Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65122
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven een protocol om menselijke venaeuze veneuze endotheelcellen (hSVECs) te isoleren en te kweken. We bieden ook gedetailleerde methoden om schuifspanning en rek te produceren om mechanische spanning in hSVECs te bestuderen.

Abstract

Coronaire bypass graft (CABG) chirurgie is een procedure om ischemisch myocardium te revasculariseren. Saphenous ader blijft gebruikt als een CABG-kanaal ondanks de verminderde doorgankelijkheid op lange termijn in vergelijking met arteriële leidingen. De abrupte toename van hemodynamische stress geassocieerd met de graft arterialisatie resulteert in vasculaire schade, vooral het endotheel, die de lage doorgankelijkheid van het saphenous vein graft (SVG) kan beïnvloeden. Hier beschrijven we de isolatie, karakterisering en uitbreiding van menselijke vena-endotheelcellen (hSVECs). Cellen geïsoleerd door collagenasevertering vertonen de typische kasseimorfologie en drukken endotheelcelmarkers CD31 en VE-cadherine uit. Om de mechanische spanningsinvloed te beoordelen, werden in deze studie protocollen gebruikt om de twee belangrijkste fysieke stimuli, schuifspanning en stretch, op gearterialiseerde SVG's te onderzoeken. hSVECs worden gekweekt in een parallelle plaatstroomkamer om schuifspanning te produceren, met uitlijning in de richting van de stroom en verhoogde expressie van KLF2, KLF4 en NOS3. hSVECs kunnen ook worden gekweekt in een siliciummembraan dat gecontroleerde cellulaire stretch mogelijk maakt die veneuze (lage) en arteriële (hoge) rek nabootst. Het F-actinepatroon van endotheelcellen en de secretie van stikstofmonoxide (NO) worden dienovereenkomstig gemoduleerd door de arteriële rek. Samenvattend presenteren we een gedetailleerde methode om hSVECs te isoleren om de invloed van hemodynamische mechanische stress op een endotheelfenotype te bestuderen.

Introduction

Endotheliale cel (EC) disfunctie is een belangrijke speler in saphenous vein graft failure 1,2,3,4. De aanhoudende toename van schuifspanning en cyclische rek induceert het pro-inflammatoire fenotype van menselijke veneuze veneuze endotheelcellen (hSVECs)3,4,5,6. De onderliggende moleculaire routes zijn nog steeds niet volledig begrepen en gestandaardiseerde protocollen voor in vitro studies kunnen de inspanningen voor nieuwe inzichten in het gebied benutten. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om hSVECs te isoleren, te karakteriseren en uit te breiden en hoe ze bloot te stellen aan variabele niveaus van schuifspanning en cyclische rek, waarbij de veneuze en arteriële hemodynamische omstandigheden worden nagebootst.

hSVECs worden geïsoleerd door collagenase-incubatie en kunnen worden gebruikt tot passage 8. Dit protocol vereist minder manipulatie van het vat in vergelijking met de andere beschikbare protocollen7, die besmetting met gladde spiercellen en fibroblasten vermindert. Aan de andere kant vereist het een groter vaatsegment van ten minste 2 cm om een efficiënte EC-extractie te hebben. In de literatuur is gemeld dat EC's uit grote vaten ook kunnen worden verkregen door mechanische verwijdering 7,8. Hoewel effectief, heeft de fysieke aanpak de nadelen van een lage EC-opbrengst en een hogere fibroblastbesmetting. Om de zuiverheid te verhogen, zijn extra stappen nodig met behulp van magnetische kralen of celsortering, waardoor de kosten van het protocol toenemen als gevolg van de verwerving van kralen en antilichamen 7,8. De enzymatische methode heeft snellere en betere resultaten met betrekking tot eg-zuiverheid en levensvatbaarheid 7,8.

De meest gebruikte EC's om endotheeldisfunctie te bestuderen zijn menselijke navelstreng endotheliale cellen (HUVECs). Het is bekend dat het EC-fenotype verandert in verschillende vaatbedden en het is essentieel om methoden te ontwikkelen die het onderzochte vat vertegenwoordigen 9,10. In dit opzicht is de vaststelling van een protocol om een hSVEC te isoleren en te kweken onder mechanische stress een waardevol hulpmiddel om de bijdrage van hSVEC-disfunctie bij adertransplantaatziekte te begrijpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ongebruikte segmenten van saphena-aderen werden verkregen van patiënten die een aortocoronaire bypass-operatie ondergingen aan het Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alle personen gaven geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan de studie, die werd beoordeeld en goedgekeurd door de lokale ethische commissie.

1. Isolatie, kweek en karakterisering van primaire menselijke veneuze ader endotheelcellen (hSVECs)

  1. Voorbereiding
    1. Autoclaaf een paar rechte of gebogen tangen en weefselscharen (7-8 cm).
    2. Bereid steriele gelatine. Meng 0,1 g (0,1% m/v) of 3 g (3% m/v) varkenshuidgelatine met 100 ml ultrapuur water, autoclaaf gedurende 15 min, en bewaar bij 4 °C. Verwarm tot 37 °C om vloeibaar te maken voordat u de celkweekschalen en -dia's bedekt.
    3. Bereid steriel collagenase (1 mg/ml) in de laminaire stroomkap. Verdun het collagenase in PBS en steriliseer het met een filter van 0,2 μm.
    4. Bekleed een celkweekschaal van 60 mm en een schuifplaat met 8 putten gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C met 0,1% m/v gelatine. Verwijder de overtollige gelatine voordat u de cellen zaait.
    5. Maak compleet endotheelcelmedium: endotheelcelgroeibasaal medium (EBM-2) aangevuld met EGM2-groeifactoren.
      OPMERKING: De EGM2-groeifactoren worden als kit geleverd door een bedrijf dat is opgenomen in de materiaaltabel. De concentratie van de factoren wordt niet bekendgemaakt door de onderneming.
    6. Maak 2% en 5% runderserumalbumine (BSA), 4% paraformaldehyde (PFA) en 0,1% Triton X-100-oplossingen, allemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Isolatie en cultuur van hSVECs
    1. Verzamel ten minste een 2-3 cm lang venadelsegment voor deze procedure.
      NOTITIE. Alle celkweekprocedures moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden en in een laminaire stroomkap.
    2. Breng het adersegment over in een petrischaaltje gevuld met voorverwarmd PBS. Plaats een pipetpunt in het ene uiteinde van de ader en spoel voorzichtig met PBS om al het bloed in het lumen te verwijderen. Spoel het door totdat de wasstroom volledig helder is.
    3. Sluit een van de uiteinden van de ader met een steriele katoenen hechting. Vul het vat voorzichtig met 1 mg/ml collagenase type II oplossing. Sluit het andere uiteinde van het vat met een katoenen hechtdraad (figuur 1A). Incubeer het vat met collagenase-oplossing in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C gedurende 1 uur.
    4. Snijd daarna een van de uiteinden van het vat in een buis van 15 ml en verzamel de collagenase-oplossing. Snijd het andere uiteinde en spoel het luminale oppervlak met 1-2 ml PBS om alle losgemaakte EC's te verzamelen. Plaats alle PBS samen met collagenase-oplossing in dezelfde buis.
    5. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om de cellen te pelleteren.
      NOTITIE. De celkorrel is erg klein en moeilijk te visualiseren. Als het bloed niet volledig is verwijderd vóór de collagenasebehandeling (stap 1.2.2.), zullen de bloedcellen ook neerslaan en zal de pellet roodachtig zijn.
    6. Verwijder het supernatant en resuspensie van de celpellet in 3-4 ml volledig endotheelcelmedium (EBM-2 aangevuld met EGM2-groeifactoren) en een extra heparineoplossing (5 U/ml, eindconcentratie). Plaats de cellen in een celkweekschaal van 60 mm die is voorgecoat met 3% m/v gelatine.
      OPMERKING: Gelatine was de eerste keuze vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid en lage kosten. Omdat de coating met gelatine het EC-fenotype met succes handhaaft, werd geen andere coatingsubstantie getest. Collageen en fibronectine kunnen worden getest in studies die gericht zijn op het onderzoeken van de invloed van verschillende extracellulaire matrixcomponenten op EC-adhesie en het fenotype.
    7. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 4 dagen zonder het medium te veranderen. Verander daarna om de dag van media. Vanaf dit moment is de extra suppletie met heparine niet meer nodig. Onderzoek de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de rode bloedcellen zijn verwijderd.
    8. Na 3-10 dagen na extractie, afhankelijk van de grootte en diameter van het adersegment, visualiseert u de hSVECs door fasecontrastmicroscopie.
    9. Evalueer de mate van samenvloeiing en hun kasseimorfologie in fasecontrastmicroscopie.
    10. Blijf de media om de 2 dagen veranderen totdat de cellen 70% -80% confluency bereiken.
    11. Passeer de hSVECs met 0,25% trypsine-0,02% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing.
      1. Was de cellen met voorverwarmde PBS.
      2. Voeg 1 ml trypsine-EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal van 60 mm. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat alle cellen zijn losgemaakt.
      3. Voeg 2 ml volledig endotheelcelmedium toe om het trypsine te inactiveren.
      4. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij RT op 300 x g .
      5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 1 ml kweekmedium.
      6. Tel de celsuspensie in 1:1 trypan blauw (0,4%) tot de plaat levensvatbare cellen.
      7. Om de cultuur uit te breiden, plaatst u de cellen in een celkweekschaal van 100 mm met 10 ml voorverwarmd volledig endotheelcelmedium en kweekt u deze bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
        NOTITIE. Gemiddeld zal het zaaien van 4 x 104 hSVEC/cm2 na 48 uur 100% confluent zijn.
    12. Om de cellen te cryopreserveren, resuspensie de pellet van stap 1.2.11.5 in 5% dimethylsulfoxide (DMSO) in foetaal runderserum (FBS) en opslaan in vloeibare stikstof.
  3. Karakterisering van hSVECs: Flowcytometriekleuring voor CD31
    1. Breng 1 x 10 5 hSVECs over in één buis van1,5 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij RT bij 300 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 100 μL PBS met 2% BSA en CD31-FITC monoklonaal antilichaam (1:100).
    2. Bevlek de cellen gedurende 30 minuten bij RT in het donker.
    3. Was de gekleurde cellen door 0,5 ml PBS toe te voegen en centrifugeer ze op 300 x g gedurende 3 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celpellet in 400 μL PBS met 2% BSA.
    4. Gebruik ongelabelde hSVECs, zonder CD31-antilichaam, als negatieve controle.
    5. Ga verder met flowcytometeracquisitieanalyse met behulp van een blauwe laser en FITC-kanaal (excitatie / emissie max [Ex / Em] van 498 / 517 nm). Als andere fluorchromen worden gebruikt, controleer dan of de cytometer geschikte filtersets heeft voor hun detectie. Scheid de cellen van puin in de functie van hun grootte en granulariteit en sluit vervolgens enkele cellen af door voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing.
  4. Karakterisering van hSVECs: Fluorescerende kleuring voor CD31 en VE-cadherine
    1. Plaat 0,1 x 105 cellen in de gelatine-gecoate 8-well kamerschuif. Incubeer de cellen gedurende een nacht bij 37 °C, 5 % CO2, zodat de cellen zich aan het kweekoppervlak kunnen hechten.
    2. Verwijder het medium en was de cellen eenmaal met PBS.
    3. Voeg 0,3 ml / put van 4% PFA toe om de cellen te fixeren. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    4. Was drie keer met PBS.
    5. Voeg 0,3 ml / put van 0,1% Triton X-100-oplossing toe om de cellen te permeabiliseren. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    6. Was drie keer met PBS.
    7. Om niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen te blokkeren, voegt u 0,3 ml / put van 5% BSA-oplossing toe aan de cellen. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    8. Was drie keer met PBS.
    9. Incubeer de cellen met de primaire antilichamen (CD31 en VE-cadherine, 1:100) verdund in PBS met 2% BSA gedurende de nacht met zacht schommelen bij 4 °C. Laat één goed incuberen met PBS met 2% BSA (geen primair antilichaam) als negatieve controle.
    10. Was drie keer met PBS.
    11. Incubeer de cellen met fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen verdund (1:500) in PBS gedurende 1 uur bij RT. Voeg 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe voor nucleaire kleuring tot een eindconcentratie van 1 mg / ml.
    12. Was drie keer met PBS.
    13. Verwijder de mediakamer met het scheidingsteken. Plaats één druppel van het montagemediumreagens (50% glycerol in PBS) en plaats een glasplaat (24 mm x 60 mm) terwijl u voorkomt dat er bubbels worden gevangen.
    14. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: DAPI wordt gedetecteerd met een DAPI-lichtkubus (bijvoorbeeld: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), en CD31/VE-cadherine wordt gedetecteerd met behulp van een groen fluorescerend eiwit (GFP) lichtkubus (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lichtkubussen met een vergelijkbaar excitatie/emissiegolflengtebereik zijn ook voldoende voor deze fluorochromen. Als andere fluorchromen worden gebruikt, controleer dan of de gebruikte microscoop geschikte filtersets heeft voor hun detectie.

2. Schuifspanning op hSVECs

  1. Voorbereiding
    1. Bedek de schuifschuif van de stromingskamer met 0,1% m/v gelatine gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C. Verwijder overtollige gelatine voordat u de cellen zaait.
    2. Breng de vloeistofeenheid en steriele perfusieset in evenwicht met reservoirs van 10 ml 's nachts in de incubator in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C.
  2. Schuifspanningsexperiment
    1. Zaai 2 x 105 EC's gesuspendeerd in 100 μL EC medium in de gelatine-gecoate stroomkamerschuif. Incubeer de cellen gedurende 4 uur bij 37 °C en 5% CO2 om de cellen aan het kweekoppervlak te laten hechten.
    2. Plaats de perfusieset op de vloeistofeenheid zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Vul de reservoirs en de perfusie in ongeveer 12 ml voorverwarmd volledig endotheelcelmedium. Verwijder handmatig luchtbellen uit de perfusieset om het niveau van beide reservoirs op 5 ml in evenwicht te brengen.
    3. Plaats de vloeistofeenheid met de gemonteerde perfusieset, zonder de kamerschuif, in de incubator en sluit de elektrische kabel aan op de computergestuurde pomp. Verwijder alle luchtbellen uit de reservoirs en perfusieset en voer een vooraf gedefinieerd protocol uit in de pompbesturingssoftware.
      NOTITIE. Het is erg belangrijk om luchtbellen te verwijderen om het systeem correct te laten functioneren.
    4. Neem de fluidic unit met de gemonteerde perfusieset op de laminaire flowkap en bevestig de dia's met een confluente cel monolaag.
    5. Plaats de vloeistofeenheid met de gemonteerde perfusie en schuift met cellen in de incubator en sluit de elektrische kabel aan op de pomp.
    6. Stel in de pompbesturingssoftware de volgende parameters in: viscositeit van het medium (0,0072), type dia, kalibratiefactor van de perfusieset, afschuifspanningssnelheid (20 dyn/cm2), type debiet (unidirectioneel) en tijd (72 uur) en start de stroom (zie de instructies van de apparatuur voor meer informatie). Oogst de cellen die zijn behandeld met dezelfde media zonder blootstelling aan stroming als statische controles.
    7. Nadat de stimulus is voltooid, wast u de cellen eenmaal met PBS en gaat u verder met het oogsten van de monsters volgens de vereiste test. Voor fluorescerende kleuring, zie stap 2.3.1, en voor RNA-extractie, zie stap 2.3.2.
  3. Demonstratie van de effectiviteit van het schuifspanningsprotocol
    1. Fluorescerende kleuring van actinefilamenten (F-actine)
      1. Fixeer en permeabiliseer de cellen zoals aangegeven in de stappen 1.4.2-1.4.6. Gebruik een volume van 100 μL in de μ-slide.
      2. Kleur de F-actine met fluorescerend gelabeld falloïdine (verdund bij 1:200 in PBS) en contrakleur de kern met DAPI (eindconcentratie van 1 mg / ml in PBS) gedurende 2 uur bij RT, beschermd tegen licht.
      3. Was drie keer met PBS.
      4. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
        OPMERKING: DAPI wordt gedetecteerd met een DAPI-lichtkubus (bijvoorbeeld: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) en falloidine wordt gedetecteerd met een GFP-lichtkubus (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lichtkubussen met een vergelijkbaar bereik van excitatie/emissiegolflengte zijn ook voldoende voor deze fluorochromen. Als andere fluorchromen worden gebruikt, controleer dan of de gebruikte microscoop geschikte filtersets heeft voor hun detectie.
    2. Genexpressie door real-time kwantitatieve reverse transcriptie (RT-qPCR)
      1. Verzamel de cellen van de μ-slide met 350 μL van een commerciële guanidine-thiocyanaat-bevattende lysisbuffer. Isoleer het totale RNA met op kolommen gebaseerde extractiekits, volgens de instructies van de fabrikant.
        OPMERKING: Vanwege het beperkte aantal cellen dat in de μ-slide is gekweekt, wordt het gebruik van kolomgebaseerde extractie van RNA aanbevolen.
      2. Bereid cDNA voor met behulp van een cDNA-synthesekit met transcriptase reverse enzym, volgens de instructies van de fabrikant.
      3. Controleer de expressie van de genen gereguleerd door schuifspanning: KLF2, KLF4 en NOS3. Gebruik het huishoudstergen PPIA/cyclofiline om de resultaten te normaliseren. De specifieke primers voor de reactie staan vermeld in tabel 1.
      4. Voer RT-qPCR uit met behulp van een SYBR groene fluorescerende DNA-kleurkit onder de volgende reactieomstandigheden: i) 50 °C gedurende 2 minuten, ii) 95 °C gedurende 15 minuten, iii) 94 °C gedurende 15 s, iv) 60 °C gedurende 30 s, v) 72 °C gedurende 30 s. Herhaal stap iii tot en met v gedurende 40 cycli. Voeg aan het einde van de reactie een smeltstap toe om de specificiteit van de primer te controleren.

3. Cyclische rek op hSVECs

  1. Voorbereiding
    1. Breng glijmiddel op siliconenbasis aan op de boven- en zijkanten van het 6-well equibiaxial laadstation van 25 mm.
      OPMERKING: Dit vermindert de wrijving tussen het membraan van de kweekplaat en het station, waardoor een betere verdeling van de cyclische spanning mogelijk is. Deze stap moet vóór elk experiment worden uitgevoerd.
  2. Cyclisch rekexperiment
    1. Zaad 4 x 105 cellen gesuspendeerd in 3 ml aan elke put van de 6-well flexible-bottomed kweekplaten bedekt met collageen I (Table of Materials). Plan om een plaat (en) in statische toestand te hebben als een controlegroep. Bewaar de cellen in de incubator (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2) totdat ze 100% confluentie bereiken (meestal 48 uur na het zaaien). Was vóór het begin van het rekprotocol de cellen eenmaal met voorverwarmde PBS en voeg 3 ml vers kweekmedium per put toe.
    2. Plaats de bodemplaat met alle gesmeerde laadstations in de incubator en sluit de slang op de juiste manier aan op de controllerapparatuur van het bi-bioreactorsysteem voor spanningscellen (zie de instructies voor de apparatuur voor meer informatie).
    3. Bevestig elke kweekplaat aan één rode pakking, geleverd door het spanningscel uitrekkende bioreactorsysteem. Plaats ze vervolgens in de bodemplaat in de couveuse.
      1. Zorg ervoor dat de platen volledig zitten, geperst en afgedicht zijn op de bodemplaat om te voorkomen dat er lucht lekt tijdens het vacuümpompen. Het is belangrijk om alle vier de kweekplaten in de grondplaat te hebben om het juiste vacuüm en de rekbelasting te hebben.
      2. In het geval van minder experimentele platen, gebruik dan een lege plaat (en) om de vier posities in de basisplaat te voltooien. Voeg de acrylplaat (meegeleverd met de apparatuur) toe aan de kweekplaten om de afdichting van de basisplaat te verbeteren. Plaats de statische platen in dezelfde incubator.
    4. Schakel de controllerapparatuur en het computersysteem in. Open het softwarepictogram en configureer het gewenste regime: grootte van het te gebruiken laadstation, type spanning, rekpercentage, golfvormvorm, frequentie en tijd. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor gedetailleerde informatie. Selecteer en download het regime. Hier werd het volgende regime gebruikt: 1/2 sinusgolfvormvorm, 1 Hz-frequentie, 5% rek (om veneuze rek na te bootsen) en 15% rek (om arteriële rek na te bootsen) tot 72 uur.
    5. Schakel het vacuümsysteem in en klik op Start op het computerscherm om het uitrekken uit te voeren. Controleer of het siliconenmembraan de cellen beweegt en uitrekt.
    6. Nadat de stimulus is voltooid, wast u de cellen eenmaal met PBS en gaat u verder met het oogsten van de monsters volgens de vereiste test. Hier, om de effectiviteit van cyclische stretch aan te tonen, verzamelt u het hSVEC-kweekmedium, houdt u het op -80 ° C voor verdere meting van stikstofmonoxide (NO) en fixeert u de cellen voor fluorescerende kleuring.
      NOTITIE. De bodemplaat kan niet in de incubator worden opgeslagen wanneer deze niet in gebruik is; Anders kan de temperatuur de platte vorm wijzigen en nutteloos maken.
  3. Demonstratie van de effectiviteit van het cyclische rekprotocol
    1. Fluorescerende kleuring van F-actine
      1. Corrigeer de cellen zoals aangegeven in stap 1.4.3. Gebruik een volume van 1 ml per put.
      2. Was de cellen drie keer met PBS. Houd de cellen in PBS zodat ze niet drogen terwijl u het siliconenmembraan voorbereidt op de volgende stappen.
      3. Gebruik een wattenstaafje om het overtollige glijmiddel op siliconenbasis van de onderkant van het membraan te verwijderen. Breng vervolgens voorzichtig glazenwasser of handzeep aan met een nieuw wattenstaafje. Herhaal het proces totdat al het smeermiddel uit het membraan is verwijderd. Reinig vervolgens met gedeïoniseerd water.
        NOTITIE. Het is belangrijk om het smeermiddel volledig uit het siliconenmembraan te verwijderen om microscopiebeelden van goede kwaliteit te hebben.
      4. Snijd de siliconenmembranen voorzichtig in kleine stukjes om op 8-well kamerglaasjes te passen voor kleuring. Permeabiliseer de cellen zoals aangegeven in stap 1.4.5.
      5. Na de wasstappen kleurt u de F-actine met falloidine en de kern met DAPI. Ga verder met de analyse, zoals aangegeven in de stappen 2.3.1.2 en 2.3.1.3. Gebruik een volume van 0,3 ml per kamer put.
      6. Verwijder de mediakamer met het scheidingsteken. Plaats één druppel montagemediumreagens (50% glycerol in PBS) en plaats een glasplaat (24 mm x 60 mm).
      7. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop.
        OPMERKING: DAPI wordt gedetecteerd met een DAPI-lichtkubus (bijvoorbeeld: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) en falloidine wordt gedetecteerd met een rood fluorescerend eiwit (RFP) lichtkubus (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Lichtkubussen met een vergelijkbaar bereik van excitatie/emissiegolflengte zijn ook voldoende voor deze fluorochromen. Als andere fluorchromen worden gebruikt, controleer dan of de gebruikte microscoop geschikte filtersets heeft voor hun detectie.
    2. NO meting - geschat door de nitriet (NO2) accumulatie in het hSVEC geconditioneerde medium met behulp van een kaliumjodide-gebaseerde reductieve chemiluminescentietest
      1. Voorbereiding
        1. Bereid een standaardcurve van 0,01-10 mM natriumnitriet (NaNO2 in ultrapuur water) oplossing.
        2. Voeg 5 ml azijnzuur en 1 ml kaliumjodide (50 mg in 1 ml ultrapuur water) toe aan het spoelvat van de stikstofmonoxideanalysator.
      2. GEEN meting
        1. Voeg 20 μL van de NaNO2-standaardcurve toe aan het zuiveringsvat van de stikstofmonoxideanalysator. Meet het volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Voeg 20 μL van het geconditioneerde medium toe aan het zuiveringsvat van de stikstofmonoxideanalysator. Meet het volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Bereken de NO2-concentraties op basis van de standaardcurvekalibratie. Pas de waarden aan die worden verkregen door het totale volume van het geanalyseerde geconditioneerde medium 6,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Meestal kunnen aangehechte EC's 3-4 dagen na extractie worden waargenomen. hSVECs vormen aanvankelijk clusters van cellen en vertonen een typische "kassei" morfologie (figuur 1B). Ze drukken de EG-markers CD31 (figuur 1C,D) en VE-cadherine (figuur 1D) uit. hSVECs kunnen gemakkelijk worden vermeerderd op een niet-gecoate behandelde celkweekschaal en ze behouden het endotheelfenotype in cultuur tot acht passages.

hSVECs, wanneer gekweekt onder schuifspanning, uitlijnen in de richting van de stroom (figuur 2A). De schuifspanning van 20 dyn/cm2 gedurende 72 uur induceert de expressie van typische mechanosensitieve genen, KLF2, KLF4 en NOS3, wat de effectiviteit van de schuifprikkel in hSVECs aangeeft (figuur 2B)12,13,14.

De cyclische rekuitkomst is afhankelijk van de intensiteit die wordt toegepast op de hSVECs. Cellen onder lage rek vertonen een corticale F-actinepatroon vergelijkbaar met statische cellen (figuur 3A), zonder verandering in de NO-afgifte tot 72 uur (figuur 3B). Arteriële niveaus van stretch hermodelleren het actine cytoskelet na 24 uur (figuur 3A) en verminderen de NO-afgifte na 72 uur (figuur 3B).

Figure 1
Figuur 1: Endotheelcellen uit menselijke venen (hSVECs) vertonen typische endotheelmorfologie en specifieke EC-merkexpressie . (A) Saphenous vein segment vervuld met type II collagenase-oplossing voor de extractie van EC's. (B) Representatief tijdsverloop van hSVEC-groei na extractie. Na 3-4 dagen is het mogelijk om clusters van cellen te visualiseren die zich vermenigvuldigen totdat ze samenvloeiing bereiken. Schaalbalk = 100 μm. (C) FACS-analyse van gekweekte hSVECs bij passage 1. De groene lijn geeft aan dat 99,7% van de celpopulatie positief is voor de endotheelspecifieke marker CD31. De zwarte lijn is de negatieve controle. (D) Immunokleuring voor CD31 (groen), (E) VE-cadherine (groen) en nuclei DAPI (blauw) in hSVECs bij passage 1. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: hSVECs worden uitgelijnd in de stroomrichting en brengen mechanosensitieve genen tot expressie bij blootstelling aan unidirectionele schuifspanning. Confluente cel monolaag van hSVECs gekweekt onder statische of unidirectionele laminaire schuifspanningsomstandigheden. (A) Fasecontrastbeelden (boven) en falloidinekleuring (onder) van hSVECs blootgesteld aan een schuifspanning van 20 dyn/cm2 gedurende 72 uur. Groen: actinefilamenten; blauw: celkernen. Schaalbalk = 100 μm (fasecontrast) en 20 μm (fluorescentie). (B) Genexpressie van KLF2, KLF4 en NOS3 bepaald door qRT-PCR. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. ** p < 0,01 ten opzichte van de statische groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Het hSVEC-fenotype onder cyclische rek is afhankelijk van de toegepaste intensiteit. (A) Confluente celmonolaag van hSVECs gekweekt onder statische, lage (veneuze) of hoge (arteriële) rek in een flexibele bodemplaat gedurende 24 uur. Fasecontrastbeelden (boven) en falloidinekleuring (onder) met de actinevezels (rood) en kernen met DAPI (blauw). Schaalbalk = 100 μm (fasecontrast) en 50 μm (fluorescentie). (B) Er werd geen meting geschat op basis van no 2-accumulatie in de celkweekmedia gedurende 72 uur. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. *** p < 0,001 ten opzichte van de statische groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gen Eiwit Voorwaarts 5'-3' Achteruit 5'-3'
Klf2 Krüppel-achtige Factor 2 CCACTCACACCTGCAGCTA GTGGTAGGGCTTCTCACCTG
Klf4 Kruppel-achtige Factor 4 CACCTGGCGAGTCTGACATG CAGCGGTTATTCGGGGCAC
NOS3 Stikstofmonoxidesynthase, endotheel GCACAGTTACCAGCTAGCCA GCCGGGGACAGGAAATAGTT
Ppia Cyclofiline A, CATTTGGTGCAAGGGTCACA TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
Peptidylprolyl isomerase A

Tabel 1: qRT-PCR primers voor schuifspanning en referentiegenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het venadelensegment van de saphena moet minstens 2 cm zijn om hSVECs met succes te isoleren. Kleine segmenten zijn moeilijk te hanteren en binden de uiteinden van het vat om de collagenase-oplossing te behouden om de cellen te isoleren. Het verminderde luminale oppervlak levert niet voldoende cellen op om de cultuur uit te breiden. Om het risico op besmetting met niet-EC's te minimaliseren, moet de manipulatie van het venadelensegment van het saphenous tijdens de hele procedure zeer voorzichtig zijn. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het inbrengen van de pipetpunten in de luminale oppervlakken om bloed te verwijderen en tijdens de introductie van de collagenase-oplossing. De blootstelling aan enzymoplossing moet zeer goed worden gecontroleerd (niet langer dan 1 uur) om de besmetting van de cultuur met niet-EC's te verminderen. Het gebruik van een specifiek EC-medium aangevuld met de groeifactorencocktail is cruciaal voor de groei van de hSVEC-cultuur. De extra heparine tijdens de eerste dagen van de kweek is belangrijk om resterende rode bloedcellen uit het adersegment te verminderen en om de proliferatie van gladde spiercellen te remmen15. Wanneer u de cellen passeert voor experimenten of voor het onderhoud van de cultuur, zorg er dan voor dat u de cellen bedekt met een samenvloeiing van meer dan 40%. De EC's hebben minimaal contact nodig om een goede proliferatie en overleving te garanderen. De hSVECs kunnen gemakkelijk worden gekweekt op een niet-gecoat (bijv. Gelatine of fibronectine) oppervlak. De coating tijdens de eerste dagen na EC-extractie zal echter de EC-hechting en -opbrengst verhogen. De hSVECs hebben een constante proliferatiesnelheid en handhaven het endotheelfenotype tot acht passages, zonder mesenchymale celmarkers (zoals SM22 en calponine) tot expressie te brengen. In onze ervaring kan de proliferatiesnelheid variëren afhankelijk van de weefseldonor, maar niet met een celpassage. Het wordt aanbevolen om hSVECs in FBS te cryopreserveren met 5% DMSO om de levensvatbaarheid na het ontdooien van de cellen te vergroten.

Om een schuifspanningsexperiment uit te voeren, zijn er kritieke stappen die moeten worden overwogen. Om te voorkomen dat er luchtbellen in het systeem ontstaan, moeten de perfusieset en connectoren 's nachts worden gebalanceerd bij 37 °C en 5% CO2. De bellen kunnen de stroom door het systeem blokkeren of de endotheelmonolaag beschadigen die het celfenotype verstoort. Bij het zaaien van de cellen in de stroomkamerschuif, wordt aanbevolen om het na 4 uur of de volgende dag te laten samenvloeien. Bovendien is het verplicht om het medium van de dia elke dag onder statische omstandigheden te veranderen als het experiment meerdere dagen duurt. Het volume van de stroomkamerschuif is ~ 160 μL en het is niet voldoende om de cellen gedurende lange perioden van cultuur te onderhouden. Het systeem heeft het voordeel dat het de cellen gemakkelijk kan observeren door microscopie (brightfield/fasecontrast of kleuring voor fluorescentiemicroscopie). De beperking is de lage opbrengst van eiwitten (20-25 μg/slide) en RNA (1 μg/slide). Om dit te ondervangen, maakt het systeem de aansluiting van verschillende dia's in een serie mogelijk met dezelfde vloeistofeenheid (zie de instructies van de fabrikant). Vervolgens is het mogelijk om het volume van de lysisbuffer voor één dia te gebruiken om het eiwit of RNA uit verschillende dia's te extraheren.

Het stretchsysteem is gemakkelijk te hanteren en maakt de toepassing van verschillende intensiteiten en soorten stretching mogelijk. Het is belangrijk om alle laadstations vóór elk experiment te smeren om de wrijving tussen het kweekplaatmembraan en het station te verminderen en een goede verdeling van de cyclische spanning te garanderen. Zorg ervoor dat de platen volledig zijn afgedicht op de bodemplaat om het vacuüm te produceren dat nodig is om de gewenste rek te bereiken. De equiaxiale stimulus produceert geen uniforme spanning in de put. De cellen aan de rand van de put moeten worden weggegooid, zoals aangegeven door de fabrikant. Het membraangebied wordt bepaald op basis van de diameter van het laadstation en het percentage rek. Het is mogelijk om de immunostaining in het hele membraan uit te voeren of in kleinere stukjes te snijden om de hoeveelheid antilichamen die in de test worden gebruikt te verminderen. In dit geval moeten de membranen zeer voorzichtig worden behandeld, waardoor schade aan de cellen wordt voorkomen. Onderzoekers moeten er ook voor zorgen dat ze het membraan niet ondersteboven draaien en de cellen verliezen tijdens het kleuren. Het is altijd mogelijk om het juiste gezicht van het membraan te bevestigen met de cellen onder optische microscopie.

De belangrijkste beperking van in vitro studies zoals deze is dat ze de in vivo omgeving niet volledig samenvatten. Om deze reden is het belangrijk om altijd een analyse uit te voeren om ervoor te zorgen dat hSVECs het EC-fenotype behouden (EC-markers tot expressie brengen) en verwachte resultaten reproduceren onder mechanische stress (F-actineoriëntatie en regulatie / productie van mechanische responseiwitten).

Samenvattend bieden we een gedetailleerde procedure om hSVECs te isoleren en bloot te stellen aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek. Wanneer een SV-transplantaat na CABG plotseling wordt blootgesteld aan arteriële aandoeningen, treedt endotheelschade op en draagt bij aan transplantaatfalen. Deze protocollen kunnen een belangrijke rol spelen bij het bevorderen van ons begrip van hoe mechanische krachten hSVEC-disfunctie beïnvloeden die verband houdt met adertransplantaatziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

JEK wordt ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 en 2013/17368-0] en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 en 309179/2013-0). AAM wordt ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution Gibco 25200072
15 µ slide I 0.4 Luer  Ibidi 80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) Thermo Fisher Scientific D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm  Flexcell International Corporation LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well Thermo Fisher Scientific 154453
Acetic Acid (Glacial) Millipore 100063
Acrylic sheet 1 cm thick Plexiglass
Anti-CD31 antibody Abcam ab24590
Anti-CD31, FITC antibody Thermo Fisher Scientific MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody Cell Signaling 2500
Bioflex plates collagen I Flexcell International Corporation BF3001C
Bovine serum albumin solution Sigma-Aldrich A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm Brasuture AP524
Cyclophilin forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Cyclophilin reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
EBM-2 basal medium Lonza CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements Lonza CC4176
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 2657-029
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma-Aldrich F4680
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G2500
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL Blau Farmacêutica SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) Ibidi 10902
KLF2 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF2 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
KLF4 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer Sievers Instruments NOA-280i-1
NOS3 forward primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
NOS3 reverse primer Thermo Fisher Scientific Custom designed
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs Ibidi 10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010031
Potassium Iodide Sigma-Aldrich 221945
QuanTitec SYBR green PCR kit Qiagen 204143
QuantStudio 12K flex platform  Applied Biosystems 4471087
RNeasy micro kit  Quiagen 74004
Slide glass (24 mm x 60 mm) Knittel Glass VD12460Y1D.01
Sodium nitrite Sigma-Aldrich 31443
SuperScript IV first-strand synthesis system Thermo Fisher Scientific 18091200
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypan blue stain 0.4% Gibco 15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C6885

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 194
Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Girão-Silva, T.,… More

Girão-Silva, T., Fonseca-Alaniz, M. H., Oliveira Dallan, L. A., Valãdao, I. C., Oliveira da Rocha, G. H., Krieger, J. E., Miyakawa, A. A. Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch. J. Vis. Exp. (194), e65122, doi:10.3791/65122 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter