Summary
ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)を単離および培養するためのプロトコルについて述べる。また、hSVECの機械的応力を研究するために、せん断応力と伸張を生成するための詳細な方法も提供しています。
Abstract
冠動脈バイパスグラフト(CABG)手術は、虚血性心筋を血行再建する手順です。伏在静脈は、動脈導管と比較して長期的な開存性が低下しているにもかかわらず、CABG導管として使用され続けています。移植片動脈化に関連する血行動態ストレスの急激な増加は、伏在静脈移植片(SVG)の低い開存性に影響を与える可能性のある血管損傷、特に内皮をもたらします。ここでは、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の単離、特性評価、および増殖について説明します。コラゲナーゼ消化によって単離された細胞は、典型的な石畳の形態を示し、内皮細胞マーカーCD31およびVE-cadherinを発現します。機械的ストレスの影響を評価するために、この研究ではプロトコルを使用して、動脈化されたSVGに対する2つの主要な物理的刺激であるせん断応力と伸張を調査しました。 hSVECは、平行プレートフローチャンバーで培養されてせん断応力を生成し、流れの方向に整列し、KLF2、KLF4、およびNOS3の発現が増加しました。hSVECは、静脈(低)および動脈(高)の伸展を模倣した細胞伸長を制御できるシリコン膜で培養することもできます。内皮細胞のF-アクチンパターンと一酸化窒素(NO)分泌は、動脈の伸展によってそれに応じて調節されます。要約すると、内皮表現型に対する血行力学的機械的ストレスの影響を研究するために、hSVECを単離するための詳細な方法を提示します。
Introduction
内皮細胞(EC)機能不全は、伏在静脈グラフト不全の重要なプレーヤーです1,2,3,4。せん断応力と周期的伸展の持続的な増加は、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の炎症誘発性表現型を誘導します3,4,5,6。基礎となる分子経路はまだ完全には理解されておらず、in vitro研究のための標準化されたプロトコルは、この分野における新しい洞察のための努力を活用する可能性があります。ここでは、hSVECを単離、特性評価、拡張するための簡単なプロトコルと、静脈および動脈の血行動態状態を模倣して、hSVECをさまざまなレベルのせん断応力と周期的伸展にさらす方法について説明します。
hSVECはコラゲナーゼインキュベーションによって単離され、継代8まで使用することができます。このプロトコルは、平滑筋細胞および線維芽細胞による汚染を減少させる他の利用可能なプロトコル7と比較して、血管の操作が少なくて済む。一方、効率的なEC抽出を行うには、少なくとも2cmのより大きな血管セグメントが必要です。文献では、大型容器からのECは機械的除去によっても得られることが報告されています7,8。物理的アプローチは効果的であるが、EC収率が低く、線維芽細胞汚染が高いという欠点がある。純度を上げるには、磁気ビーズまたは細胞ソーティングを使用した追加のステップが必要であり、ビーズと抗体の取得によりプロトコルのコストが増加します7,8。酵素法は、ECの純度と生存率に関してより速く、より良い結果をもたらします7,8。
内皮機能障害の研究に最も頻繁に使用されるECは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)です。EC表現型は血管床によって変化することが知られており、調査中の血管を表す方法を開発することが不可欠である9,10。この点で、hSVECを単離し、機械的ストレス下で培養するためのプロトコルの確立は、静脈移植疾患におけるhSVEC機能障害の寄与を理解するための貴重なツールです。
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Protocol
伏在静脈の未使用のセグメントは、サンパウロ大学医学部の心臓研究所(InCor)で大動脈バイパス手術を受けている患者から得られました。すべての個人が研究に参加することにインフォームドコンセントを与え、地元の倫理委員会によってレビューおよび承認されました。
1. 初代ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の単離、培養、および特性評価
- 準備
- 一対の直線または湾曲した鉗子と組織ハサミ(7〜8 cm)をオートクレーブします。
- 滅菌ゼラチンを準備します。ブタ皮ゼラチン0.1g(0.1%w/v)またはブタ皮ゼラチン3g(3%w/v)を超純水100mLと混合し、オートクレーブで15分間保存し、4°Cで保存する。 37°Cに温めて液化してから、細胞培養皿とスライドをコーティングします。
- 層流フード内に滅菌コラゲナーゼ(1 mg/mL)を調製します。コラゲナーゼをPBSで希釈し、0.2 μmのフィルターで滅菌します。
- 60 mmの細胞培養皿と8ウェルチャンバースライドに0.1%w/vゼラチンを37°Cで30分以上コーティングします。 細胞を播種する前に余分なゼラチンを取り除きます。
- 完全な内皮細胞培地の調製:EGM2増殖因子を添加した内皮細胞増殖基礎培地(EBM-2)。
注:EGM2成長因子は、 材料表に記載されている会社からキットとして提供されています。要因の集中は会社によって開示されていません。 - 2%および5%のウシ血清アルブミン(BSA)、4%パラホルムアルデヒド(PFA)、および0.1%Triton X-100溶液をすべてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製します。
- hSVECの単離と培養
- この手順のために、少なくとも2〜3 cmの長さの伏在静脈セグメントを収集します。
手記。すべての細胞培養手順は、無菌条件下で層流フード内で実施する必要があります。 - 静脈セグメントを、予熱したPBSで満たされたペトリ皿に移します。ピペットチップを静脈の一端に挿入し、PBSでそっと洗い流して、内腔内のすべての血液を取り除きます。洗浄の流れが完全に透明になるまで洗い流します。
- 滅菌綿縫合糸で静脈の端の1つを閉じます。容器に1 mg/mLのコラゲナーゼII型溶液を慎重に充填します。容器のもう一方の端を綿縫合糸で閉じます(図1A)。容器をコラゲナーゼ溶液とともに、5%CO2 の加湿雰囲気中で37°Cで1時間インキュベートします。
- その後、15 mLチューブ内で容器の片方の端を切り取り、コラゲナーゼ溶液を採取します。もう一方の端を切断し、管腔表面を1〜2 mLのPBSで洗い流して、分離したECをすべて収集します。すべてのPBSをコラゲナーゼ溶液と一緒に同じチューブに入れます。
- チューブを400 x g で室温(RT)で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
手記。細胞ペレットは非常に小さく、視覚化が困難です。コラゲナーゼ処理前に血液が完全に除去されない場合(ステップ1.2.2)、血球も沈殿し、ペレットは赤みを帯びます。 - 上清を取り除き、細胞ペレットを3〜4 mLの完全内皮細胞培地(EGM2成長因子を添加したEBM-2)および追加のヘパリン溶液(5 U / mL、最終濃度)に再懸濁します。3%w/vゼラチンでプレコートした60 mm細胞培養皿に細胞をプレートします。
注:ゼラチンは、アクセスが容易で低コストであるため、最初の選択肢でした。ゼラチンによるコーティングはEC表現型を正常に維持するため、他のコーティング物質はテストされませんでした。コラーゲンとフィブロネクチンは、EC接着と表現型に対するさまざまな細胞外マトリックス成分の影響を調査することを目的とした研究でテストできます。 - 培地を変更せずに、5%CO2 を含む加湿雰囲気中で37°Cで細胞を4日間インキュベートします。その後、一日おきにメディアを交換してください。この瞬間から、ヘパリンによる追加の細胞培地補給はもはや必要ありません。顕微鏡でプレートを調べて、赤血球が除去されたことを確認します。
- 抽出後3〜10日後、静脈セグメントのサイズと直径に応じて、位相差顕微鏡でhSVECを視覚化します。
- 位相差顕微鏡で合流の程度とその玉石の形態を評価します。
- 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、2日ごとに培地を交換し続けます。
- hSVECを0.25%トリプシン-0.02%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液で継代します。
- 予め温めたPBSで細胞を洗浄します。
- 1 mLのトリプシン-EDTA溶液を60 mm細胞培養皿に加えます。37°Cで2分間、またはすべての細胞が剥離するまでインキュベートします。
- 2 mLの完全内皮細胞培地を加えて、トリプシンを不活化します。
- 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、300 x g でRTで3分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞を1 mLの培養液に再懸濁します。
- 細胞懸濁液を1:1のトリパンブルー(0.4%)で数え、生細胞をプレートします。
- 培養を拡大するには、予め加温した10mLの完全内皮細胞培地を入れた100mm細胞培養皿に細胞をプレートし、5%CO2を含む加湿雰囲気中で37°Cで培養する。
手記。平均して、4 x 104 hSVEC / cm2 の播種は48時間後に100%コンフルエントになります。
- 細胞を凍結保存するには、ステップ1.2.11.5のペレットをウシ胎児血清(FBS)中の5%ジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁し、液体窒素で保存します。
- この手順のために、少なくとも2〜3 cmの長さの伏在静脈セグメントを収集します。
- hSVECの特性評価:CD31のフローサイトメトリー染色
- 1 x 10 5 hSVECを1本の1.5 mLチューブに移し、300 x g でRTで3分間遠心分離します。 上清を捨て、2%BSAおよびCD31-FITCモノクローナル抗体(1:100)を含む100 μLのPBSにペレットを再懸濁します。
- 暗所のRTで30分間細胞を染色します。
- 染色した細胞を0.5 mLのPBSを加えて洗浄し、RTで300 x g で3分間遠心分離します。 上清を廃棄し、細胞ペレットを2%BSAを含む400 μLのPBSに再懸濁します。
- 陰性対照として、CD31抗体を含まない非標識hSVECを使用してください。
- 青色レーザーとFITCチャンネル(励起/発光最大[Ex/Em]498/517 nm)を用いたフローサイトメーター取得解析に進みます。他の蛍光色素を使用する場合は、サイトメーターに検出に適したフィルターセットがあるかどうかを確認してください。細胞を破片からサイズと粒度の関数で分離し、前方散乱と側方散乱によって単一細胞をゲートします。
- hSVECの特性評価:CD31およびVEカドヘリンの蛍光染色
- プレート 0.1 x 10 ゼラチンコーティングされた8ウェルチャンバースライド内の5 細胞。細胞を37°C、5%CO2で一晩インキュベートし、細胞を培養表面に付着させます。
- 培地を取り出し、細胞をPBSで1回洗浄します。
- 0.3 mL/ウェルの4%PFAを加えて細胞を固定します。RTで15分間インキュベートします。
- PBSで3回洗浄します。
- 0.3 mL/ウェルの0.1%トリトンX-100溶液を加えて細胞を透過処理します。RTで15分間インキュベートします。
- PBSで3回洗浄します。
- 非特異的抗体結合部位をブロックするには、0.3 mL/ウェルの5%BSA溶液を細胞に加えます。RTで15分間インキュベートします。
- PBSで3回洗浄します。
- PBSで希釈した一次抗体(CD31およびVE-カドヘリン、1:100)とともに細胞を2%BSAで一晩、4°Cで穏やかに揺動しながらインキュベートします。 陰性対照として2%BSA(一次抗体なし)を含むPBSでインキュベートするウェルを1つ残します。
- PBSで3回洗浄します。
- 細胞をPBSで希釈(1:500)した蛍光標識二次抗体とともにRTで1時間インキュベートします。 核染色用の4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を最終濃度1 mg/mLまで添加します。
- PBSで3回洗浄します。
- セパレーター付きのメディアチャンバーを取り外します。封入剤試薬(PBS中の50%グリセロール)を1滴置き、気泡を閉じ込めないようにスライドガラス(24 mm x 60 mm)を置きます。
- 蛍光顕微鏡で細胞を観察します。
注:DAPIはDAPIライトキューブ(例:335-379 nm;Em: 417-477 nm)、およびCD31/VE-カドヘリンは緑色蛍光タンパク質(GFP)ライトキューブ(例:459-481 nm;Em: 500-550 nm)。同様の励起/発光波長範囲を持つライトキューブも、これらの蛍光色素に適しています。他の蛍光色素を使用する場合は、使用する顕微鏡に検出に適したフィルターセットがあるかどうかを確認してください。
2. hSVECのせん断応力
- 準備
- フローチャンバースライドを0.1%w/vゼラチンで37°Cで少なくとも30分間コーティングします。 細胞を播種する前に余分なゼラチンを取り除きます。
- 37°Cで5%CO2 の加湿雰囲気中でインキュベーター内で一晩、10 mLリザーバーで流体ユニットと滅菌灌流セットを平衡化します。
- せん断応力実験
- 100 μLのEC培地に懸濁した2 x 105 ECをゼラチンでコーティングされたフローチャンバースライドにシードします。細胞を37°C、5%CO2 で4時間インキュベートし、細胞を培養表面に付着させます。
- 製造元の指示に従って、灌流セットを流体ユニットに配置します。リザーバーを満たし、灌流セットを予め温めた完全内皮細胞培地の約12mLに入れる。灌流セットから手動で気泡を取り除き、両方のリザーバーのレベルを5 mLで平衡化します。
- チャンバースライドなしで、灌流セットが取り付けられた流体ユニットをインキュベーターに置き、その電気ケーブルをコンピューター制御ポンプに接続します。リザーバーと灌流セットからすべての気泡を取り除き、ポンプ制御ソフトウェアで事前定義されたプロトコルを実行します。
手記。システムが正しく機能するためには、気泡を取り除くことが非常に重要です。 - 灌流を層流フードにセットした流体ユニットを取り出し、スライドをコンフルエントセル単層で取り付けます。
- 灌流とスライドを取り付けた流体ユニットをインキュベーター内に細胞とともに置き、その電気ケーブルをポンプに接続します。
- ポンプ制御ソフトウェアで、次のパラメータを設定します:媒体の粘度(0.0072)、スライドのタイプ、灌流セットキャリブレーション係数、せん断応力率(20 dyn / cm2)、流れのタイプ(一方向)、および時間(72時間)、およびフローを開始します(詳細については、機器の説明書を参照してください)。同じ培地で処理した細胞を、静的コントロールとしてフローにさらさずに回収します。
- 刺激が完了したら、細胞をPBSで一度洗浄し、必要なアッセイに従ってサンプルの回収に進みます。蛍光染色についてはステップ2.3.1を、RNA抽出についてはステップ2.3.2を参照してください。
- せん断応力プロトコルの有効性の実証
- アクチンフィラメント(F-アクチン)の蛍光染色
- 手順1.4.2-1.4.6に示すように、細胞を修正して透過処理します。μスライドには100 μLの容量を使用してください。
- F-アクチンを蛍光標識ファロイジン(PBSで1:200に希釈)で染色し、核をDAPI(PBS中の最終濃度1 mg/mL)で光から保護されたRTで2時間対比染色します。
- PBSで3回洗浄します。
- 蛍光顕微鏡で細胞を観察します。
注:DAPIはDAPIライトキューブ(例:335-379 nm;Em:417-477 nm)とファロイジンはGFPライトキューブ(例:459-481 nm;Em: 500-550 nm)。同様の範囲の励起/発光波長を有するライトキューブも、これらの蛍光色素に適している。他の蛍光色素を使用する場合は、使用する顕微鏡に検出に適したフィルターセットがあるかどうかを確認してください。
- リアルタイム定量逆転写(RT-qPCR)による遺伝子発現
- 市販のグアニジン-チオシアン酸塩含有溶解バッファー350 μLでμスライドから細胞を回収します。カラムベースの抽出キットで全RNAを単離し、製造元の指示に従ってください。
注:μスライドで培養する細胞数が限られているため、カラムベースのRNA抽出の使用をお勧めします。 - 製造元の指示に従って、転写酵素逆酵素を含むcDNA合成キットを使用してcDNAを調製します。
- せん断応力によって制御される遺伝子(KLF2、KLF4、およびNOS3)の発現を確認します。ハウスキーパー遺伝子PPIA/サイクロフィリンを使用して結果を正規化します。反応のための具体的なプライマーを 表1に記載した。
- 以下の反応条件下で、SYBR緑色蛍光DNA染色キットを使用してRT-qPCRを実行します:i)50°Cで2分間、ii)95°Cで15分間、iii)94°Cで15秒、iv)60°Cで30秒、v)72°Cで30秒。手順 iii から v を 40 サイクル繰り返します。反応の最後に融解ステップを追加して、プライマーの特異性を検証します。
- 市販のグアニジン-チオシアン酸塩含有溶解バッファー350 μLでμスライドから細胞を回収します。カラムベースの抽出キットで全RNAを単離し、製造元の指示に従ってください。
- アクチンフィラメント(F-アクチン)の蛍光染色
3. hSVECのサイクリックストレッチ
- 準備
- シリコーンベースの潤滑剤を、25 mmの6ウェル等二軸ローディングステーションの上部と側面に塗布します。
注:これにより、培養プレートメンブレンとステーション間の摩擦が減少し、周期的なひずみをより適切に分散させることができます。この手順は、各実験の前に実行する必要があります。
- シリコーンベースの潤滑剤を、25 mmの6ウェル等二軸ローディングステーションの上部と側面に塗布します。
- サイクリックストレッチ実験
- 種子4 x 105 細胞をコラーゲンでコーティングした6ウェルフレキシブルボトム培養プレートの各ウェルに3 mLで懸濁したI(材料表)。コントロールグループとしてプレートを静的な状態にすることを計画します。細胞が100%コンフルエントに達するまで(通常播種後48時間)、インキュベーター(5%CO2を含む加湿空気中で37°C)に細胞を保ちます。ストレッチプロトコルの開始前に、予め温めたPBSで細胞を1回洗浄し、ウェルあたり3 mLの新鮮な培養培地を加えます。
- すべての潤滑ローディングステーションを備えたベースプレートをインキュベーターに挿入し、チューブをテンションセルストレッチバイオリアクターシステムのコントローラー機器に適切に接続します(詳細については、機器の説明を参照してください)。
- 各培養プレートを、張力細胞伸張バイオリアクターシステムによって提供される1つの赤いガスケットに取り付ける。次に、それらをインキュベーター内のベースプレートに入れます。
- 真空ポンピング中に空気が漏れないように、プレートが完全に固定され、押され、ベースプレートに密閉されていることを確認してください。ベースプレートに4つの培養プレートすべてを入れて、適切な真空度と伸張荷重を確保することが重要です。
- 実験プレートが少ない場合は、空のプレートを使用してベースプレートの4つの位置を完了します。培養プレートの上にアクリルシート(装置に付属)を追加して、ベースプレートのシーリングを改善します。静的プレートを同じインキュベーターに入れます。
- コントローラ機器とコンピュータシステムの電源を入れます。ソフトウェアアイコンを開き、使用するローディングステーションのサイズ、ひずみのタイプ、伸び率、波形形状、周波数、時間など、目的のレジメンを設定します。詳細については、製造元の指示を参照してください。レジメンを選択してダウンロードします。ここでは、次のレジメンが使用されました:1/2洞波形形状、1Hz周波数、5%の伸長(静脈伸展を模倣するため)、および15%の伸長(動脈伸展を模倣するため)72時間まで。
- 真空システムの電源を入れ、コンピューター画面の[ 開始 ]をクリックしてストレッチを実行します。シリコーン膜が細胞を動かして伸ばしていないか確認してください。
- 刺激が完了したら、細胞をPBSで一度洗浄し、必要なアッセイに従ってサンプルの回収に進みます。ここで、サイクリックストレッチの有効性を実証するために、hSVEC培養液を回収し、さらに一酸化窒素(NO)測定のために-80°Cに保ち、蛍光染色のために細胞を固定します。
手記。ベースプレートは、使用しないときはインキュベーター内に保管できません。そうしないと、温度によって平らな形状が変更され、役に立たなくなる可能性があります。
- サイクリックストレッチプロトコルの有効性の実証
- F-アクチンの蛍光染色
- 手順1.4.3に示すようにセルを修正します。ウェルあたり1 mLの容量を使用してください。
- 細胞をPBSで3回洗浄します。次のステップのためにシリコーン膜を準備する間、細胞が乾燥しないようにPBSで細胞を維持します。
- 綿棒を使用して、膜の底から余分なシリコーンベースの潤滑剤を取り除きます。次に、新しい綿棒でウィンドウクリーナーまたはハンドソープをそっと塗ります。すべての潤滑剤が膜から除去されるまで、このプロセスを繰り返します。その後、脱イオン水で洗浄します。
手記。シリコーン膜から潤滑剤を完全に除去して、高品質の顕微鏡画像を得ることが重要です。 - シリコーン膜を慎重に小片に切断し、染色用の8ウェルチャンバースライドに収まります。ステップ1.4.5に示すように細胞を透過処理します。
- 洗浄ステップの後、ファロイジンを使用してF-アクチンを染色し、DAPIで核を染色します。ステップ 2.3.1.2 および 2.3.1.3 に示すように、分析に進みます。チャンバーウェルあたり0.3 mLの容量を使用してください。
- セパレーター付きのメディアチャンバーを取り外します。封入剤試薬(PBS中の50%グリセロール)を1滴入れ、スライドガラス(24 mm x 60 mm)を置きます。
- 蛍光顕微鏡で細胞を観察します。
注:DAPIはDAPIライトキューブ(例:335-379 nm;Em:417-477 nm)およびファロイジンは赤色蛍光タンパク質(RFP)ライトキューブ(例:511-551 nm;Em:573-613 nm)。同様の範囲の励起/発光波長を有するライトキューブも、これらの蛍光色素に適している。他の蛍光色素を使用する場合は、使用する顕微鏡に検出に適したフィルターセットがあるかどうかを確認してください。
- ヨウ化カリウムベースの還元化学発光アッセイを用いたhSVEC馴化培地中の亜硝酸塩(NO2)蓄積によるNO測定推定
- 準備
- 0.01〜10 mMの亜硝酸ナトリウム(超純水中のNaNO2 )溶液から標準曲線を作成します。
- 酢酸5 mLとヨウ化カリウム1 mL(超純水1 mL中50 mg)を一酸化窒素分析装置のパージ容器に加えます。
- 測定なし
- 20 μLのNaNO2標準曲線を一酸化窒素分析装置のパージ容器に加えます。メーカーのプロトコルに従って測定してください。
- 準備
- 20 μLの調整培地を一酸化窒素分析装置のパージ容器に加えます。メーカーのプロトコルに従って測定してください。
- 検量線キャリブレーションに基づいてNO2濃度を計算します。馴化培地の全量を分析6、11で得られた値を調整する。
- F-アクチンの蛍光染色
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Representative Results
典型的には、付着ECは抽出後3〜4日で観察することができる。hSVECは、最初は細胞のクラスターを形成し、典型的な「石畳」の形態を示します(図1B)。それらはECマーカーCD31(図1C、D)およびVE-カドヘリン(図1D)を発現する。hSVECは、コーティングされていない処理済み細胞培養皿上で容易に増殖することができ、培養中の内皮表現型を最大8継代まで保持します。
hSVECは、剪断応力下で培養すると、流れの方向に整列する(図2A)。72時間にわたる20dyn/cm2のせん断応力は、典型的な機械感受性遺伝子であるKLF2、KLF4、およびNOS3の発現を誘導し、hSVECにおけるせん断刺激の有効性を示しています(図2B)12、13、14。
周期的な伸張の結果は、hSVECに適用される強度に依存します。低伸張下の細胞は、静的細胞と同様の皮質F-アクチンパターンを示し(図3A)、72時間までNO放出に変化はありません(図3B)。動脈レベルの伸張は、24時間後にアクチン細胞骨格をリモデリングし(図3A)、72時間後にNO放出を減少させます(図3B)。
図1:ヒト伏在静脈(hSVEC)由来の内皮細胞は、典型的な内皮形態と特異的ECマーカー発現を示します 。 (A)ECの抽出のためのII型コラゲナーゼ溶液で満たされた伏在静脈セグメント。(B)抽出後のhSVEC増殖の代表的な時間経過。3〜4日後、コンフルエントに達するまで増殖する細胞のクラスターを視覚化することが可能です。スケールバー = 100 μm。 (C)継代1における培養hSVECのFACS分析。緑の線は、細胞集団の99.7%が内皮特異的マーカーCD31に対して陽性であることを示す。黒い線はネガティブコントロールです。(D)継代1におけるhSVECにおけるCD31(緑)、(E)VEカドヘリン(緑)、およびDAPI核(青)の免疫染色。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:hSVECは、一方向せん断応力にさらされると流れ方向に整列し、機械感受性遺伝子を発現します。 静的または一方向層流せん断応力条件下で培養したhSVECのコンフルエント細胞単層。(A)20 dyn/cm2のせん断応力に72 時間さらされたhSVECの位相差画像(上)とファロイジン染色(下)。緑:アクチンフィラメント;青:細胞核。スケールバー = 100 μm(位相コントラスト)および20 μm(蛍光)。(B)qRT-PCRにより測定されたKLF2、KLF4、およびNOS3の遺伝子発現。値はSEM±平均値を表す** p < 0.01対静的グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:周期的伸張下でのhSVEC表現型は、適用される強度に依存する 。 (A)hSVECのコンフルエント細胞単層を、柔軟な底板で24時間、静的、低(静脈)、または高(動脈)ストレッチ下で培養します。DAPI(青)によるアクチン繊維(赤)と核を示す位相差画像(上)とファロイジン染色(下)。スケールバー = 100 μm(位相コントラスト)および50 μm(蛍光)。(b)NO測定は、72時間の細胞培養培地中のNO2 蓄積に基づいて推定した。値はSEM±平均を表します。 *** p < 0.001 対静的グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | 蛋白質 | フォワード 5'-3' | リバース 5'-3' | ||
| KLF2 | クリュッペル様因子2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 | クルッペル様因子4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGGGCAC | ||
| NOS3 | 一酸化窒素合成酵素、内皮 | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| ティッカー | シクロフィリンA、 | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTTTTTGGACCTTGTC | ||
| ペプチジルプロリルイソメラーゼA | |||||
表1:剪断応力および参照遺伝子用のqRT-PCRプライマー。
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Discussion
伏在静脈セグメントは、hSVECを正常に分離するために少なくとも2 cmである必要があります。小さなセグメントは、細胞を単離するためのコラゲナーゼ溶液を維持するために、取り扱いや血管の端を結ぶのが困難です。管腔表面積の減少は、培養を拡大するのに十分な細胞を生じさせない。非ECによる汚染のリスクを最小限に抑えるために、伏在静脈セグメントの操作は、手順全体を通して非常に穏やかである必要があります。血液を除去するためにピペットチップを管腔表面に導入するとき、およびコラゲナーゼ溶液を導入するときは注意が必要です。酵素溶液への曝露は、非ECによる培養物の汚染を減らすために、非常によく制御されるべきである(1時間以内)。成長因子カクテルを添加した特定のEC培地の使用は、hSVEC培養の成長にとって非常に重要です。培養の最初の数日間の追加のヘパリンは、静脈セグメントからの残留赤血球を減らし、平滑筋細胞の増殖を阻害するために重要です15。実験または培養の維持のために細胞を通過させる場合は、必ず40%を超えるコンフルエンスで細胞をプレートしてください。ECは、良好な増殖と生存を確保するために最小限の接触を必要とします。hSVECは、コーティングされていない表面(ゼラチンやフィブロネクチンなど)で簡単に培養できます。ただし、EC抽出後の最初の数日間のコーティングにより、ECの接着性と歩留まりが向上します。hSVECは一定の増殖速度を持ち、間葉系細胞マーカー(SM22やカルポニンなど)を発現することなく、内皮表現型を最大8継代まで維持します。私たちの経験では、増殖速度は組織ドナーによって異なる場合がありますが、細胞継代では異なります。細胞融解後の生存率を高めるために、5%DMSOを含むFBS中のhSVECを凍結保存することが推奨されます。
せん断応力実験を実施するには、考慮すべき重要なステップがあります。システム内部に気泡が発生するのを防ぐために、灌流セットとコネクタは、37°Cおよび5%CO2で一晩平衡化する必要があります。気泡は、システムを通る流れを遮断したり、内皮単層を損傷したりして、細胞の表現型を妨げる可能性があります。細胞をフローチャンバースライドに播種する場合は、4時間後または翌日に使用するためにコンフルエントにすることをお勧めします。さらに、実験が数日間実行される場合は、静的な状態でスライドの媒体を毎日交換する必要があります。フローチャンバースライドの容量は~160 μLであり、長期間の培養で細胞を維持するには不十分です。このシステムには、顕微鏡(明視野/位相差または蛍光顕微鏡用の染色)によって細胞を容易に観察できるという利点があります。制限は、タンパク質(20-25 μg/スライド)およびRNA(1 μg/スライド)の低収率です。これを克服するために、システムは同じ流体ユニットを使用して一連の複数のスライドを接続することを可能にします(製造元の指示を参照)。次いで、1枚のスライドに対する溶解バッファーの容量を使用して、複数のスライドからタンパク質またはRNAを抽出することができる。
ストレッチシステムは取り扱いが簡単で、さまざまな強度や種類のストレッチを適用できます。培養プレートメンブレンとステーション間の摩擦を減らし、周期的なひずみの適切な分布を保証するために、各実験の前にすべてのローディングステーションに注油することが重要です。プレートがベースプレートに完全に密閉されていることを確認して、目的のストレッチに到達するために必要な真空を生成します。等軸刺激は、ウェル内に均一なひずみを生成しません。製造業者によって示されるように、井戸の端にある細胞は捨てられる必要がある。対象となる膜面積は、ローディングステーションの直径と伸び率に基づいて決定されます。メンブレン全体で免疫染色を行ったり、より小さな断片に切断して、アッセイに使用する抗体の量を減らすことができます。この場合、膜は細胞への損傷を避けるために非常に慎重に取り扱われなければならない。研究者はまた、染色中に膜を逆さまにして細胞を失わないように注意する必要があります。光学顕微鏡下で細胞で膜の正しい面を確認することは常に可能です。
このような in vitro 研究の主な制限は、 in vivo 環境を完全に再現していないことです。このため、hSVECがEC表現型(ECマーカーの発現)を維持し、機械的ストレス(F-アクチン配向および機械的応答タンパク質の制御/産生)下で期待される結果を再現することを保証するために、常に分析を行うことが重要です。
要約すると、hSVECを分離し、制御されたレベルのせん断応力と伸張にさらすための詳細な手順を提供します。SV移植片がCABG後に突然動脈状態に曝されると、内皮損傷が起こり、移植片の失敗の一因となります。これらのプロトコルは、機械的な力が静脈移植疾患に関連するhSVEC機能障害にどのように影響するかについての理解を深めるのに役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
JEKは、サンパウロ国立科学財団(FAPESP-INCT-20214/50889-7および2013/17368-0)および国立科学芸術財団CNPq(INCT-465586/2014-7および309179/2013-0)からの助成金によって支援されています。AAMは、サンパウロ国立財団(FAPESP 2015/11139-5)およびコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ-CNPq(ユニバーサル-407911/2021-9)からの助成金によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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