Summary
우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.
Abstract
관상동맥우회술(CABG) 수술은 허혈성 심근을 혈관재생시키는 절차입니다. 복재 정맥은 동맥 도관에 비해 감소된 장기 개통성에도 불구하고 CABG 도관으로 계속 사용됩니다. 이식편 동맥화와 관련된 혈역학적 스트레스의 급격한 증가는 복재 정맥 이식편(SVG)의 낮은 개통성에 영향을 미칠 수 있는 혈관 손상, 특히 내피를 초래합니다. 여기에서 우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 특성화 및 확장에 대해 설명합니다. 콜라게나제 분해에 의해 분리된 세포는 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 내피 세포 마커인 CD31 및 VE-cadherin을 발현합니다. 기계적 응력 영향을 평가하기 위해 이 연구에서 동맥화된 SVG에 대한 두 가지 주요 물리적 자극인 전단 응력과 스트레치를 조사하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. hSVEC는 평행판 유동 챔버에서 배양되어 전단 응력을 생성하여 유동 방향으로의 정렬과 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현 증가를 보여줍니다. hSVEC는 또한 정맥(저) 및 동맥(고) 스트레칭을 모방하여 제어된 세포 스트레치를 허용하는 실리콘 멤브레인에서 배양될 수 있습니다. 내피 세포의 F-액틴 패턴과 산화질소(NO) 분비는 동맥 스트레칭에 의해 그에 따라 조절됩니다. 요약하면, 우리는 내피 표현형에 대한 혈역학적 기계적 스트레스의 영향을 연구하기 위해 hSVEC를 분리하는 자세한 방법을 제시합니다.
Introduction
내피 세포 (EC) 기능 장애는 복재 정맥 이식 실패 1,2,3,4에서 핵심적인 역할을 한다. 전단 응력과 주기적 스트레칭의 지속적인 증가는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 전염증 표현형을 유도합니다3,4,5,6. 기본 분자 경로는 아직 완전히 이해되지 않았으며 시험관 내 연구를 위한 표준화된 프로토콜은 해당 분야의 새로운 통찰력을 위한 노력을 활용할 수 있습니다. 여기에서는 hSVEC를 분리, 특성화 및 확장하는 간단한 프로토콜과 정맥 및 동맥 혈역학적 조건을 모방하여 다양한 수준의 전단 응력 및 주기적 스트레치에 hSVEC를 노출시키는 방법을 설명합니다.
hSVEC는 콜라게나제 배양에 의해 분리되며 계대 8까지 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이용가능한 다른 프로토콜7에 비해 혈관 조작이 덜 필요하며, 이는 평활근 세포 및 섬유아세포에 의한 오염을 감소시킨다. 반면에 효율적인 EC 추출을 위해서는 최소 2cm의 더 큰 용기 세그먼트가 필요합니다. 문헌에서, 대형 용기로부터의 EC는 또한 기계적 제거에 의해서도 얻어질 수 있다고 보고되었다 7,8. 효과적이기는 하지만, 물리적 접근법은 낮은 EC 수율 및 더 높은 섬유아세포 오염의 단점을 갖는다. 순도를 높이려면 마그네틱 비드 또는 세포 분류를 사용하는 추가 단계가 필요하며, 비드 및 항체 획득으로 인한 프로토콜 비용이 증가합니다 7,8. 효소 방법은 EC 순도 및 생존력과 관련하여 더 빠르고 더 나은 결과를 나타냅니다 7,8.
내피 기능 장애를 연구하기 위해 가장 자주 사용되는 EC는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)입니다. EC 표현형은 상이한 혈관 층에서 변화하는 것으로 알려져 있으며, 조사중인 혈관을 나타내는 방법을 개발하는 것이 필수적이다 9,10. 이와 관련하여, hSVEC를 분리하고 기계적 스트레스 하에서 배양하기 위한 프로토콜의 확립은 정맥 이식 질환에서 hSVEC 기능 장애의 기여를 이해하는 데 유용한 도구입니다.
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Protocol
상파울루 의과대학 심장연구소(InCor)에서 대동맥관상동맥우회술을 받은 환자로부터 복재정맥의 미사용 부분을 채취하였다. 모든 개인은 지역 윤리 위원회에서 검토하고 승인한 연구 참여에 대해 정보에 입각한 동의를 했습니다.
1. 일차 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 배양 및 특성화
- 준비
- 한 쌍의 직선 또는 곡선 집게와 조직 가위 (7-8cm)를 오토 클레이브하십시오.
- 멸균 젤라틴을 준비하십시오. 돼지 껍질 젤라틴 0.1g(0.1% w/v) 또는 3g(3% w/v)을 초순수 100mL와 혼합하고 15분 동안 오토클레이브한 후 4°C에서 보관합니다. 세포 배양 접시 및 슬라이드를 코팅하기 전에 37°C로 가온하여 액화시킨다.
- 층류 후드 내부에 멸균 콜라게나제(1mg/mL)를 준비합니다. 콜라게나아제를 PBS에 희석하고 0.2μm 필터로 멸균한다.
- 60mm 세포 배양 접시와 8웰 챔버 슬라이드를 0.1% w/v 젤라틴으로 37°C에서 최소 30분 동안 코팅합니다. 세포를 파종하기 전에 과도한 젤라틴을 제거하십시오.
- 완전한 내피 세포 배지 준비: EGM2 성장 인자로 보충된 내피 세포 성장 기본 배지(EBM-2).
참고: EGM2 성장 인자는 재료 표에 나열된 회사에서 키트로 제공합니다. 요인의 농도는 회사에서 공개하지 않습니다. - 2% 및 5% 소 혈청 알부민(BSA), 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 0.1% 트리톤 X-100 용액을 모두 인산염 완충 식염수(PBS)로 만듭니다.
- hSVEC의 분리 및 배양
- 이 절차를 위해 최소 2-3cm 길이의 복재 정맥 세그먼트를 수집하십시오.
메모. 모든 세포 배양 절차는 멸균 조건 및 층류 후드 내부에서 수행되어야 합니다. - 정맥 세그먼트를 미리 예열된 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 피펫 팁을 정맥의 한쪽 끝에 삽입하고 PBS로 부드럽게 씻어내어 내강 내부의 모든 혈액을 제거합니다. 세탁 흐름이 완전히 깨끗해질 때까지 세척하십시오.
- 멸균 면봉사로 정맥 끝 중 하나를 닫습니다. 용기를 1mg/mL 콜라게나제 유형 II 용액으로 조심스럽게 채웁니다. 면봉합사로 용기의 다른 쪽 끝을 닫습니다(그림 1A). 용기를 콜라게나제 용액과 함께 37°C에서 37°C의 가습된분위기에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
- 그 후, 15 mL 튜브 안에 용기의 끝 중 하나를 자르고 콜라게나제 용액을 수집하십시오. 다른 쪽 끝을 자르고 1-2mL의 PBS로 내강 표면을 플러시하여 분리된 EC를 모두 수집합니다. 모든 PBS를 콜라게나제 용액과 함께 동일한 튜브 안에 넣습니다.
- 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 400 x g 로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
메모. 세포 펠릿은 매우 작아서 시각화하기 어렵습니다. 콜라게나제 처리 전에 혈액이 완전히 제거되지 않으면(단계 1.2.2.), 혈액 세포도 침전되고 펠릿은 붉어질 것입니다. - 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 3-4mL의 완전 내피 세포 배지(EGM2 성장 인자로 보충된 EBM-2)와 추가 헤파린 용액(5U/mL, 최종 농도)에 재현탁합니다. 3% w/v 젤라틴으로 미리 코팅된 60mm 세포 배양 접시에 세포를 플레이트합니다.
참고: 젤라틴은 접근성이 쉽고 비용이 저렴하기 때문에 첫 번째 선택이었습니다. 젤라틴 코팅이 EC 표현형을 성공적으로 유지함에 따라 다른 코팅 물질은 테스트되지 않았습니다. 콜라겐과 피브로넥틴은 EC 접착 및 표현형에 대한 다양한 세포외 기질 성분의 영향을 조사하기 위한 연구에서 테스트할 수 있습니다. - 배지를 변경하지 않고 4일 동안 5%CO2 로 가습된 분위기에서 37°C에서 세포를 인큐베이션한다. 그 후 격일로 미디어를 변경하십시오. 이 순간부터 헤파린을 사용한 추가 세포 배지 보충은 더 이상 필요하지 않습니다. 적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 플레이트를 검사합니다.
- 추출 후 3-10일 후, 정맥 분절의 크기와 직경에 따라 위상차 현미경으로 hSVEC를 시각화합니다.
- 위상차 현미경에서 합류 정도와 조약돌 형태를 평가합니다.
- 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 2일마다 배지를 계속 교체합니다.
- hSVECs를 0.25% 트립신-0.02% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 계대배양한다.
- 예열된 PBS로 세포를 세척합니다.
- 1mL의 트립신-EDTA 용액을 60mm 세포 배양 접시에 추가합니다. 37°C에서 2분 동안 또는 모든 세포가 분리될 때까지 배양합니다.
- 트립신을 비활성화하기 위해 완전한 내피 세포 배지 2mL를 추가합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 RT에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 1mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 1:1 트리판 블루(0.4%)로 계산하여 생존 세포를 플레이트에 넣습니다.
- 배양을 확장하기 위해, 세포를 100 mm 세포 배양 접시에 예열된 완전 내피 세포 배지 10 mL와 함께 플레이트하고, 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C에서 배양하였다.
메모. 평균적으로 4 x 10 4hSVEC/cm2의 시딩은48시간 후에 100% 합류합니다.
- 세포를 냉동 보존하려면 단계 1.2.11.5의 펠릿을 소 태아 혈청(FBS)의 5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 재현탁하고 액체 질소에 보관합니다.
- 이 절차를 위해 최소 2-3cm 길이의 복재 정맥 세그먼트를 수집하십시오.
- hSVEC의 특성화: CD31에 대한 유세포 분석 염색
- 1 x 10 5 hSVEC를 하나의1.5 mL 튜브로 옮기고 RT에서 3 분 동안 300 x g 에서 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 2 % BSA 및 CD31-FITC 단일 클론 항체 (1 : 100)를 함유 한 PBS 100 μL에 펠렛을 재현탁합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 세포를 염색하십시오.
- 0.5 mL의 PBS를 첨가하여 염색된 세포를 세척하고, RT에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 버리고, 2% BSA가 함유된 400 μL의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
- CD31 항체가 없는 표지되지 않은 hSVEC를 음성 대조군으로 사용하십시오.
- 청색 레이저 및 FITC 채널(498/517nm의 여기/방출 최대[Ex/Em])을 사용하여 유세포분석기 획득 분석을 진행합니다. 다른 형광색소를 사용하는 경우 세포분석기에 검출을 위한 적절한 필터 세트가 있는지 확인하십시오. 크기와 입도의 함수에서 세포를 파편에서 분리한 다음 전방 산란 및 측면 산란으로 단일 세포를 게이트합니다.
- hSVEC의 특성화: CD31 및 VE-cadherin에 대한 형광 염색
- 플레이트 0.1 x 105 세포 젤라틴이 코팅된 8-웰 챔버 슬라이드. 세포를 37°C, 5%CO2에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여, 세포가 배양 표면에 부착되도록 한다.
- 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
- 0.3mL/웰의 4% PFA를 추가하여 세포를 고정합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 세 번 씻으십시오.
- 0.1% Triton X-100 용액 0.3mL/웰을 추가하여 세포를 투과시킵니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 세 번 씻으십시오.
- 비특이적 항체 결합 부위를 차단하려면 5% BSA 용액 0.3mL/웰을 세포에 추가합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 세 번 씻으십시오.
- 4°C에서 하룻밤 동안 2% BSA와 함께 PBS에 희석된 1차 항체(CD31 및 VE-cadherin, 1:100)와 함께 세포를 인큐베이션합니다. 음성 대조군으로 2% BSA(1차 항체 없음)와 함께 PBS와 함께 배양한 웰 하나를 남겨둡니다.
- PBS로 세 번 씻으십시오.
- RT에서 1시간 동안 PBS에 희석(1:500)된 형광 표지된 2차 항체로 세포를 배양합니다. 핵 염색을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 1mg/mL의 최종 농도로 추가합니다.
- PBS로 세 번 씻으십시오.
- 분리기가 있는 미디어 챔버를 제거합니다. 마운팅 배지 시약(PBS의 50% 글리세롤)을 한 방울 떨어뜨리고 기포가 끼지 않도록 유리 슬라이드(24mm x 60mm)를 놓습니다.
- 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다.
알림: DAPI는 DAPI 라이트 큐브(예: 335-379nm; Em: 417-477 nm), CD31/VE-cadherin은 녹색 형광 단백질(GFP) 라이트 큐브(예: 459-481 nm; Em : 500-550 nm). 유사한 여기/방출 파장 범위를 가진 라이트 큐브도 이러한 형광 색소에 적합합니다. 다른 형광 색소를 사용하는 경우 사용된 현미경에 검출에 적합한 필터 세트가 있는지 확인하십시오.
2. hSVEC에 대한 전단 응력
- 준비
- 유동 챔버 슬라이드를 0.1% w/v 젤라틴으로 코팅하여 37°C에서 최소 30분 동안 코팅합니다. 세포를 파종하기 전에 과도한 젤라틴을 제거하십시오.
- 멸균 관류 세트 및 멸균 관류 세트를 37°C에서 5%CO2 의 가습된 분위기에서 인큐베이터 내부에서 밤새 평형화시킨다.
- 전단 응력 실험
- 2 x 10 5 EC를 100 μL의 EC 배지 에 현탁하여 젤라틴으로 코팅된 플로우 챔버 슬라이드에 시드합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 4시간 동안 인큐베이션하여 세포가 배양 표면에 부착될 수 있도록 한다.
- 제조업체의 지침에 설명된 대로 유체 장치에 관류 세트를 놓습니다. 저장조와 관류 세트를 약 12 mL의 예열된 완전 내피 세포 배지에 채운다. 관류 세트에서 수동으로 기포를 제거하여 5mL에서 두 저장소의 수위를 평형화합니다.
- 챔버 슬라이드 없이 관류 세트가 장착된 유체 장치를 인큐베이터에 놓고 전기 케이블을 컴퓨터 조절 펌프에 연결합니다. 저장소 및 관류 세트에서 모든 기포를 제거하고 펌프 제어 소프트웨어에서 사전 정의된 프로토콜을 실행합니다.
메모. 시스템이 올바르게 작동하려면 기포를 제거하는 것이 매우 중요합니다. - 층류 후드에 장착된 관류가 설정된 유체 장치를 가져와서 합류 셀 단층으로 슬라이드를 부착합니다.
- 인큐베이터에 셀이 있는 관류 및 슬라이드가 장착된 유체 장치를 놓고 전기 케이블을 펌프에 연결합니다.
- 펌프 제어 소프트웨어에서 매체의 점도(0.0072), 슬라이드 유형, 관류 설정 보정 계수, 전단 응력 속도(20dyn/cm2), 흐름 유형(단방향) 및 시간(72시간)과 같은 매개변수를 설정하고 흐름을 시작합니다(자세한 내용은 장비 지침 참조). 정적 대조군과 같은 흐름에 노출되지 않고 동일한 배지로 처리된 세포를 수확합니다.
- 자극이 완료된 후 PBS로 세포를 한 번 세척하고 필요한 분석에 따라 샘플을 수확합니다. 형광 염색에 대해서는 2.3.1 단계를 참조하고, RNA 추출에 대해서는 2.3.2 단계를 참조하십시오.
- 전단 응력 프로토콜의 효과 입증
- 액틴 필라멘트(F-actin)의 형광 염색
- 1.4.2-1.4.6 단계에 표시된대로 세포를 고정하고 투과시킵니다. μ 슬라이드에 100μL의 부피를 사용합니다.
- 형광 표지 팔로이딘(PBS에서 1:200으로 희석)으로 F-액틴을 염색하고 빛으로부터 보호되는 RT에서 2시간 동안 DAPI(PBS에서 1mg/mL의 최종 농도)로 핵을 대조 염색합니다.
- PBS로 세 번 씻으십시오.
- 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다.
알림: DAPI는 DAPI 라이트 큐브(예: 335-379nm; Em: 417-477 nm) 및 GFP light cube로 검출되는 팔로이딘(Ex: 459-481 nm; Em : 500-550 nm). 여기/방출 파장의 범위가 유사한 광 큐브도 이러한 형광 색소에 적합합니다. 다른 형광 색소를 사용하는 경우 사용된 현미경에 검출에 적합한 필터 세트가 있는지 확인하십시오.
- 실시간 정량적 역전사(RT-qPCR)에 의한 유전자 발현
- 350 μL의 상업용 구아니딘-티오시아네이트-함유 용해 완충액과 함께 μ-슬라이드로부터 세포를 수집한다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 추출 키트로 전체 RNA를 분리합니다.
참고: μ-slide에서 배양되는 세포 수가 제한되어 있기 때문에 RNA의 컬럼 기반 추출을 사용하는 것이 좋습니다. - 제조업체의 지침에 따라 전사 효소 역전 효소가 포함된 cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA를 준비합니다.
- 전단 응력에 의해 조절되는 유전자(KLF2, KLF4 및 NOS3)의 발현을 확인합니다. 가정부 유전자 PPIA/사이클로필린을 사용하여 결과를 정규화합니다. 반응에 대한 구체적인 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.
- 다음 반응 조건 하에서 SYBR 녹색 형광 DNA 염색 키트를 사용하여 RT-qPCR을 수행한다: i) 2분 동안 50°C, ii) 15분 동안 95°C, iii) 15초 동안 94°C, iv) 30초 동안 60°C, v) 30초 동안 72°C. 40주기 동안 iii-v 단계를 반복합니다. 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 반응이 끝날 때 용융 단계를 추가합니다.
- 350 μL의 상업용 구아니딘-티오시아네이트-함유 용해 완충액과 함께 μ-슬라이드로부터 세포를 수집한다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 추출 키트로 전체 RNA를 분리합니다.
- 액틴 필라멘트(F-actin)의 형광 염색
3. hSVEC의 주기적 스트레칭
- 준비
- 실리콘 기반 윤활유를 25mm의 6웰 등이축 로딩 스테이션의 상단과 측면에 도포합니다.
참고: 이렇게 하면 배양 플레이트 멤브레인과 스테이션 사이의 마찰이 줄어들어 순환 균주가 더 잘 분포될 수 있습니다. 이 단계는 각 실험 전에 수행해야 합니다.
- 실리콘 기반 윤활유를 25mm의 6웰 등이축 로딩 스테이션의 상단과 측면에 도포합니다.
- 순환 스트레칭 실험
- 종자 4 x 105 세포를 콜라겐 I로 코팅된 6-웰 유연-바닥 배양 플레이트의 각 웰에 3 mL에 현탁시켰다 (Table of Materials). 대조군으로 정적 상태의 플레이트를 갖도록 계획하십시오. 세포가 100% 합류도에 도달할 때까지(보통 파종 후 48시간) 인큐베이터(5%CO2로 가습된 공기에서 37°C)에 세포를 보관합니다. 스트레치 프로토콜을 시작하기 전에 예열된 PBS로 세포를 한 번 세척하고 웰당 3mL의 신선한 배양 배지를 추가합니다.
- 인큐베이터에 윤활 처리된 모든 로딩 스테이션이 있는 바닥판을 삽입하고 튜브를 텐션 셀 스트레칭 바이오리액터 시스템의 컨트롤러 장비와 적절하게 연결합니다(자세한 내용은 장비 지침 참조).
- 각 배양 플레이트를 텐션 셀 스트레칭 바이오리액터 시스템에서 제공하는 하나의 빨간색 개스킷에 부착합니다. 그런 다음 인큐베이터 안의 바닥판에 넣습니다.
- 진공 펌핑 중에 공기가 누출되는 것을 방지하기 위해 플레이트가 완전히 안착되고 눌러지고 베이스 플레이트에 밀봉되었는지 확인하십시오. 적절한 진공과 스트레칭 하중을 갖기 위해 베이스 플레이트에 4개의 배양 플레이트를 모두 두는 것이 중요합니다.
- 실험용 플레이트가 적은 경우 빈 플레이트를 사용하여 베이스 플레이트의 4개 위치를 완성합니다. 배양 플레이트 위에 아크릴 시트(장비와 함께 제공됨)를 추가하여 베이스 플레이트 밀봉을 개선합니다. 정적 플레이트를 동일한 인큐베이터에 놓습니다.
- 컨트롤러 장비와 컴퓨터 시스템을 켭니다. 소프트웨어 아이콘을 열고 사용할 로딩 스테이션의 크기, 변형 유형, 연신율 백분율, 파형 모양, 주파수 및 시간 등 원하는 요법을 구성합니다. 자세한 내용은 제조업체의 지침을 참조하십시오. 요법을 선택하고 다운로드하십시오. 여기서, 다음의 요법이 사용되었다: 1/2 부비동 파형 모양, 1 Hz 주파수, 신장의 5%(정맥 스트레칭을 모방하기 위해) 및 신장의 15%(동맥 스트레칭을 모방하기 위해)를 최대 72시간까지 사용하였다.
- 진공 시스템을 켜고 컴퓨터 화면에서 시작을 클릭하여 스트레칭을 실행합니다. 실리콘 멤브레인이 움직이고 세포가 늘어나는지 확인하십시오.
- 자극이 완료된 후 PBS로 세포를 한 번 세척하고 필요한 분석에 따라 샘플을 수확합니다. 여기서, 순환 스트레치의 효과를 입증하기 위해, hSVEC 배양 배지를 수집하고, 이를 추가적인 산화질소(NO) 측정을 위해 -80°C에서 유지하고, 형광 염색을 위해 세포를 고정한다.
메모. 베이스 플레이트는 사용하지 않을 때 인큐베이터 내부에 보관할 수 없습니다. 그렇지 않으면 온도가 평평한 모양을 수정하여 쓸모 없게 만들 수 있습니다.
- 순환 스트레치 프로토콜의 효과 입증
- F-액틴의 형광 염색
- 1.4.3단계에 표시된 대로 셀을 고정합니다. 웰 당 1mL의 부피를 사용하십시오.
- 세포를 PBS로 세 번 세척합니다. 다음 단계를 위해 실리콘 멤브레인을 준비하는 동안 건조되지 않도록 세포를 PBS에 유지합니다.
- 면봉을 사용하여 멤브레인 바닥에서 과도한 실리콘 기반 윤활제를 제거합니다. 그런 다음 새 면봉으로 창문 세정제나 손 비누를 부드럽게 바릅니다. 모든 윤활유가 멤브레인에서 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 탈이온수로 청소하십시오.
메모. 좋은 품질의 현미경 이미지를 얻기 위해 실리콘 멤브레인에서 윤활유를 완전히 제거하는 것이 중요합니다. - 염색을 위해 실리콘 멤브레인을 8웰 챔버 슬라이드에 맞도록 조심스럽게 작은 조각으로 자릅니다. 단계 1.4.5에 표시된 대로 세포를 투과화합니다.
- 세척 단계 후, 팔로이딘을 사용하여 F-액틴을 염색하고 DAPI로 핵을 염색합니다. 2.3.1.2 및 2.3.1.3 단계에 표시된 대로 분석을 진행합니다. 챔버 웰 당 0.3mL의 부피를 사용하십시오.
- 분리기가 있는 미디어 챔버를 제거합니다. 마운팅 배지 시약(PBS의 50% 글리세롤) 한 방울을 놓고 유리 슬라이드(24mm x 60mm)를 놓습니다.
- 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다.
알림: DAPI는 DAPI 라이트 큐브(예: 335-379nm; Em: 417-477 nm) 및 적색 형광 단백질(RFP) 광 큐브로 검출되는 팔로이딘(Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). 여기/방출 파장의 범위가 유사한 광 큐브도 이러한 형광 색소에 적합합니다. 다른 형광 색소를 사용하는 경우 사용된 현미경에 검출에 적합한 필터 세트가 있는지 확인하십시오.
- NO 측정-요오드화칼륨계 환원성 화학발광 분석을 사용하여 hSVEC 조건화 배지에 축적된 아질산염(NO2)에 의해 추정됨
- 준비
- 0.01-10 mM의 아질산나트륨(초순수 중 NaNO2) 용액에서 표준 곡선을 준비합니다.
- 아세트산 5mL와 요오드화칼륨 1mL(초순수 1mL에 50mg)를 산화질소 분석기의 퍼지 용기에 넣습니다.
- 측정 없음
- 20 μL의 NaNO2 표준 곡선을 산화질소 분석기의 퍼지 용기에 넣는다. 제조업체의 프로토콜에 따라 측정하십시오.
- 준비
- 컨디셔닝된 배지 20 μL를 산화질소 분석기의 퍼지 용기에 넣습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 측정하십시오.
- 표준 곡선 보정에 기초하여NO2 농도를 계산한다. 분석된 컨디셔닝 배지의 총 부피에 의해 얻어진 값을 조정한다 6,11.
- F-액틴의 형광 염색
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Representative Results
일반적으로 부착된 EC는 추출 후 3-4일 후에 관찰할 수 있습니다. hSVEC는 초기에 세포 클러스터를 형성하고 전형적인 "조약돌" 형태를 나타냅니다(그림 1B). 이들은 EC 마커 CD31(그림 1C,D) 및 VE-카데린(그림 1D)을 발현합니다. hSVEC는 코팅되지 않은 처리된 세포 배양 접시에서 쉽게 증식할 수 있으며 최대 8계대 배양에서 내피 표현형을 유지합니다.
hSVEC는 전단 응력 하에서 배양될 때 유동 방향으로 정렬됩니다(그림 2A). 72시간 동안 20dyn/cm2의 전단 응력은 전형적인 기계 민감성 유전자인 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현을 유도하여 hSVEC에서 전단 자극의 효과를 나타냅니다(그림 2B)12,13,14.
주기적 스트레칭 결과는 hSVEC에 적용되는 강도에 따라 달라집니다. 낮은 스트레치 하의 세포는 정적 세포와 유사한 피질 F-액틴 패턴을 보이며(그림 3A), 최대 72시간까지 NO 방출의 변화 없이 나타납니다(그림 3B). 동맥 스트레치 수준은 24시간 후에 액틴 세포골격을 리모델링하고(그림 3A) 72시간 후에 NO 방출을 감소시킵니다(그림 3B).
그림 1: 인간 복재 정맥(hSVEC)의 내피 세포는 전형적인 내피 형태와 특정 EC 마커 발현을 나타냅니다. (A) EC 추출을 위한 II형 콜라게나제 용액으로 채워진 복재 정맥 분절. (B) 추출 후 hSVEC 성장의 대표적인 시간 경과. 3-4 일 후, 합류점에 도달 할 때까지 증식하는 세포 클러스터를 시각화 할 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 계대 1에서 배양된 hSVEC의 FACS 분석. 녹색 선은 세포 집단의 99.7%가 내피 특이적 마커 CD31에 대해 양성임을 나타냅니다. 검은색 선은 음성 대조군입니다. (D) 계대 1에서 hSVEC의 CD31(녹색), (E) VE-카데린(녹색) 및 핵 DAPI(파란색)에 대한 면역염색. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: hSVEC는 단방향 전단 응력에 노출될 때 유동 방향으로 정렬되고 기계에 민감한 유전자를 발현합니다. 정적 또는 단방향 층류 전단 응력 조건에서 배양된 hSVEC의 융합 세포 단층. (A) 72시간 동안 20dyn/cm2 의 전단 응력에 노출된 hSVEC의 위상차 이미지(위) 및 팔로이딘 염색(아래). 녹색: 액틴 필라멘트; 파란색: 세포핵. 스케일 바 = 100 μm(위상차) 및 20 μm(형광). (b) qRT-PCR에 의해 결정된 KLF2, KLF4 및 NOS3의 유전자 발현. 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. ** 정적 그룹 대 p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 순환 스트레칭 하에서 hSVEC 표현형은 적용된 강도에 따라 다릅니다. (A) 24시간 동안 유연한 바닥판에서 정적, 저(정맥) 또는 높은(동맥) 스트레치 하에서 배양된 hSVEC의 융합 세포 단층. 위상차 이미지(위)와 팔로이딘 염색(아래)은 액틴 섬유(빨간색)와 DAPI(파란색)가 있는 핵을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm(위상차) 및 50 μm(형광). (B) NO 측정은 72시간 동안 세포 배양 배지 중의NO2 축적을 기준으로 추정하였다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. *** p < 0.001 대 정적 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 단백질 | 포워드 5'-3' | 역방향 5'-3' | ||
| KLF2 (한국어판) | Krüppel-like Factor 2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 (한국어판) | Kruppel과 같은 인자 4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGGGCAC | ||
| NOS3 | 산화 질소 합성 효소, 내피 | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| 증권 시세 표시기 | 사이클로필린 A, | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC | ||
| 펩티딜프롤릴 이성화효소 A | |||||
표 1: 전단 응력 및 참조 유전자에 대한 qRT-PCR 프라이머.
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Discussion
복재 정맥 분절은 hSVEC를 성공적으로 분리하기 위해 최소 2cm가 되어야 합니다. 작은 세그먼트는 다루기가 어렵고 세포를 분리하기 위해 콜라게나제 용액을 유지하기 위해 혈관의 끝을 묶습니다. 감소된 내강 표면적은 배양을 확장하기에 충분한 세포를 생성하지 않습니다. 비 EC로 인한 오염 위험을 최소화하려면 복재 정맥 부분의 조작이 전체 절차 동안 매우 부드럽게해야합니다. 혈액을 제거하기 위해 피펫 팁을 내강 표면에 도입 할 때와 콜라게나제 용액을 도입 할 때는주의해야합니다. 효소 용액에 대한 노출은 비 EC에 의한 배양의 오염을 줄이기 위해 매우 잘 제어되어야 합니다(1시간 이내). 성장 인자 칵테일이 보충된 특정 EC 배지의 사용은 hSVEC 배양 성장에 매우 중요합니다. 배양 첫날 동안 헤파린을 추가로 섭취하면 정맥 분절에서 적혈구가 잔류하는 것을 줄이고 평활근 세포 증식을 억제하는 데 중요하다15. 실험을 위해 또는 배양을 유지하기 위해 세포를 통과시킬 때 40% 이상의 합류점으로 세포를 플레이트해야 합니다. EC는 좋은 확산과 생존을 보장하기 위해 최소한의 접촉이 필요합니다. hSVECs는 코팅되지 않은(예를 들어, 젤라틴 또는 피브로넥틴) 표면 상에서 용이하게 배양될 수 있다. 그러나 EC 추출 후 첫날 동안 코팅하면 EC 접착력과 수율이 증가합니다. hSVEC는 일정한 증식 속도를 가지며 중간엽 세포 마커(예: SM22 및 칼포닌)를 발현하지 않고 최대 8계대까지 내피 표현형을 유지합니다. 우리의 경험에 따르면 증식 속도는 조직 기증자에 따라 다를 수 있지만 세포 통과에서는 그렇지 않습니다. 세포를 해동한 후 생존력을 높이기 위해 5% DMSO로 FBS에서 hSVEC를 냉동 보존하는 것이 좋습니다.
전단 응력 실험을 수행하려면 고려해야 할 중요한 단계가 있습니다. 시스템 내부에 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 관류 세트와 커넥터는 37°C 및 5%CO2에서 밤새 평형을 이루어야 합니다. 기포는 시스템을 통한 흐름을 차단하거나 세포 표현형을 방해하는 내피 단층을 손상시킬 수 있습니다. 플로우 챔버 슬라이드에 셀을 파종할 때 4시간 후 또는 다음날 사용할 수 있도록 합류하도록 하는 것이 좋습니다. 또한 실험이 며칠 동안 실행되는 경우 정적 조건에서 매일 슬라이드의 매체를 변경해야 합니다. 유동 챔버 슬라이드의 부피는 ~160μL이며 장기간 배양 기간 동안 세포를 유지하기에 충분하지 않습니다. 이 시스템은 현미경(명시야/위상차 또는 형광 현미경을 위한 염색)으로 세포를 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있습니다. 한계는 단백질(20-25 μg/슬라이드)과 RNA(1 μg/슬라이드)의 낮은 수율입니다. 이를 극복하기 위해 시스템은 동일한 유체 장치를 사용하여 여러 슬라이드를 직렬로 연결할 수 있습니다 (제조업체의 지침 참조). 이어서, 하나의 슬라이드에 용해 완충액의 부피를 사용하여 여러 슬라이드로부터 단백질 또는 RNA를 추출할 수 있다.
스트레치 시스템은 다루기 쉽고 다양한 강도와 유형의 스트레칭을 적용할 수 있습니다. 배양 플레이트 멤브레인과 스테이션 사이의 마찰을 줄이고 순환 균주의 적절한 분포를 보장하기 위해 각 실험 전에 모든 로딩 스테이션에 윤활유를 바르는 것이 중요합니다. 원하는 스트레치에 도달하는 데 필요한 진공을 생성하기 위해 플레이트가 베이스 플레이트에 완전히 밀봉되었는지 확인하십시오. 등축 자극은 웰 내부에서 균일한 변형을 생성하지 않습니다. 우물 가장자리의 세포는 제조업체가 표시한대로 폐기해야합니다. 멤브레인 관심 영역은 로딩 스테이션 직경과 연신율에 따라 결정됩니다. 전체 멤브레인에서 면역 염색을 수행하거나 분석에 사용되는 항체의 양을 줄이기 위해 더 작은 조각으로 절단할 수 있습니다. 이 경우 세포막은 세포 손상을 피하면서 매우 조심스럽게 다루어야합니다. 연구자들은 또한 염색을 하는 동안 멤브레인을 거꾸로 뒤집어 세포를 잃지 않도록 주의해야 합니다. 광학 현미경으로 세포로 멤브레인의 정확한 면을 확인하는 것은 항상 가능합니다.
이와 같은 시험관 내 연구의 주요 한계는 생체 내 환경을 완전히 요약하지 못한다는 것입니다. 이러한 이유로 hSVEC가 EC 표현형(EC 마커 발현)을 유지하고 기계적 스트레스(F-액틴 배향 및 기계적 반응 단백질의 조절/생산) 하에서 예상되는 결과를 재현하는지 확인하기 위해 항상 분석을 수행하는 것이 중요합니다.
요약하면, hSVEC를 분리하고 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레치에 노출시키는 자세한 절차를 제공합니다. SV 이식편이 CABG 후 갑자기 동맥 상태에 노출되면 내피 손상이 발생하여 이식 실패에 기여합니다. 이러한 프로토콜은 기계적 힘이 정맥 이식 질환과 관련된 hSVEC 기능 장애에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
JEK는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 및 2013/17368-0] 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 및 309179/2013-0)의 보조금으로 지원됩니다. AAM은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP 2015/11139-5) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq(Universal - 407911/2021-9)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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