Summary
我们描述了一种分离和培养人隐静脉内皮细胞（hSVEC）的方案。我们还提供了产生剪切应力和拉伸的详细方法，以研究hSVEC中的机械应力。
Abstract
冠状动脉旁路移植术（CABG）是一种对缺血性心肌进行血运重建的手术。尽管与动脉导管相比，长期通畅性降低，但隐静脉仍用作冠状动脉旁路移植术导管。与移植物动脉化相关的血流动力学应激突然增加导致血管损伤，尤其是内皮损伤，这可能会影响隐静脉移植物 （SVG） 的低通畅性。在这里，我们描述了人隐静脉内皮细胞（hSVEC）的分离，表征和扩增。通过胶原酶消化分离的细胞显示出典型的鹅卵石形态，并表达内皮细胞标志物CD31和VE-钙粘蛋白。为了评估机械应力的影响，本研究使用协议来研究动脉化SVG上的两种主要物理刺激，剪切应力和拉伸。 hSVEC在平行板流动室中培养以产生剪切应力，显示流动方向的对齐和KLF2，KLF4和NOS3的表达增加。hSVEC也可以在硅膜中培养，该硅膜允许模拟静脉（低）和动脉（高）拉伸的受控细胞拉伸。内皮细胞的F-肌动蛋白模式和一氧化氮（NO）分泌通过动脉拉伸相应地调节。总之，我们提出了一种分离hSVEC的详细方法，以研究血流动力学机械应激对内皮表型的影响。
Introduction
内皮细胞 （EC） 功能障碍是隐静脉移植失败的关键因素1，2，3，4。剪切应力和周期性拉伸的持续增加诱导人隐静脉内皮细胞（hSVEC）的促炎表型3，4，5，6。潜在的分子途径仍未完全了解，体外研究的标准化方案可能会利用该领域的新见解。在这里，我们描述了一个简单的方案来分离，表征和扩增hSVEC，以及如何将它们暴露于不同水平的剪切应力和循环拉伸，模拟静脉和动脉血流动力学状况。
hSVEC通过胶原酶孵育分离，可使用至第8代。与其他可用的方案7相比，该协议需要较少的血管操作，从而减少了平滑肌细胞和成纤维细胞的污染。另一方面，它需要至少 2 厘米的较大容器段才能进行有效的 EC 提取。在文献中，已经报道了来自大型容器的EC也可以通过机械去除获得7，8。虽然有效，但物理方法具有EC产量低和成纤维细胞污染较高的缺点。为了提高纯度，需要使用磁珠或细胞分选的额外步骤，由于获取磁珠和抗体7，8，增加了方案的成本。酶法在EC纯度和活力方面具有更快更好的结果7，8。
研究内皮功能障碍最常用的EC是人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。众所周知，EC表型在不同的血管床中发生变化，因此必须开发代表所研究血管的方法9，10。在这方面，建立分离hSVEC并在机械应力下培养的方案是了解hSVEC功能障碍在静脉移植疾病中的贡献的宝贵工具。
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Protocol
未使用的隐静脉段是从圣保罗大学医学院心脏研究所（InCor）接受主动脉冠状动脉搭桥手术的患者那里获得的。所有个体都知情同意参与该研究，该研究由当地伦理委员会审查和批准。
1. 原代人隐静脉内皮细胞 （hSVEC） 的分离、培养和表征
- 制备
- 高压灭菌一对直镊子或弯曲的镊子和组织剪刀（7-8厘米）。
- 准备无菌明胶。将0.1g（0.1%w / v）或3g（3%w / v）猪皮明胶与100mL超纯水混合，高压灭菌15分钟，并储存在4°C。 在涂覆细胞培养皿和载玻片之前，加热至37°C液化。
- 在层流罩内制备无菌胶原酶（1 mg / mL）。在PBS中稀释胶原酶并用0.2μm过滤器灭菌。
- 在37°C下涂覆60mm细胞培养皿和8孔室载玻片，用0.1%w / v明胶至少30分钟。 在接种细胞之前去除多余的明胶。
- 制备完整的内皮细胞培养基：补充有EGM2生长因子的内皮细胞生长基础培养基（EBM-2）。
注意：EGM2生长因子由 材料表中列出的公司作为试剂盒提供。公司未披露因素的集中度。 - 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 2% 和 5% 的牛血清白蛋白 （BSA）、4% 多聚甲醛 （PFA） 和 0.1% Triton X-100 溶液。
- hSVEC的分离和培养
- 为此手术收集至少 2-3 厘米长的隐静脉段。
注意。所有细胞培养程序必须在无菌条件下和层流罩内进行。 - 将静脉段转移到装有预热PBS的培养皿中。将移液器吸头插入静脉的一端，并用PBS轻轻冲洗以去除管腔内的所有血液。冲洗直至洗涤流完全清澈。
- 用无菌棉缝合线关闭静脉的一端。小心地用 1 mg/mL II 型胶原酶溶液填充容器。用棉缝合线关闭容器的另一端（图1A）。将带有胶原酶溶液的容器在37°C的5%CO2 的潮湿气氛中孵育1小时。
- 之后，在 15 mL 管内切割容器的一端并收集胶原酶溶液。切开另一端，用 1-2 mL PBS 冲洗管腔表面，以收集所有分离的 EC。将所有PBS与胶原酶溶液放在同一个管内。
- 在室温（RT）下以400× g 离心管5分钟以沉淀细胞。
注意。细胞沉淀非常小，难以观察。如果在胶原酶处理前（步骤1.2.2.）没有完全去除血液，血细胞也会沉淀，沉淀会变红。 - 除去上清液并将细胞沉淀重悬于3-4mL完全内皮细胞培养基（补充有EGM2生长因子的EBM-2）和额外的肝素溶液（5U / mL，终浓度）中。将细胞接种在预涂有 3% w/v 明胶的 60 mm 细胞培养皿中。
注意：明胶因其易于获取和低成本而成为首选。由于明胶涂层成功地保持了EC表型，因此没有测试其他涂层物质。胶原蛋白和纤连蛋白可以在旨在研究不同细胞外基质成分对EC粘附和表型影响的研究中进行测试。 - 将细胞在37°C下在含有5%CO2 的潮湿气氛中孵育4天而不更换培养基。之后，每隔一天更换一次媒体。从这一刻起，不再需要额外的细胞培养基补充肝素。在显微镜下检查平板以确保红细胞被去除。
- 提取后3-10天后，根据静脉段的大小和直径，通过相差显微镜观察hSVEC。
- 在相衬显微镜中评估汇合程度及其鹅卵石形态。
- 继续每2天更换一次培养基，直到细胞达到70%-80%汇合。
- 用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液传代hSVEC。
- 用预热的PBS清洗细胞。
- 将 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液加入 60 mm 细胞培养皿中。在37°C孵育2分钟或直到所有细胞分离。
- 加入 2 mL 完全内皮细胞培养基以灭活胰蛋白酶。
- 将细胞悬液转移到 15 mL 管中，并在室温下以 300 x g 离心 3 分钟。
- 弃去上清液并将细胞重悬于1mL培养基中。
- 将细胞悬液计数在 1：1 台盼蓝 （0.4%） 中以板活细胞。
- 为了扩大培养物，将细胞接种在装有10mL预热的完整内皮细胞培养基的100mm细胞培养皿中，并在37°C下在含有5%CO2的潮湿气氛中培养。
注意。平均而言，4 x 104 hSVEC/cm 2 的接种将在48 h后100%汇合。
- 为了冷冻保存细胞，将步骤1.2.11.5中的沉淀重悬于胎牛血清（FBS）中的5%二甲基亚砜（DMSO）中并储存在液氮中。
- 为此手术收集至少 2-3 厘米长的隐静脉段。
- hSVEC 的表征：CD31 的流式细胞术染色
- 将 1 x 10 5 hSVEC 转移到一个1.5 mL 管中，并在室温下以 300 x g 离心 3 分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于 100 μL 含有 2% BSA 和 CD31-FITC 单克隆抗体 （1：100） 的 PBS 中。
- 在黑暗中在室温下染色细胞30分钟。
- 通过加入 0.5 mL PBS 洗涤染色细胞，并在室温下以 300 x g 离心 3 分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 400 μL PBS 中，含 2% BSA。
- 使用不含CD31抗体的未标记hSVEC作为阴性对照。
- 使用蓝色激光和FITC通道（激发/发射最大[Ex / Em]为498 / 517 nm）进行流式细胞仪采集分析。如果使用其他荧光染料，请检查细胞仪是否具有用于检测的合适滤光片组。根据细胞的大小和粒度将细胞与碎片分开，然后通过前向散射和侧向散射来控制单个细胞。
- hSVEC 的表征：CD31 和 VE-钙粘蛋白的荧光染色
- 在明胶包被的8孔室载玻片中板0.1 x 105 细胞。将细胞在37°C，5%CO2下孵育过夜，以使细胞附着在培养表面上。
- 取出培养基并用PBS洗涤细胞一次。
- 加入 0.3 mL/孔的 4% PFA 以固定细胞。在室温下孵育15分钟。
- 用PBS清洗三次。
- 加入 0.3 mL/孔的 0.1% Triton X-100 溶液以透化细胞。在室温下孵育15分钟。
- 用PBS清洗三次。
- 要阻断非特异性抗体结合位点，向细胞中加入 0.3 mL/孔的 5% BSA 溶液。在室温下孵育15分钟。
- 用PBS清洗三次。
- 用一抗（CD31和VE-钙粘蛋白，1：100）孵育细胞，在PBS中稀释，2%BSA过夜，在4°C下轻轻摇动。 留下一个与PBS孵育的孔，其中2%BSA（无一抗）作为阴性对照。
- 用PBS清洗三次。
- 将细胞与在PBS中稀释（1：500）的荧光标记二抗在室温下孵育1小时。 加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行核染色至终浓度为1mg / mL。
- 用PBS清洗三次。
- 用分离器拆下介质室。放置一滴封片剂试剂（PBS中的50%甘油）并放置载玻片（24 mm x 60 mm），同时避免捕获气泡。
- 在荧光显微镜下观察细胞。
注意：DAPI 是用 DAPI 光立方（例如：335-379 nm;Em：417-477 nm），使用绿色荧光蛋白 （GFP） 光立方（例如：459-481 nm;电磁：500-550 纳米）。具有相似激发/发射波长范围的光立方也足以用于这些荧光染料。如果使用其他荧光染料，请检查所使用的显微镜是否具有用于检测的适当滤光片组。
2. hSVEC的剪切应力
- 制备
- 在37°C下用0.1%w / v明胶涂覆流动室载玻片至少30分钟。 在接种细胞之前去除多余的明胶。
- 在37°C下在培养箱内5%CO2 的潮湿气氛中平衡流体单元和无菌灌注装置，用10mL储液器过夜。
- 剪切应力实验
- 将悬浮在 100 μL EC 培养基中的种子 2 x 105 EC 放入涂有明胶的流动室载玻片中。将细胞在37°C和5%CO2 下孵育4小时，以使细胞附着在培养表面上。
- 按照制造商的说明将灌注装置放在流体单元上。将储液器和灌注装置填充在约12mL预热的完整内皮细胞培养基中。从灌注装置中手动去除气泡，以平衡两个储液槽在 5 mL 的水平。
- 将装有灌注装置的流体单元（没有腔室滑块）放入培养箱中，并将其电缆连接到计算机调节的泵。从储液器和灌注装置中去除所有气泡，在泵控制软件中运行预定义的协议。
注意。去除气泡对于系统正常运行非常重要。 - 将装有灌注装置的流体单元连接到层流罩上，并用汇合的细胞单层连接载玻片。
- 将装有灌注的流体单元和带有细胞的滑块放入培养箱中，并将其电缆连接到泵。
- 在泵控制软件中，设置以下参数：介质粘度（0.0072），滑块类型，灌注定校准因子，剪切应力率（20 dyn/cm2），流动类型（单向）和时间（72小时），并开始流动（更多详细信息请参阅设备说明）。收获用相同培养基处理的细胞，而不会暴露在与静态对照的流动中。
- 刺激完成后，用PBS洗涤细胞一次，然后根据所需的测定继续收获样品。有关荧光染色，请参见步骤2.3.1，RNA提取请参见步骤2.3.2。
- 证明剪切应力方案的有效性
- 肌动蛋白丝（F-肌动蛋白）的荧光染色
- 固定并透化细胞，如步骤1.4.2-1.4.6所示。在μ玻片中使用 100 μL 的体积。
- 用荧光标记的鬼笔环肽（在PBS中以1：200稀释）染色F-肌动蛋白，并在室温下用DAPI（PBS中的终浓度为1mg / mL）复染细胞核2小时，避光。
- 用PBS清洗三次。
- 在荧光显微镜下观察细胞。
注意：DAPI 是用 DAPI 光立方（例如：335-379 nm;Em：417-477 nm）和鬼笔环肽用GFP光立方（例如：459-481 nm;电磁：500-550 纳米）。具有相似激发/发射波长范围的光立方也足以用于这些荧光染料。如果使用其他荧光染料，请检查所使用的显微镜是否具有用于检测的适当滤光片组。
- 通过实时定量逆转录 （RT-qPCR） 进行基因表达
- 用 350 μL 含硫氰酸胍的市售裂解缓冲液从μ载玻片中收集细胞。根据制造商的说明，使用基于柱的提取试剂盒分离总RNA。
注意：由于在μ载玻片中培养的细胞数量有限，建议使用基于柱的RNA提取。 - 根据制造商的说明，使用带有转录酶逆转酶的 cDNA 合成试剂盒制备 cDNA。
- 验证受剪切应力调控的基因的表达：KLF2、KLF4 和 NOS3。使用管家基因 PPIA/亲环蛋白使结果标准化。反应的具体引物列于 表1中。
- 在以下反应条件下使用SYBR绿色荧光DNA染色试剂盒进行RT-qPCR：i）50°C2分钟，ii）95°C15分钟，iii）94°C15秒，iv）60°C30秒，v）72°C30秒。重复步骤 iii 到 v 40 个周期。在反应结束时加入熔解步骤以验证引物的特异性。
- 用 350 μL 含硫氰酸胍的市售裂解缓冲液从μ载玻片中收集细胞。根据制造商的说明，使用基于柱的提取试剂盒分离总RNA。
- 肌动蛋白丝（F-肌动蛋白）的荧光染色
3. hSVEC上的循环拉伸
- 制备
- 将有机硅基润滑剂涂在 25 mm 的 6 孔等双轴加载站的顶部和侧面。
注意：这减少了培养板膜和工作站之间的摩擦，允许更好地分布循环菌株。此步骤必须在每次实验之前完成。
- 将有机硅基润滑剂涂在 25 mm 的 6 孔等双轴加载站的顶部和侧面。
- 循环拉伸实验
- 将悬浮在 3 mL 中的 4 x 105 个细胞接种到涂有胶原蛋白 I 的 6 孔柔性底培养板的每个孔中（材料表）。计划将处于静态状态的板作为对照组。将细胞保持在培养箱中（37°C在含5%CO2的潮湿空气中），直到它们达到100%汇合度（通常在接种后48小时）。在拉伸方案开始之前，用预热的PBS洗涤细胞一次，每孔加入3mL新鲜培养基。
- 将所有润滑的装载站的底板插入培养箱中，并将管道与张力细胞拉伸生物反应器的控制器设备适当地连接（有关更多详细信息，请参阅设备说明）。
- 将每个培养板连接到一个红色垫圈上，由张力细胞拉伸生物反应器系统提供。然后，将它们放入培养箱内的底板中。
- 确保板完全就位、压紧并密封到底板上，以避免在真空泵送过程中漏气。重要的是将所有四个培养板放在底板中，以具有适当的真空度和拉伸载荷。
- 如果实验板较少，请使用空板完成底板上的四个位置。将丙烯酸板（随设备提供）添加到培养板的顶部，以改善底板的密封性。将静态板放入同一培养箱中。
- 打开控制器设备和计算机系统。打开软件图标并配置所需的方案：要使用的加载站的大小、应变类型、伸长率百分比、波形形状、频率和时间。有关详细信息，请参阅制造商的说明。选择并下载治疗方案。在这里，使用以下方案：1/2窦波形形状，1Hz频率，5%的伸长（模拟静脉拉伸）和15%的伸长（模拟动脉拉伸）长达72小时。
- 打开真空系统，然后单击计算机屏幕上的 “开始” 以运行拉伸。检查硅胶膜是否在移动和拉伸细胞。
- 刺激完成后，用PBS洗涤细胞一次，然后根据所需的测定继续收获样品。在这里，为了证明循环拉伸的有效性，收集hSVEC培养基，将其保持在-80°C以进行进一步的一氧化氮（NO）测量，并固定细胞以进行荧光染色。
注意。底板不使用时不能存放在培养箱内;否则，温度会改变扁平形状并使其无用。
- 证明循环拉伸方案的有效性
- F-肌动蛋白的荧光染色
- 按照步骤 1.4.3 中的指示修复单元格。每孔使用 1 mL 的体积。
- 用PBS洗涤细胞三次。将细胞保持在PBS中，使其在为后续步骤准备有机硅膜时不会干燥。
- 使用棉签从膜底部去除多余的硅基润滑剂。然后，用新的棉签轻轻涂抹窗户清洁剂或洗手液。重复该过程，直到从膜上去除所有润滑剂。然后，用去离子水清洁。
注意。从有机硅膜上完全去除润滑剂以获得高质量的显微镜图像非常重要。 - 小心地将有机硅膜切成小块，以适合 8 孔室载玻片进行染色。如步骤1.4.5所示透化细胞。
- 洗涤步骤后，使用鬼笔环肽对F-肌动蛋白进行染色，并用DAPI对细胞核进行染色。如步骤2.3.1.2和2.3.1.3所示继续分析。每个腔室使用0.3 mL的体积。
- 用分离器拆下介质室。放入一滴封片剂（PBS中的50%甘油）并放置载玻片（24 mm x 60 mm）。
- 在荧光显微镜下观察细胞。
注意：DAPI 是用 DAPI 光立方（例如：335-379 nm;Em：417-477 nm）和鬼笔环肽用红色荧光蛋白（RFP）光立方（Ex：511-551 nm;电磁：573-613 纳米）。具有相似激发/发射波长范围的光立方也足以用于这些荧光染料。如果使用其他荧光染料，请检查所使用的显微镜是否具有用于检测的适当滤光片组。
- NO-使用基于碘化钾的还原化学发光测定法通过hSVEC条件培养基中的亚硝酸盐（NO2）积累来估计
- 制备
- 从0.01-10mM亚硝酸钠（超纯水中的NaNO2 ）溶液制备标准曲线。
- 将5 mL乙酸和1 mL碘化钾（50 mg在1 mL超纯水中）加入一氧化氮分析仪的吹扫容器中。
- 无测量
- 将 20 μL NaNO2 标准曲线加入一氧化氮分析仪的吹扫容器中。根据制造商的协议进行测量。
- 制备
- 将 20 μL 条件培养基加入一氧化氮分析仪的吹扫容器中。根据制造商的协议进行测量。
- 根据标准曲线校准计算 NO2 浓度。调整由分析的条件培养基6，11的总体积获得的值。
- F-肌动蛋白的荧光染色
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Representative Results
通常，粘附的EC可以在提取后3-4天观察到。hSVEC最初形成细胞簇并显示出典型的“鹅卵石”形态（图1B）。它们表达EC标志物CD31（图1C，D）和VE-钙粘蛋白（图1D）。hSVEC可以在非包被处理的细胞培养皿上轻松繁殖，并且在培养物中保留内皮表型多达八代。
hSVEC在剪切应力下培养时，沿流动方向对齐（图2A）。20 dyn/cm2 持续 72 小时的剪切应力诱导典型机械敏感基因 KLF2、KLF4 和 NOS3 的表达，表明剪切刺激在 hSVEC 中的有效性（图 2B）12，13，14。
循环拉伸结果取决于应用于hSVEC的强度。低拉伸下的细胞显示出类似于静态细胞的皮质F-肌动蛋白模式（图3A），在长达72小时（图3B）内NO释放没有变化。拉伸的动脉水平在24小时后重塑肌动蛋白细胞骨架（图3A），并在72小时后减少NO释放（图3B）。
图 1：来自人隐静脉 （hSVEC） 的内皮细胞表现出典型的内皮形态和特异性 EC 标志物表达。 （A）用II型胶原酶溶液完成的大隐静脉段，用于提取ECs。（B）提取后hSVEC生长的代表性时间过程。3-4天后，可以可视化增殖直到它们达到汇合的细胞簇。比例尺 = 100 μm。 （C） 第 1 代培养的 hSVEC 的 FACS 分析。绿线表示99.7%的细胞群对内皮特异性标志物CD31呈阳性。黑线是阴性对照。（D） 第 1 代 hSVEC 中 CD31（绿色）、（E） VE-钙粘蛋白（绿色）和细胞核 DAPI（蓝色）的免疫染色。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：hSVEC 在暴露于单向剪切应力时沿流动方向排列并表达机械敏感基因。 在静态或单向层流剪切应力条件下培养的hSVEC的融合细胞单层。（A）暴露于20 dyn / cm2 剪切应力下72小时的hSVEC的相差图像（顶部）和鬼笔环肽染色（底部）。绿色：肌动蛋白丝;蓝色：细胞核。比例尺 = 100 μm（相衬）和 20 μm（荧光）。（B）通过qRT-PCR测定KLF2，KLF4和NOS3的基因表达。值表示 SEM 的平均值± ** p < 0.01 与静态组。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：循环拉伸下的 hSVEC 表型取决于施加的强度 。 （A）在柔性底板中静态，低（静脉）或高（动脉）拉伸下培养的hSVEC的融合细胞单层24小时。相差图像（顶部）和鬼笔环肽染色（底部）显示肌动蛋白纤维（红色）和带有DAPI的细胞核（蓝色）。比例尺 = 100 μm（相衬）和 50 μm（荧光）。（B）根据细胞培养基中72小时的NO2 积累估计NO测量。值表示 SEM 的平均值± *** p < 0.001 与静态组。 请点击此处查看此图的大图。
| 基因 | 蛋白 | 前进 5'-3' | 反向 5'-3' | ||
| KLF2 | 克鲁佩尔样因子 2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 | 克虏伯样因子 4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGGGCAC | ||
| NOS3 | 一氧化氮合酶，内皮 | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| PPIA | 亲环素A， | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGGGACCTTGTC | ||
| 肽基脯氨酰异构酶A | |||||
表1：剪切应力和参考基因的qRT-PCR引物。
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Discussion
隐静脉段应至少为 2 cm，以成功分离 hSVEC。小段难以处理并绑住血管末端以维持胶原酶溶液以分离细胞。减小的管腔表面积不能产生足够的细胞来扩增培养物。为了尽量减少非EC污染的风险，在整个过程中，大隐静脉段的操作需要非常轻柔。将移液器吸头引入管腔表面以去除血液和引入胶原酶溶液时要小心。应很好地控制酶溶液的暴露（不超过1小时），以减少非EC对培养物的污染。使用补充生长因子混合物的特定EC培养基对于hSVEC培养物的生长至关重要。在培养的第一天增加肝素对于减少静脉段残留的红细胞和抑制平滑肌细胞增殖很重要15。当通过细胞进行实验或维持培养物时，请确保将细胞的汇合度高于40%。EC需要尽量减少接触，以确保良好的扩散和生存。hSVEC可以很容易地在非包被（例如，明胶或纤连蛋白）表面上培养。然而，在EC提取后的第一天，涂层将增加EC的附着力和产量。hSVEC 具有恒定的增殖速率，可将内皮表型维持多达 8 代，不表达间充质细胞标志物（如 SM22 和钙钙蛋白）。根据我们的经验，增殖速率可能因组织供体而异，但不会因细胞通道而异。建议用5%DMSO冷冻保存FBS中的hSVEC，以增加细胞解冻后的活力。
要进行剪切应力实验，需要考虑一些关键步骤。为避免系统内部形成气泡，灌注装置和连接器必须在37°C和5%CO2下平衡过夜。气泡会阻塞通过系统的流动或破坏干扰细胞表型的内皮单层。当将细胞接种到流动室载玻片中时，建议在4小时后或第二天使其汇合使用。此外，如果实验运行数天，则必须每天在静态条件下更换载玻片的介质。流动室载玻片的体积为~160μL，不足以维持细胞长时间培养。该系统的优点是通过显微镜（明场/相衬或荧光显微镜染色）轻松观察细胞。限制是蛋白质（20-25 μg/载玻片）和RNA（1 μg/载玻片）的低产量。为了克服这个问题，该系统允许使用相同的流体单元连接多个滑块（请参阅制造商的说明）。然后，可以使用一张载玻片的裂解缓冲液体积从多张载玻片中提取蛋白质或RNA。
拉伸系统易于操作，并允许应用不同强度和类型的拉伸。重要的是在每次实验之前润滑所有加载站，以减少培养板膜和工作站之间的摩擦，并保证循环菌株的正确分布。确保板完全密封在底板上，以产生达到所需拉伸所需的真空。等轴刺激不会在井内产生均匀的应变。如制造商所示，需要丢弃孔边缘的电池。感兴趣的膜面积根据上料站直径和伸长率百分比确定。可以在整个膜中进行免疫染色或将其切成更小的碎片以减少测定中使用的抗体数量。在这种情况下，必须非常小心地处理膜，避免损坏细胞。研究人员还应注意不要在进行染色时将膜倒置并丢失细胞。始终可以在光学显微镜下用细胞确认膜的正确面。
像这样的 体外 研究的主要局限性在于它们不能完全概括 体内 环境。因此，重要的是始终进行分析以确保hSVEC保持EC表型（表达EC标志物）并在机械应力（F-肌动蛋白取向和机械反应蛋白的调节/产生）下重现预期结果。
总之，我们提供了一个详细的程序来分离hSVEC，并将它们暴露于受控的剪切应力和拉伸水平。当 SV 移植物在冠状动脉旁路移植术后突然暴露于动脉疾病时，会发生内皮损伤并导致移植失败。这些协议可能有助于促进我们对机械力如何影响与静脉移植疾病相关的hSVEC功能障碍的理解。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
JEK得到了圣保罗国家宪法权利保护基金会[FAPESP-INCT-20214/50889-7和2013/17368-0]和全国发展委员会（INCT-465586/2014-7和309179/2013-0）的资助。AAM得到了圣保罗国家宪法权利保护基金会（FAPESP 2015/11139-5）和全国公民和技术发展委员会（环球-407911/2021-9）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
