Summary
Vi beskriver en protokol til isolering og dyrkning af humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er). Vi leverer også detaljerede metoder til at producere forskydningsspænding og stræk for at studere mekanisk belastning i hSVEC'er.
Abstract
Koronararterie bypass graft (CABG) kirurgi er en procedure til revaskularisering iskæmisk myokardium. Saphenøs vene forbliver brugt som en CABG-kanal på trods af den reducerede langsigtede patency sammenlignet med arterielle ledninger. Den pludselige stigning i hæmodynamisk stress forbundet med transplantatarterielisering resulterer i vaskulær skade, især endotelet, der kan påvirke den lave patency af saphenøs venetransplantat (SVG). Her beskriver vi isolering, karakterisering og udvidelse af humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er). Celler isoleret ved kollagenasefordøjelse viser den typiske brostenmorfologi og udtrykker endotelcellemarkører CD31 og VE-cadherin. For at vurdere den mekaniske stressindflydelse blev protokoller anvendt i denne undersøgelse til at undersøge de to vigtigste fysiske stimuli, forskydningsspænding og strækning, på arterialiserede SVG'er. hSVEC'er dyrkes i et parallelt pladeflowkammer for at producere forskydningsspænding, der viser justering i strømningsretningen og øget ekspression af KLF2, KLF4 og NOS3. hSVEC'er kan også dyrkes i en siliciummembran, der tillader kontrolleret cellulær strækning, der efterligner venøs (lav) og arteriel (høj) strækning. Endotelcellernes F-actinmønster og nitrogenoxidsekretion (NO) moduleres i overensstemmelse hermed af arteriestrækningen. Sammenfattende præsenterer vi en detaljeret metode til at isolere hSVEC'er for at studere indflydelsen af hæmodynamisk mekanisk stress på en endotelfænotype.
Introduction
Endotelcelle (EC) dysfunktion er en nøglespiller i saphenøs venetransplantatsvigt 1,2,3,4. Den vedvarende stigning i forskydningsstress og cyklisk strækning inducerer den proinflammatoriske fænotype af humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er)3,4,5,6. De underliggende molekylære veje er stadig ikke fuldt ud forstået, og standardiserede protokoller til in vitro-undersøgelser kan udnytte indsatsen for ny indsigt på området. Her beskriver vi en simpel protokol til at isolere, karakterisere og udvide hSVEC'er, og hvordan man udsætter dem for variable niveauer af forskydningsstress og cyklisk strækning, der efterligner de venøse og arterielle hæmodynamiske tilstande.
hSVEC'er isoleres ved kollagenaseinkubation og kan anvendes indtil passage 8. Denne protokol kræver mindre manipulation af beholderen sammenlignet med de andre tilgængelige protokoller7, hvilket reducerer forurening med glatte muskelceller og fibroblaster. På den anden side kræver det et større fartøjssegment på mindst 2 cm for at have effektiv EC-ekstraktion. I litteraturen er det blevet rapporteret, at EC'er fra store fartøjer også kan opnås ved mekanisk fjernelse 7,8. Selvom den fysiske tilgang er effektiv, har den ulemperne ved lavt EF-udbytte og højere fibroblastforurening. For at øge renheden er der behov for ekstra trin ved hjælp af magnetiske perler eller cellesortering, hvilket øger omkostningerne ved protokollen på grund af erhvervelsen af perler og antistoffer 7,8. Den enzymatiske metode giver hurtigere og bedre resultater med hensyn til EF-renhed og levedygtighed 7,8.
De hyppigst anvendte EC'er til at studere endoteldysfunktion er humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er). Det er kendt, at EF-fænotypen ændres i forskellige vaskulære senge, og det er vigtigt at udvikle metoder, der repræsenterer beholderen under undersøgelse 9,10. I denne henseende er etableringen af en protokol til isolering af en hSVEC og dyrkning af den under mekanisk belastning et værdifuldt redskab til at forstå bidraget fra hSVEC-dysfunktion i venetransplantatsygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ubrugte segmenter af saphenøse vener blev opnået fra patienter, der gennemgik aortokoronar bypassoperation ved Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alle personer gav informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen, som blev gennemgået og godkendt af den lokale etiske komité.
1. Isolering, kultur og karakterisering af primære humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er)
- Præparation
- Autoklave et par lige eller buede tang og vævsaks (7-8 cm).
- Forbered steril gelatine. Bland 0,1 g (0,1% w/v) eller 3 g (3% w/v) svinehudgelatine med 100 ml ultrarent vand, autoklave i 15 minutter og opbevar ved 4 °C. Der opvarmes til 37 °C for at blive flydende, inden cellekulturskålene og objektglassene belægges.
- Forbered steril kollagenase (1 mg/ml) inde i laminar flowhætten. Fortynd kollagenaseen i PBS og steriliser den med et 0,2 μm filter.
- Overtræk en 60 mm cellekulturskål og et 8-brønds kammerglas med 0,1 % w/v gelatine i mindst 30 minutter ved 37 °C. Fjern overskydende gelatine inden såning af cellerne.
- Forbered komplet endotelcellemedium: endotelcellevækst basalmedium (EBM-2) suppleret med EGM2 vækstfaktorer.
BEMÆRK: EGM2-vækstfaktorerne leveres som et kit af et firma, der er anført i materialetabellen. Koncentrationen af faktorerne oplyses ikke af selskabet. - Lav 2% og 5% bovin serumalbumin (BSA), 4% paraformaldehyd (PFA) og 0,1% Triton X-100 opløsninger, alle i fosfatbufret saltvand (PBS).
- Isolering og kultur af hSVEC'er
- Saml mindst et 2-3 cm langt saphenøst venesegment til denne procedure.
SEDDEL. Alle cellekulturprocedurer skal udføres under sterile forhold og inde i en laminar strømningshætte. - Overfør venesegmentet til en petriskål fyldt med forvarmet PBS. Indsæt en pipettespids i den ene ende af venen og skyl forsigtigt med PBS for at fjerne alt blodet inde i lumen. Skyl det, indtil vaskestrømmen bliver helt klar.
- Luk en af enderne af venen med en steril bomuldsutur. Fyld forsigtigt beholderen med 1 mg/ml kollagenase type II opløsning. Luk den anden ende af karret med en bomuldsutur (figur 1A). Der inkuberes beholderen med kollagenaseopløsning i en befugtet atmosfære på 5% CO2 ved 37 °C i 1 time.
- Derefter skæres en af enderne af beholderen inde i et 15 ml rør og opsamles kollagenaseopløsningen. Skær den anden ende, og skyl lysoverfladen med 1-2 ml PBS for at opsamle alle de løsrevne EC'er. Sæt al PBS sammen med kollagenaseopløsning inde i det samme rør.
- Centrifuger røret ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) for at pelletere cellerne.
SEDDEL. Cellepillen er meget lille og vanskelig at visualisere. Hvis blodet ikke fjernes fuldstændigt før kollagenasebehandling (trin 1.2.2.), vil blodlegemerne også udfældes, og pelleten vil være rødlig. - Supernatanten fjernes og cellepelletsen resuspenderes i 3-4 ml komplet endotelcellemedium (EBM-2 suppleret med EGM2-vækstfaktorer) og en yderligere heparinopløsning (5 E/ml, slutkoncentration). Pladerne i en 60 mm cellekulturskål, der er forbelagt med 3 % w/v gelatine.
BEMÆRK: Gelatine var det første valg på grund af dets lette tilgængelighed og lave omkostninger. Da belægningen med gelatine med succes opretholder EC-fænotypen, blev intet andet belægningsstof testet. Kollagener og fibronectin kan testes i undersøgelser, der sigter mod at undersøge indflydelsen af forskellige ekstracellulære matrixkomponenter på EC-adhæsion og fænotypen. - Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5% CO2 i 4 dage uden at skifte medium. Derefter skal du skifte medie hver anden dag. Fra dette øjeblik er det ekstra cellemedietilskud med heparin ikke længere nødvendigt. Undersøg pladen under mikroskopet for at sikre, at de røde blodlegemer blev fjernet.
- Efter 3-10 dage efter ekstraktion, afhængigt af venesegmentets størrelse og diameter, visualiseres hSVEC'erne ved fasekontrastmikroskopi.
- Evaluer graden af sammenløb og deres brostensmorfologi i fasekontrastmikroskopi.
- Fortsæt med at skifte medie hver 2. dag, indtil cellerne når 70% -80% sammenløb.
- Passage hSVEC'erne med 0,25% trypsin-0,02% ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning.
- Vask cellerne med forvarmet PBS.
- Tilsæt 1 ml trypsin-EDTA-opløsning til 60 mm cellekulturskålen. Der inkuberes ved 37 °C i 2 minutter, eller indtil alle cellerne er løsnet.
- Tilsæt 2 ml komplet endotelcellemedium for at inaktivere trypsinet.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml glas og centrifuger ved 300 x g i 3 minutter ved RT.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 1 ml dyrkningsmedium.
- Cellesuspensionen tælles i 1:1 trypanblåt (0,4 %) for at beklæde levedygtige celler.
- For at udvide kulturen plades cellerne i en 100 mm cellekulturskål med 10 ml forvarmet komplet endotelcellemedium og dyrkes ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5% CO2.
SEDDEL. I gennemsnit vil såningen af 4 x 104 hSVEC/cm2 være 100% sammenflydende efter 48 timer.
- For at kryopræservere cellerne resuspenderes pellet fra trin 1.2.11.5 i 5% dimethylsulfoxid (DMSO) i føtalt bovint serum (FBS) og opbevares i flydende nitrogen.
- Saml mindst et 2-3 cm langt saphenøst venesegment til denne procedure.
- Karakterisering af hSVEC'er: Flowcytometrifarvning til CD31
- Der overføres 1 x 10 5 hSVEC'er til et1,5 ml rør og centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter ved RT. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 100 μl PBS indeholdende 2 % BSA og CD31-FITC monoklonalt antistof (1:100).
- Plet cellerne i 30 minutter ved RT i mørke.
- De farvede celler vaskes ved tilsætning af 0,5 ml PBS og centrifugeres ved 300 x g i 3 minutter ved RT. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 400 μl PBS med 2 % BSA.
- Brug umærkede hSVEC'er uden CD31-antistof som den negative kontrol.
- Fortsæt til flowcytometeroptagelsesanalyse ved hjælp af en blå laser- og FITC-kanal (excitation / emission max [Ex/Em] på 498/517 nm). Hvis der anvendes andre fluorochromer, skal du kontrollere, om cytometeret har passende filtersæt til deres påvisning. Adskil cellerne fra snavs i funktionen af deres størrelse og granularitet, og port derefter enkeltceller ved fremadrettet spredning og sidespredning.
- Karakterisering af hSVEC'er: Fluorescerende farvning til CD31 og VE-cadherin
- Plade 0,1 x 105 celler i det gelatinebelagte 8-brønds kammerglas. Cellerne inkuberes natten over ved 37 °C, 5 % CO2, så cellerne kan binde sig til dyrkningsoverfladen.
- Mediet fjernes og cellerne vaskes én gang med PBS.
- Tilsæt 0,3 ml / hul på 4% PFA for at fiksere cellerne. Inkuber i 15 minutter ved RT.
- Vask tre gange med PBS.
- Tilsæt 0,3 ml / hul af 0,1% Triton X-100 opløsning for at permeabilisere cellerne. Inkuber i 15 minutter ved RT.
- Vask tre gange med PBS.
- For at blokere ikke-specifikke antistofbindingssteder tilsættes 0,3 ml / hul 5% BSA-opløsning til cellerne. Inkuber i 15 minutter ved RT.
- Vask tre gange med PBS.
- Cellerne inkuberes med de primære antistoffer (CD31 og VE-cadherin, 1:100) fortyndet i PBS med 2 % BSA natten over med blid vuggen ved 4 °C. Lad en brønd inkubere med PBS med 2% BSA (intet primært antistof) som den negative kontrol.
- Vask tre gange med PBS.
- Cellerne inkuberes med fluorescerende mærkede sekundære antistoffer fortyndet (1:500) i PBS i 1 time ved RT. Der tilsættes 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til nuklear farvning til en slutkoncentration på 1 mg/ml.
- Vask tre gange med PBS.
- Fjern mediekammeret med separatoren. Anbring en dråbe af monteringsmediereagenset (50% glycerol i PBS), og anbring et glasglas (24 mm x 60 mm), mens du undgår at fange bobler.
- Overhold cellerne under et fluorescensmikroskop.
BEMÆRK: DAPI registreres med en DAPI-lysterning (f.eks.: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), og CD31/VE-cadherin detekteres ved hjælp af en grøn fluorescerende protein (GFP) lysterning (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lette terninger med et lignende excitations-/emissionsbølgelængdeområde er også tilstrækkelige til disse fluorkromer. Hvis der anvendes andre fluorochromer, skal du kontrollere, om det anvendte mikroskop har passende filtersæt til påvisning.
2. Forskydningsspænding på hSVEC'er
- Præparation
- Overtræk flowkammerobjektglasset med 0,1% w/v gelatine i mindst 30 minutter ved 37 °C. Fjern overskydende gelatine inden såning af cellerne.
- Den fluidiske enhed og det sterile perfusionssæt afbalanceres med 10 ml reservoirer natten over inde i inkubatoren i en befugtet atmosfære på 5% CO2 ved 37 °C.
- Forskydning stress eksperiment
- Der frøes 2 x 105 EC'er suspenderet i 100 μL EF-substrat i det gelatinebelagte flowkammerglas. Cellerne inkuberes i 4 timer ved 37 °C og 5% CO2 for at lade cellerne binde sig til dyrkningsoverfladen.
- Anbring perfusionssættet på fluidenheden som beskrevet i producentens anvisninger. Fyld reservoirerne og perfusionen sat i ca. 12 ml forvarmet komplet endotelcellemedium. Fjern manuelt luftbobler fra perfusionssættet for at afbalancere niveauet af begge reservoirer ved 5 ml.
- Placer fluidenheden med det monterede perfusionssæt uden kammerglidning i inkubatoren og tilslut det elektriske kabel til den computerregulerede pumpe. Fjern alle luftbobler fra reservoirerne og perfusionssættet, og kør en foruddefineret protokol i pumpestyringssoftwaren.
SEDDEL. Det er meget vigtigt at fjerne luftbobler for at systemet fungerer korrekt. - Tag fluidenheden med det monterede perfusionssæt til laminar strømningshætte, og fastgør diasene med et sammenflydende cellemonolag.
- Placer fluidenheden med den monterede perfusion og glider med celler i inkubatoren og tilslut det elektriske kabel til pumpen.
- I pumpestyringssoftwaren skal du indstille følgende parametre: viskositet af mediet (0,0072), diastype, kalibreringsfaktor for perfusionssæt, forskydningsspændingshastighed (20 dyn/cm2), flowtype (ensrettet) og tid (72 timer), og start flowet (se udstyrsinstruktionerne for yderligere oplysninger). Høst cellerne behandlet med det samme medie uden eksponering for flow som statiske kontroller.
- Når stimulus er afsluttet, vask cellerne en gang med PBS og fortsæt med at høste prøverne i henhold til det krævede assay. For fluorescerende farvning, se trin 2.3.1, og for RNA-ekstraktion, se trin 2.3.2.
- Påvisning af effektiviteten af forskydningsspændingsprotokollen
- Fluorescerende farvning af actinfilamenter (F-actin)
- Cellerne fastgøres og permeabiliseres som angivet i trin 1.4.2-1.4.6. Brug et volumen på 100 μL i μ-diaset.
- Plet F-actinet med fluorescerende mærket phalloidin (fortyndet ved 1:200 i PBS) og modfarve kernen med DAPI (slutkoncentration på 1 mg / ml i PBS) i 2 timer ved RT, beskyttet mod lys.
- Vask tre gange med PBS.
- Overhold cellerne under et fluorescensmikroskop.
BEMÆRK: DAPI registreres med en DAPI-lysterning (f.eks.: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) og phalloidin detekteres med en GFP-lysterning (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Lette terninger med et lignende interval af excitations-/emissionsbølgelængde er også tilstrækkelige til disse fluorkromer. Hvis der anvendes andre fluorochromer, skal du kontrollere, om det anvendte mikroskop har passende filtersæt til påvisning.
- Genekspression ved kvantitativ revers transkription i realtid (RT-qPCR)
- Cellerne opsamles fra μ-objektglasset med 350 μL af en kommerciel guanidin-thiocyanatholdig lysisbuffer. Isoler det samlede RNA med kolonnebaserede ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: På grund af det begrænsede antal celler, der dyrkes i μ-diaset, anbefales brug af kolonnebaseret ekstraktion af RNA. - Forbered cDNA ved hjælp af et cDNA-syntesesæt med transkriptase omvendt enzym i henhold til producentens instruktioner.
- Kontroller ekspressionen af genet (e) reguleret af forskydningsspænding: KLF2, KLF4 og NOS3. Brug husholderskegenet PPIA / cyclophilin til at normalisere resultaterne. De specifikke primere til reaktionen er anført i tabel 1.
- Udfør RT-qPCR ved hjælp af et SYBR grønt fluorescerende DNA-pletsæt under følgende reaktionsbetingelser: i) 50 °C i 2 min, ii) 95 °C i 15 minutter, iii) 94 °C i 15 s, iv) 60 °C i 30 s, v) 72 °C i 30 s. Gentag trin iii til v i 40 cyklusser. Tilsæt et smeltetrin i slutningen af reaktionen for at verificere primerens specificitet.
- Cellerne opsamles fra μ-objektglasset med 350 μL af en kommerciel guanidin-thiocyanatholdig lysisbuffer. Isoler det samlede RNA med kolonnebaserede ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Fluorescerende farvning af actinfilamenter (F-actin)
3. Cyklisk strækning på hSVEC'er
- Præparation
- Påfør silikonebaseret smøremiddel på toppen og siderne af den 6-brønds ækvibiaxiale lastestation på 25 mm.
BEMÆRK: Dette reducerer friktionen mellem kulturplademembranen og stationen, hvilket muliggør bedre fordeling af den cykliske stamme. Dette trin skal udføres før hvert forsøg.
- Påfør silikonebaseret smøremiddel på toppen og siderne af den 6-brønds ækvibiaxiale lastestation på 25 mm.
- Cyklisk strækning eksperiment
- Frø 4 x 105 celler suspenderet i 3 ml til hver brønd i de 6-brønds fleksible bundede kulturplader belagt med kollagen I (Materialetabel). Planlæg at have en plade (er) i statisk tilstand som kontrolgruppe. Opbevar cellerne i inkubatoren (37 °C i befugtet luft med 5% CO2), indtil de når 100 % sammenløb (normalt 48 timer efter såning). Før starten af stretchprotokollen vaskes cellerne en gang med forvarmet PBS og tilsættes 3 ml frisk dyrkningsmedium pr. Brønd.
- Indsæt bundpladen med alle smurte læssestationer i inkubatoren, og tilslut slangen korrekt med regulatorudstyret i spændingscellestrækningsbioreaktorsystemet (se udstyrsinstruktionerne for yderligere detaljer).
- Fastgør hver kulturplade til en rød pakning, der leveres af spændingscellestrækningsbioreaktorsystemet. Sæt dem derefter i bundpladen inde i inkubatoren.
- Sørg for, at pladerne sidder helt, presses og forsegles til bundpladen for at undgå, at luft lækker under vakuumpumpen. Det er vigtigt at have alle fire kulturplader i bundpladen for at have det rette vakuum og strækningsbelastningen.
- Hvis der er færre forsøgsplader, skal du bruge en eller flere tomme til at fuldføre de fire positioner i bundpladen. Tilsæt akrylpladen (der følger med udstyret) oven på dyrkningspladerne for at forbedre bundpladeforseglingen. Placer de statiske plader i samme inkubator.
- Tænd controllerudstyret og computersystemet. Åbn softwareikonet, og konfigurer det ønskede regime: størrelsen på den laststation, der skal bruges, belastningstype, procentdel af forlængelse, bølgeformform, frekvens og tid. Du kan finde detaljerede oplysninger i producentens anvisninger. Vælg og download regimen. Her blev følgende regime anvendt: 1/2 sinusbølgeformform, 1 Hz frekvens, 5% forlængelse (for at efterligne venøs strækning) og 15% forlængelse (for at efterligne arteriel strækning) op til 72 timer.
- Tænd vakuumsystemet, og klik på Start på computerskærmen for at køre strækningen. Kontroller, om silikonemembranen bevæger sig og strækker cellerne.
- Når stimulus er afsluttet, vask cellerne en gang med PBS og fortsæt med at høste prøverne i henhold til det krævede assay. Her, for at demonstrere effektiviteten af cyklisk strækning, skal du indsamle hSVEC-kulturmediet, holde det ved -80 ° C til yderligere nitrogenoxidmåling (NO) og fastgøre cellerne til fluorescerende farvning.
SEDDEL. Bundpladen kan ikke opbevares inde i inkubatoren, når den ikke er i brug; Ellers kan temperaturen ændre den flade form og gøre den ubrugelig.
- Påvisning af cyklisk strækningsprotokols effektivitet
- Fluorescerende farvning af F-actin
- Fastgør cellerne som angivet i trin 1.4.3. Brug et volumen på 1 ml pr. Brønd.
- Cellerne vaskes tre gange med PBS. Oprethold cellerne i PBS, så de ikke tørrer, mens silikonemembranen forberedes til de næste trin.
- Brug en vatpind til at fjerne det overskydende silikonebaserede smøremiddel fra bunden af membranen. Påfør derefter forsigtigt vinduesrens eller håndsæbe med en ny vatpind. Gentag processen, indtil alt smøremiddel er fjernet fra membranen. Rengør derefter med deioniseret vand.
SEDDEL. Det er vigtigt at fjerne smøremidlet helt fra silikonemembranen for at få mikroskopibilleder af god kvalitet. - Skær forsigtigt silikonemembranerne i små stykker, så de passer på 8-brønds kammerglas til farvning. Permeabilisere cellerne som angivet i trin 1.4.5.
- Efter vasketrinnene plettes F-actinet ved hjælp af phalloidin og kernen med DAPI. Der fortsættes med analysen som angivet i trin 2.3.1.2 og 2.3.1.3. Brug et volumen på 0,3 ml pr. Kammerbrønd.
- Fjern mediekammeret med separatoren. Anbring en dråbe monteringsmedium reagens (50% glycerol i PBS) og anbring et glasglas (24 mm x 60 mm).
- Overhold cellerne under et fluorescensmikroskop.
BEMÆRK: DAPI registreres med en DAPI-lysterning (f.eks.: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) og phalloidin detekteres med en rød fluorescerende protein (RFP) lysterning (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Lette terninger med et lignende interval af excitations-/emissionsbølgelængde er også tilstrækkelige til disse fluorkromer. Hvis der anvendes andre fluorochromer, skal du kontrollere, om det anvendte mikroskop har passende filtersæt til påvisning.
- NO-måling estimeret ved akkumulering af nitrit (NO2) i det hSVEC-konditionerede medium under anvendelse af et kaliumiodidbaseret reduktivt kemiluminescensassay
- Præparation
- Forbered en standardkurve fra 0,01-10 mM natriumnitrit (NaNO2 i ultrarent vand) opløsning.
- Der tilsættes 5 ml eddikesyre og 1 ml kaliumiodid (50 mg i 1 ml ultrarent vand) i nitrogenoxidanalysatorens rensebeholder.
- INGEN måling
- Der tilsættes 20 μL af NaNO 2-standardkurven i nitrogenoxidanalysatorens rensebeholder. Mål det i henhold til producentens protokol.
- Præparation
- Der tilsættes 20 μL af det konditionerede substrat i nitrogenoxidanalysatorens rensebeholder. Mål det i henhold til producentens protokol.
- BeregnNO2-koncentrationerne baseret på standardkurvekalibreringen. De værdier, der opnås ved hjælp af det samlede volumen af det konditionerede substrat, justeres, analyseres 6,11.
- Fluorescerende farvning af F-actin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typisk kan klæbede EC'er observeres 3-4 dage efter ekstraktion. hSVEC'er danner oprindeligt klynger af celler og viser en typisk "brostensmorfologi" (figur 1B). De udtrykker EC-markørerne CD31 (figur 1C, D) og VE-cadherin (figur 1D). hSVEC'er kan let formeres på en ikke-coatet behandlet cellekulturskål, og de bevarer endotelfænotypen i kultur op til otte passager.
hSVEC'er justeres i strømningsretningen, når de dyrkes under forskydningsspænding (figur 2A). Forskydningsspændingen på 20 dyn/cm2 i 72 timer inducerer ekspressionen af typiske mekanofølsomme gener, KLF2, KLF4 og NOS3, hvilket indikerer effektiviteten af forskydningsstimulus i hSVEC'er (figur 2B)12,13,14.
Det cykliske strækresultat afhænger af intensiteten på hSVEC'erne. Celler under lav strækning viser et kortikalt F-actinmønster svarende til statiske celler (figur 3A) uden ændring i NO-frigivelsen op til 72 timer (figur 3B). Arterielle niveauer af strækning ombygger actincytoskelettet efter 24 timer (figur 3A) og reducerer NO-frigivelse efter 72 timer (figur 3B).
Figur 1: Endotelceller fra humane saphenøse vener (hSVEC'er) udviser typisk endotelmorfologi og specifik EC-markørekspression. (A) Saphenøs venesegment opfyldt med type II kollagenaseopløsning til ekstraktion af EC'er. B) Repræsentativt tidsforløb for væksten i hSVEC efter ekstraktion. Efter 3-4 dage er det muligt at visualisere klynger af celler, der formerer sig, indtil de når sammenløb. Skalabjælke = 100 μm. (C) FACS-analyse af dyrkede hSVEC'er ved passage 1. Den grønne linje indikerer, at 99,7% af cellepopulationen er positiv for den endotelspecifikke markør CD31. Den sorte linje er den negative kontrol. (D) Immunfarvning for CD31 (grøn), (E) VE-cadherin (grøn) og kerner DAPI (blå) i hSVEC'er ved passage 1. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: hSVEC'er justeres i strømningsretningen og udtrykker mekanofølsomme gener, når de udsættes for ensrettet forskydningsspænding. Konfluentcellemonolag af hSVEC'er dyrket under statiske eller ensrettede laminære forskydningsspændingsforhold. A) Fasekontrastbilleder (øverst) og phalloidinfarvning (nederst) af hSVEC'er, der udsættes for en forskydningsspænding på 20 dyn/cm2 i72 timer. Grøn: actinfilamenter; blå: cellekerner. Skalabjælke = 100 μm (fasekontrast) og 20 μm (fluorescens). (B) Genekspression af KLF2, KLF4 og NOS3 bestemt ved qRT-PCR. Værdier repræsenterer middelværdien ± SEM. ** p < 0,01 versus den statiske gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: HSVEC-fænotypen under cyklisk strækning afhænger af den anvendte intensitet . (A) Konfluentcellemonolag af hSVEC'er dyrket under statisk, lav (venøs) eller høj (arteriel) strækning i en fleksibel bundplade i 24 timer. Fasekontrastbilleder (øverst) og phalloidinfarvning (nederst), der viser actinfibrene (rød) og kerner med DAPI (blå). Skalabjælke = 100 μm (fasekontrast) og 50 μm (fluorescens). (B) Der blev estimeret NO-måling baseret på NO2-akkumulering i cellekulturmediet i72 timer. Værdier repræsenterer middelværdien ± SEM. *** p < 0,001 versus den statiske gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gen | Protein | Fremad 5'-3' | Baglæns 5'-3' | ||
| KLF2 | Krüppel-lignende faktor 2 | CCACTCACACCTGCAGCTA | GTGGTAGGGCTTCTCACCTG | ||
| KLF4 | Kruppel-lignende faktor 4 | CACCTGGCGAGTCTGACATG | CAGCGGTTATTCGGGGCAC | ||
| NOS3 | nitrogenoxidsyntase, endotelial | GCACAGTTACCAGCTAGCCA | GCCGGGGACAGGAAATAGTT | ||
| PPIA | Cyclophilin A, | CATTTGGTGCAAGGGTCACA | TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC | ||
| Peptidylprolyl isomerase A | |||||
Tabel 1: qRT-PCR-primere til forskydningsspænding og referencegener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det saphenøse venesegment skal have været mindst 2 cm for at kunne isolere hSVEC'er med succes. Små segmenter er vanskelige at håndtere og binde enderne af beholderen for at opretholde kollagenaseopløsningen for at isolere cellerne. Det reducerede luminale overfladeareal giver ikke tilstrækkelige celler til at udvide kulturen. For at minimere risikoen for kontaminering med ikke-EC'er skal manipulationen af saphenøse venesegmentet være meget skånsom under hele proceduren. Det er vigtigt at være forsigtig, når pipettspidserne indføres i lysfladerne for at fjerne blod og under introduktionen af kollagenaseopløsningen. Eksponeringen for enzymopløsning bør kontrolleres meget velkontrolleret (højst 1 time) for at reducere kontaminering af kulturen med ikke-EC'er. Brugen af et specifikt EC-medium suppleret med vækstfaktorcocktailen er afgørende for væksten i hSVEC-kulturen. Det ekstra heparin i de første dage af dyrkning er vigtigt for at reducere resterende røde blodlegemer fra venesegmentet og for at hæmme spredning af glatte muskelceller15. Når du sender cellerne til eksperimenter eller til opretholdelse af kulturen, skal du sørge for at plade cellerne med en sammenløb højere end 40%. EF'erne har brug for et minimum af kontakt for at sikre god spredning og overlevelse. HSVEC'erne kan let dyrkes på en ikke-belagt (f.eks. Gelatine eller fibronectin) overflade. Imidlertid vil belægningen i de første dage efter EF-ekstraktion øge EC-vedhæftning og udbytte. HSVEC'erne har en konstant proliferationshastighed og opretholder endotelfænotypen op til otte passager uden at udtrykke mesenkymale cellemarkører (såsom SM22 og calponin). Det er vores erfaring, at spredningshastigheden kan variere afhængigt af vævsdonoren, men ikke med en cellepassage. Det anbefales at kryopræservere hSVEC'er i FBS med 5% DMSO for at øge levedygtigheden efter optøning af cellerne.
For at gennemføre et forskydningsstresseksperiment er der kritiske trin, der skal overvejes. For at undgå, at der dannes luftbobler inde i systemet, skal perfusionssættet og konnektorerne ekvilibreres natten over ved 37 °C og 5 % CO2. Boblerne kan blokere strømmen gennem systemet eller beskadige endotelmonolaget, der forstyrrer cellefænotypen. Ved såning af cellerne i strømningskammerobjektglasset anbefales det at have det sammenflydende til brug efter 4 timer eller den næste dag. Derudover er det obligatorisk at ændre diasmediet hver dag under statiske forhold, hvis eksperimentet kører i flere dage. Volumenet af strømningskammerobjektglasset er ~ 160 μL, og det er ikke tilstrækkeligt at opretholde cellerne i lange perioder med kultur. Systemet har den fordel, at det let observerer cellerne ved mikroskopi (brightfield/fasekontrast eller farvning til fluorescensmikroskopi). Begrænsningen er det lave udbytte af proteiner (20-25 μg/dias) og RNA (1 μg/dias). For at overvinde dette tillader systemet tilslutning af flere dias i en serie ved hjælp af den samme fluidiske enhed (se producentens instruktioner). Derefter er det muligt at bruge volumenet af lysisbufferen til et dias for at ekstrahere proteinet eller RNA'et fra flere dias.
Stretchsystemet er let at håndtere og tillader anvendelse af forskellige intensiteter og typer strækning. Det er vigtigt at smøre alle læssestationer før hvert forsøg for at reducere friktionen mellem kulturplademembranen og stationen og for at sikre korrekt fordeling af den cykliske stamme. Sørg for, at pladerne er helt forseglet til bundpladen for at producere det vakuum, der er nødvendigt for at nå den ønskede strækning. Den ækaksiale stimulus producerer ikke en ensartet belastning inde i brønden. Cellerne ved kanten af brønden skal kasseres som angivet af producenten. Membranområdet af interesse bestemmes ud fra lastestationens diameter og forlængelsesprocenten. Det er muligt at udføre immunfarvningen i hele membranen eller skære den i mindre stykker for at reducere mængden af antistoffer, der anvendes i analysen. I dette tilfælde skal membranerne håndteres meget omhyggeligt og undgå beskadigelse af cellerne. Forskere bør også passe på ikke at vende membranen på hovedet og miste cellerne, mens de foretager farvningen. Det er altid muligt at bekræfte membranens korrekte overflade med cellerne under optisk mikroskopi.
Den største begrænsning ved in vitro-undersøgelser som disse er, at de ikke fuldt ud rekapitulerer in vivo-miljøet. Af denne grund er det vigtigt altid at udføre analyser for at sikre, at hSVEC'er opretholder EC-fænotypen (udtrykker EC-markører) og reproducerer forventede resultater under mekanisk belastning (F-actinorientering og regulering/produktion af mekaniske responsproteiner).
Sammenfattende giver vi en detaljeret procedure til isolering af hSVEC'er og udsættelse af dem for kontrollerede niveauer af forskydningsspænding og strækning. Når et SV-transplantat pludselig udsættes for arterielle tilstande efter CABG, opstår endotelskader og bidrager til transplantatfejl. Disse protokoller kan være medvirkende til at fremme vores forståelse af, hvordan mekaniske kræfter påvirker hSVEC-dysfunktion forbundet med venetransplantatsygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
JEK støttes af tilskud fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 og 2013/17368-0] og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 og 309179/2013-0). AAM støttes af tilskud fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
