,5 ng cDNA i duplikat. Använd en lämplig mastermix och motsvarande primeranalyser20 (se Materialförteckning).
- Kör qPCR genom att applicera 45 cykler med primerglödgning vid 60 °C i 20 s.
- Normalisera relativa genuttrycksnivåer till medelvärdet av hushållsgenerna GAPDH, HPRT1 och GUSB. Tillämpa ΔΔCt-metod23 med odifferentierade hiPSC som kalibrator.
- Aspirera mediet och skölj cellerna en gång i 1x DPBS (-/-).
Representative Results
Under de inledande stegen lossas vidhäftande kulturer av hiPSC, singulariseras och överförs till suspension (figur 2). Aggregat bildas inom 24 timmar och växer kontinuerligt i storlek. Efter 2 dagars transgeninduktion kan tidiga neuroner kryokonserveras för efterföljande experiment.
Den ihållande proliferationen under de första dagarna i suspension ger en ökning av cellantalet och når sin topp efter 2 dagars induktion (figur 3A,B). Tillsammans med spridningen börjar aggregat växa. Jämfört med dag 0 visar diametern en ökning med 50% vid dag 2 och nästan fördubblas vid dag 5 (figur 3D). Även om en ökande diameter begränsar näringstillförseln inuti aggregaten, påverkas inte cellernas livskraft vid dag 2 eller vid dag 5 av differentiering (figur 3C). En långvarig odling i mer än 4 dagar i suspension förbättrar emellertid inte cellutbytet ytterligare, eftersom aggregaten blir alltmer resistenta mot enzymatisk singularisering (figur 3B).
Vid kryokonservering tinas dag 2-celler och pläteras på poly-L-ornitin (PLO)-lamininbelagda rätter för terminal mognad. I allmänhet fäster celler mycket bra efter upptining och börjar förlänga neuriter tidigt. Den temporala genuttrycksprofilen, liksom immunocytokemisk färgning för neuronmarkörerna TUBB3 och MAP2, bekräftar neuronal cellidentitet (figur 4A, B). Förutom stigande nivåer av TUBB3 och MAP2 anrikas neuronala kulturer i mikrotubuliassocierade proteintautranskript (MAPT), som kodar för ett neuronalt protein involverat i axonstabilisering och visar en samtidig nedgång i uttrycket av den pluripotensreglerande transkriptionsfaktorn POU5F1. Dessutom bildas ett tätt neuritiskt nätverk inom den första veckan efter upptining (figur 4C). Dessa morfologiska förändringar, i kombination med transkriptionsprofilen, tyder på en ökande mognad av neuronkulturerna.
Figur 2: Generering av hiPSC-härledda iNGN2-neuroner med användning av en bänkbioreaktor. (A) Schematisk översikt över differentieringsparadigmet, som belyser de viktigaste stegen i cellodling. (B-F) Brightfield-bilder visualiserar (B) hiPSC och (C, D) bildandet av aggregat i bioreaktorn. (E,F) iNGN2-neuroner förlänger neuriterna och genomgår morfologiska förändringar under differentiering. Skalstång = 100 μm. Förkortningar: BMM = basalmembranmatris; iPSC-MM = iPSC-underhållsmedium; PLO = poly-L-ornitin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellutbyte och livskraft under aggregatbildning och tillväxt. (A) Brightfield-bilder visar bildandet av aggregat inom 2 dagar efter odling i bänkbioreaktorn, liksom ökningen av aggregatstorleken över tiden. Skalstapel = 500 μm. (B) Kvantifiering av cellutbytet och (C) viabilitet över differentieringsförloppet. Stapeldiagram representerar medelvärdet + SD från fyra oberoende experiment. (D) Diametern, som indikerar storleken på aggregat, bestämdes halvautomatiskt med hjälp av programvaran ImageJ med öppen källkod (version 1.53). Först konverterades ljusfältsbilder till binära bilder och utvärderades sedan ytterligare med hjälp av verktyget analysera partiklar med tillämpning av följande parametrar: storlek > 2 500 μm2, cirkularitet 0,45-1, exkludera kanter och inkludera hål. Horisontella linjer anger medelvärdet ± SD för fem oberoende differentieringar. Enstaka punkter representerar medelvärdet av enskilda differentieringsexperiment med minst 20 aggregat per tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Karakterisering av hiPSC-härledda iNGN2-neuroner. Temporal genuttrycksprofil för neurongenerna TUBB3, MAP2 och MAPT, samt den pluripotenta stamcellsassocierade genen POU5F1. Relativa uttrycksnivåer normaliserades till referensgenerna GAPDH, HPRT1 och GUSB. Odifferentierade hiPSC (dag-2) valdes som kalibrator. De geometriska symbolerna anger medelvärdet ± SD för fyra oberoende differentieringar. (B) Representativa bilder av iNGN2-neuroner vid dag 7 efter upptining (dag-2 + 7), färgade för beta-III-tubulin (TUBB3, magenta) och mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2, cyan). Cellkärnor motfärgades med DAPI. Skalstreck = 100 μm. (C) Utvärdering av det neuritiska nätverket i ljusfältsbilder av neuronala kulturer efter upptining. Den totala längden av neuriter bestämdes i ett område av 930,82 × 698,11 μm2 med användning av ImageJ (version 1,53). Efter justering av ljusstyrka och kontrast konverterades bilderna till 8-bitars bilder och färgerna inverterades. Neuriter skelettiserades därefter och analyserades sedan med hjälp av ImageJ-pluginsna 'Skeletonize' respektive 'Analyze Skeleton'. Den totala längden av neuriter dividerades med antalet somas i regionen av intresse för att ge den genomsnittliga neuritlängden/cellen. Stapeldiagram representerar medelvärdet + SD från tre oberoende experiment. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Det ektopiska uttrycket av den neuronala transkriptionsfaktorn NGN2 har tidigare visat sig påskynda tidiga stadier av neuronal differentiering och inducera neuronalt härstamningsengagemang i hiPSC inom 1 vecka efter odling12,13,20. Detta arbete beskriver ett detaljerat protokoll för differentiering av genredigerade BIONi010-C-13 hiPSCs till iNGN2-neuroner med hjälp av en bänkbioreaktor.
CERO 3D-bioreaktorn är en lågvolymbioreaktor med fyra slitsar för specialrör, var och en med en maximal kapacitet på 50 ml. Temperatur- och CO2-nivåerna kontrolleras kontinuerligt och odlingsparametrar (t.ex. rotationshastighet och tid) regleras för varje rör, vilket gör det möjligt för användare att köra flera differentieringsmetoder parallellt. Integrerade vågbrytare på den inre rörväggen möjliggör en störning av mediet med låg skjuvspänning och håller 3D-aggregat i suspension under kontrollerad rotation. Begränsad tillgång till näringsämnen, såväl som påtvingade 3D-cell-cell och cell-extracellulär matris (ECM) interaktioner, kan signifikant påverka celldifferentiering och beteende24,25,26,27.
Odling av celler som 3D-aggregat i suspension ökar dessa cellinteraktioner och efterliknar därmed in vivo-miljön i vävnad eller organ närmare28. Den samtidiga störningen av mediet reglerar aggregatstorleken på grund av mekanisk friktion, förbättrar gasutbytet och minskar gradienten av näringsämnen och avfall i röret, samtidigt som fysiologiska relevanta gradienter bevaras inuti aggregaten 29,30,31,32,33,34. Även om medelbyten utförs manuellt minskar bänkbioreaktorn arbets- och driftskostnaderna jämfört med statiska odlingskolvar. Bioreaktorn erbjuder också flera fördelar jämfört med helautomatiska bioreaktorer med omrörningstank, eftersom den pumphjulsfria konstruktionen minskar den hydrodynamiska skjuvspänningen vid aggregatytan, vilket inte bara förbättrar cellöverlevnaden utan också begränsar effekterna av skjuvspänning på känsliga iPSC, celldifferentiering och funktion35,36,37,38.
Vertikala hjulbioreaktorer, där celler omrörs av ett stort vertikalt pumphjul, liksom gungande rörelsebioreaktorer med uppblåsta odlingspåsar fästa vid en motoriserad plattform, representerar alternativa 3D-upphängningsplattformar. Även om de testats överdrivet för odling av hiPSC 17,18,19,39,40, är lite känt om deras tillämplighet i neuronala differentieringsmetoder, och rapporterna är begränsade till den framgångsrika expansionen av däggdjur och humana neurala prekursorceller i omrörningsbioreaktorer41,42,43,44, med ett sällsynt antal studier som fokuserar på mognad44,45. I allmänhet erbjuder automatiserade 3D-upphängningsplattformar fördelen med helautomatiska och datorstyrda medeländringar, vilket minskar variationer i hanteringen och minimerar risken för kontaminering. Dessutom kan näringsparametrar som laktat och glukoskoncentration övervakas kontinuerligt. Inrättandet av dessa system kräver dock ofta en betydande initial investering, laboratorieutrymme och utbildning av kvalificerad personal. Bänkbioreaktorn representerar ett kompakt och lättanvänt alternativ för odling av celler i suspension, men ger inte samtidig övervakning av näringsämnen.
Som i de flesta protokoll som används för odling av celler i 3D-suspensionsplattformar representerar den initiala bildningen av aggregat ett kritiskt steg. hiPSC odlas som vidhäftande monolager och överförs därefter som encellssuspensioner till en 3D-miljö. För att minimera cellförlust i det skedet måste flera aspekter beaktas. Utformningen av rören med de integrerade vågbrytarna innebär att en minimal odlingsvolym på 10 ml per rör krävs för att säkerställa optimal mediumstörning. Den kritiska volymen bör därför inte underskridas på lång sikt. Dessutom rekommenderas en startsådddensitet på 7,5 miljoner celler per 10 ml odlingsvolym och en rotationshastighet på 60 rpm för att bilda stabila aggregat på kort sikt, även om anpassningar kan vara nödvändiga beroende på cellinjen.
Efter överföring av hiPSC till suspension bör aggregat bildas inom 24 timmar. Den första medieförändringen är kritisk, eftersom aggregaten är små och kanske inte sätter sig ordentligt. Tiden för sedimentering av ballast kan förlängas men bör inte överstiga mer än 10 minuter, eftersom ballast kan börja klumpa ihop sig och växa på ett heterogent sätt. Under aspiration bör en minimal odlingsvolym på 5 ml lämnas i röret, och eventuella störningar av mediet bör undvikas. Icke desto mindre kan en förlust av celler och aggregat förväntas under de inledande faserna. Celltal indikerar ett konstant cellutbyte under de första 2 dagarna i odling, vilket indikerar att hiPSCs höga proliferativa kapacitet kompenserar för den initiala cellförlusten. En gång i suspension leder den mjuka odlingen och störningen till homogent stora aggregat som börjar växa över tiden.
Neuronal differentiering utfördes enligt ett tidigare publicerat protokoll baserat på doxycyklininducerat NGN2-överuttryck13, och de enskilda stegen optimerades för en 3D-odling. Den neuronala transkriptionsfaktorn NGN2 är en väl beskriven drivkraft vid neuronal differentiering och accelererar neuronal induktion signifikant11,13,46. Medan konventionell mönstring med definierade tillväxtfaktorer tar flera veckor till månader 7,8,9, inducerar NGN2-uttryck neuronalt cellöde inom några dagar. Förutom den förkortade odlingstiden beror protokollet varken på dyra tillväxtfaktorer eller beläggningsmatriser för den initiala suspensionskulturen, vilket minskar odlingskostnaderna ytterligare.
Dessutom avslöjade en direkt jämförelse av den NGN2-drivna generationen av omogna neuroner i vidhäftande och suspensionskulturer en 1,36-faldig ökning av celler efter 4 dagar i odling med användning avbänkbioreaktorn 20, medan volymen medium som krävs för generering av 1 miljon celler förväntas halveras. Att använda bänkbioreaktorn för generering av iNGN2-neuroner kan därför vara fördelaktigt, eftersom ett högre antal celler kan produceras med lägre hanteringstid och kostnad. I linje med tidigare rapporter observerades neuronalt härstamningsengagemang tidigt. Efter 2 dagars NGN2-induktion var ett djupt uttryck av klassiska neuronala markörer såsom TUBB3, MAP2 och MAPT uppenbart, vilket stödde användbarheten av bänkbioreaktorn för neuronal induktion. Efter detta protokoll kan cirka 6,2 miljoner omogna iNGN2-neuroner erhållas från 1 miljon hiPSC inom 4 dagar efter odling. Produktionskapaciteten kan dock variera mellan olika partier och beror på suspensionskulturens volym vid sådd.
För att öka avkastningen ytterligare förlängdes odlingstiden med ytterligare 3 dagar; Men även om aggregaten blev större blev de också mycket kompakta och kunde inte ordentligt dissocieras för kryokonservering eller omplätering. Trots framsteg inom 3D-odlingsmetoder är vidhäftande 2D-neuronkulturer fortfarande guldstandarden för funktionella analyser som mikroelektroduppsättningar eller kalciumavbildning. Cellsingularisering är således en viktig förutsättning för ett homogent fördelat neuronalt monolager och neuritiskt nätverk. Starkare mekanisk avlossning av cellerna eller hårda dissociationsreagens kan användas för att säkerställa singularisering, men med potentiella effekter på cellviabilitet, fysiologi och återbindningskapacitet47,48. När det gäller behovet av enstaka celler för vidare analyser och mognad dissocierades aggregat efter 4 dagar i suspension, och (dag 2) iNGN2-neuronerna kryokonserverades. Post-tina differentiering och karakterisering av iNGN2-neuroner bekräftade en ökande mognad hos neuronkulturerna och bildandet av ett tätt neuritiskt nätverk.
Det tillhandahållna protokollet ger ett stort antal iNGN2-neuroner. Flera begränsningar måste dock beaktas. Som för de flesta suspensionskulturplattformar är överföringen av hiPSC från en 2D-vidhäftande kultur till en 3D-miljö kritisk och ofta förknippad med en djup cellförlust. Ytterligare betydande cell- och aggregerad förlust förväntas under medieförändringar. Jämfört med automatiserade plattformar ökar hanteringstiden och kontamineringsrisken med hjälp av bänkbioreaktorn, eftersom medelstora byten måste utföras manuellt. Bortsett från bristen på automatisering erbjuder bänkbioreaktorn inte möjligheten att övervaka näringsämnena, och den maximala kapaciteten på 50 ml per rör begränsar protokollets uppskalningspotential. Slutligen är det viktigt att notera att även om NGN2 accelererar neuronalt härstamningsengagemang, förkortas inte varaktigheten av terminal mognad och kräver fortfarande långsiktig kultur under flera veckor. Med tanke på vikten av astrocytiskt stöd för neuronal funktion, bindning och överlevnad 49,50,51, bör samodlingsmetoder övervägas och kan till och med vara nödvändiga för långsiktig odling.
Sammanfattningsvis översattes ett 2D-differentieringsprotokoll framgångsrikt till en 3D-miljö för snabb och reproducerbar generering av iNGN2-neuroner genom att implementera en bänkbioreaktor. Det beskrivna protokollet ger stora mängder av iPSC-härledda neuroner av god kvalitet, vilket kan fungera som utgångspunkt för komplexa modelltester, läkemedelsscreeningar med hög genomströmning och storskaliga toxicitetsanalyser.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
EBiSC2-projektet har fått finansiering från det gemensamma företaget för initiativet för innovativa läkemedel 2 (JU) enligt bidragsavtal nr 821362. Det gemensamma företaget får stöd från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 och EFPIA. Vi tackar Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters och Vanessa M. Nalewaja för deras hjälp med immuncytokemiska analyser och genuttrycksanalyser, samt Heike Arthen för hennes utmärkta tekniska support. Dessutom tackar vi Stephanie Bur för inrättandet av bioreaktorprogrammet. Figur 2A skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 11528926 | |
| 60 mm Nunclon Delta Surface | Nunc | 734-2040 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) | Abcam | ab7751 | |
| Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 10400745 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 11530536 | serum-free Supplement (50x) |
| BIONi010-C-13 hiPSC line | European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor | SAMEA103988285 | Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line. |
| Biorender | Biorender.com | ||
| BSA Cell Culture grade | Thermo Fisher Scientific | 12330023 | |
| CERO 3D Incubator & Bioreactor | OLS OMNI Life Science | 2800000 | |
| CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL | OLS OMNI Life Science | 2800005 | |
| Citavi 6 | Swiss Academic Software | ||
| CryoStor CS10 | Stemcell | 7930 | freezing medium containing 10% DMSO |
| Cytofix Fixation Solution | BD Biosciences | 554655 | fixation solution containing 4% paraformaldehyde |
| DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN) | Thermo Fisher Scientific | 12333553 | |
| Doxycycline hydrochloride (DOX) | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+) | Gibco | 11580456 | |
| DMEM/F12 (-/-) | Gibco | 21331-020 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | Gibco | 31331-028 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21424 | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050-038 | stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid |
| ImageJ 1.51v | National Institute of Health | ||
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278l | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi | ||
| MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) | Thermo Fisher Scientific | 13-1500 | |
| Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free | Corning Life Science | 356231 | basement membrane matrix |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film Kit | Thermo Fisher Scientific | 10095714 | |
| mTeSR1 | Stemcell | 85850 | feeder-free iPSC maintenance medium |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation |
| Neurobasal Medium | Gibco | 11570556 | |
| Nikon Eclipse TS2 | Nikon Instruments Europe B.V. | ||
| NucleoCounter-NC200 | ChemoMetec A/S | ||
| Origin 2021 | OriginLab | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 11548876 | |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | |
| Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) | Thermo Fisher Scientific | 11620099 | |
| Poly-L-ornithine 0.01% | Merck | P4957 | |
| RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit | Qiagen | 74034 | column-based RNA isolation kit |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | cell lysis buffer |
| Sodium Pyruvat (100 mM) | Gibco | 12539059 | |
| StemPro Accutase | Gibco | 11599686 | cell dissociation enzyme |
| TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX | Thermo Fisher Scientific | 11380912 | qPCR master mix |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Select Enzym | Gibco | 12563-011 | Trypsin-EDTA solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| Via1-Cassette | ChemoMetec A/S | 941-0012 | |
| Wide Bore Filtered Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 10088880 | |
| X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES | Thermo Fisher Scientific | 15206343 | |
| Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) | Abcam | ab120129 |
References
- Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
- Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
- Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review. , Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016).
- van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
- van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
- Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
- Shih, P. -Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
- Chang, C. -Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
- Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
- Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
- Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
- Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
- Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
- Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
- User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC. , Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023).
- Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
- Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
- Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
- Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
- Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
- Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
- Liu, N., Zang, R., Yang, S. -T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
- Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
- Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
- Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
- Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
- Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
- Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
- Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
- Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
- Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
- Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
- Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).
