Summary
Denne artikel beskriver en enkel, billig metode til registrering af Caenorhabditis elegans adfærd på græsplænen ved hjælp af let tilgængelige genstande såsom en smartphone og en lysdiode (LED) lysboks. Vi leverer også et Python-script til at behandle videofilen i et format, der er mere modtageligt for at tælle.
Abstract
Når den udsættes for giftige eller patogene bakterier, viser nematoden Caenorhabditis elegans en lært græsplæneundgåelsesadfærd, hvor ormene gradvist forlader deres fødekilde og foretrækker at forblive uden for bakterieplænen. Analysen er en nem måde at teste ormenes evne til at fornemme eksterne eller interne signaler til korrekt at reagere på skadelige forhold. Selvom det er et simpelt assay, er tælling tidskrævende, især med flere prøver, og analysevarigheder, der spænder over natten, er ubelejlige for forskere. Et billeddannelsessystem, der kan afbilde mange plader over en lang periode, er nyttigt, men dyrt. Her beskriver vi en smartphone-baseret billeddannelsesmetode til registrering af græsplæneundgåelse i C. elegans. Metoden kræver kun en smartphone og en lysdiode (LED) lysboks for at fungere som en transmitteret lyskilde. Ved hjælp af gratis time-lapse-kameraapplikationer kan hver telefon afbilde op til seks plader med tilstrækkelig skarphed og kontrast til manuelt at tælle orme uden for plænen. De resulterende film behandles i 10 s audio video interleave (AVI) filer for hvert timetidspunkt og beskæres derefter for at vise hver enkelt plade for at gøre dem mere modtagelige for tælling. Denne metode er en omkostningseffektiv måde for dem, der ønsker at undersøge undgåelsesfejl og kan potentielt udvides til andre C. elegans-assays.
Introduction
Blandt de mange fordele ved at studere C. elegans giver dets enkle nervesystem mulighed for at studere, hvordan ændringer på genetisk og cellulært niveau påvirker netværksfunktion og adfærdsmæssig output. På trods af at have et begrænset antal neuroner, C. elegans viser en bred vifte af komplekse adfærd. En af disse er plæneundgåelse, hvor den bakterivorøse nematode reagerer på en skadelig fødekilde ved at forlade bakterieplænen. C. elegans undgår græsplæner med patogene bakterier 1,2,3, græsplæner med bakterier, der producerer toksiner eller er tilsat toksiner1,4, og endda RNAi-ekspressive bakterier, hvis målgenknockdown er skadeligt for ormenes sundhed 4,5. Undersøgelser har vist, at orme reagerer på eksterne signaler såsom metabolitter produceret af de patogene bakterier 1,6 eller interne signaler, der indikerer, at fødevaren gør dem syge 4,7. Disse signaler behandles gennem konserverede signalveje, såsom mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) vej og den transformerende vækstfaktor beta (TGFβ) vej, og kræver kommunikation mellem tarmen og nervesystemet 4,6,7,8.
Selvom analysen er enkel, udvikler den lærte adfærd sig over mange timer, ofte natten over. Mens der er mutanter, der ikke er i stand til at forlade, i hvilket tilfælde scoringsundgåelse på kun et tidspunkt er tilstrækkeligt til at demonstrere defekten, forlader mange mutanter til sidst, men er langsommere til at komme ud. For disse skal ormenes bevægelse spores hvert par timer, hvilket kan være svært at gøre natten over. Tælling i sig selv tager også tid, hvilket skaber en forsinkelsestid mellem pladerne og begrænser dermed antallet af plader, der kan testes på samme tid. Brug af en billeddannelsesopsætning til at registrere mange plader samtidigt i hele analysens varighed ville være meget nyttigt, men omkostningerne ved opsætning kan være uoverkommelige, afhængigt af forskningslaboratoriets finansieringssituation.
For at løse dette udtænkte vi en meget enkel metode, der bruger smartphones til at registrere undgåelsesanalyser. Hver telefon kan optage time-lapse-videoer med op til seks analyseplader. For at levere transmitteret lys bruger vi en lysdiode (LED) lysboks, der nemt kan købes online. Assayplader placeres på en forhøjet platform, understøttet af hule rektangulære tunneler, der fokuserer det indkommende lys og skaber kontrast. Vi leverer også et Python-script, der konverterer videoerne til AVI-filer (audio video interleave), der viser 10 s klip af hvert timetidspunkt. Videoerne beskæres derefter til individuelle plader og gemmes i separate filer til brug for manuel optælling.
Metoden giver en billig procedure, der også er ekstremt nem at bruge, ved hjælp af elementer, der er let tilgængelige for de fleste mennesker. Her beskriver vi metoden ved hjælp af det veletablerede plæneundgåelsesassay mod det humane patogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), hvis protokol tidligere er beskrevet 2,9. Endelig gennemgår vi også overvejelser og begrænsninger ved billeddannelsesmetoden for dem, der ønsker at anvende den på andre C. elegans adfærdseksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opsætning af billeddannelsesapparatet (figur 1A-E)
- Sørg for, at et smartphone-kamera med følgende minimumskrav er tilgængeligt:
12 megapixel (MP) kamera
Video i 1080p-opløsning
5 GB lagerplads (20 minutters video er 3-4 GB)
Time-lapse video app fra applikationsbutikken (gratis applikationer tilgængelige) - Placer LED-lysboksen på den nederste rille i 25 °C-inkubatoren, hvor analysen finder sted.
- For at skjule det stiplede mønster på LED-lysoverfladen, spred to ark væv for at dække hele overfladen af LED-boksen.
- Lav et forhøjet trin for prøven (figur 1A, D). Det forhøjede trin er et klart plastark understøttet af hule rektangulære tunneler. Tunneler fungerer som en kondensator til at fokusere lys, hvilket giver bedre kontrast til prøven (figur 1C). Sørg for, at tunnelens vægge er noget mørke for at minimere lysspredning. Denne undersøgelse brugte brune papirkasser. Tunnelens dimension er 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (B x L x H). LED-lysboksen kan passe op til fem tunneler.
- Placer et andet stativ over scenen for at placere telefonerne til optagelse (figur 1B, E). Hver telefon optager tre til seks plader (en til to rækker med tre plader), så juster rackhøjden i overensstemmelse hermed. Dette vil være ca. 15 cm over prøven (figur 1B).
- Sæt en strømskinne inde i inkubatoren for at tilslutte telefonerne under optagelse natten over.
2. Forberedelse af buffere og medier
- Der fremstilles M9-buffer ved tilsætning af 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO4 og 5 g NaCl til 1 liter destilleret H2O. Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 20 minutter. Bufferen afkøles, og der tilsættes derefter 1 ml 1 MMgSO4.
- Forbered 1 M KPO 4-buffer ved at tilsætte 108,3 g KH 2 PO 4 og 35,6 g K 2 HPO4 til 1 liter H2O. Juster pH til 6,0 ved at tilføjeKOH. Steriliser ved autoklavering.
- Forbered ormeblegningsopløsning ved at blande 1 ml blegemiddel, 0,4 ml 1 M NaOH og 2,6 ml H2O.
- Forbered nematodevækstmedier (NGM) agarplader.
- Der tilsættes 3 g NaCl, 2,5 g bacto pepton og 17 g bacto agar i en 3 L kolbe. Tilsæt 975 ml destilleret vand og indsæt en omrøringsstang.
- Steriliseres ved autoklavering, afkøles derefter til 55 °C, og der tilsættes 1 ml kolesterol (5 mg/ml i ethanol), 1 ml 1 MCaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 og 25 ml 1 M KPO4-buffer (pH 6,0). Rør for at blande godt. Hæld i 6 cm plader. Lad pladerne tørre i mindst 2 dage.
- NGM-agarplader med OP50 E. coli fremstilles ved pipettering af ca. 1 ml af en natkultur af OP50 til dannelse af en græsplæne af bakterier. Lad det stå ved stuetemperatur (RT), indtil det er klar til brug.
3. Fremstilling af NGM-plader med høj pepton (til PA14)
BEMÆRK: Disse plader skal laves mindst 5 dage før analysen.
- Gør NGM indeholdende 0,35% pepton. Bland 0,3 g NaCl, 0,35 g bacto pepton og 1,7 g bacto agar i en 250 ml Erlenmeyerkolbe. Tilsæt 97,5 ml destilleret vand og indsæt en omrøringsstang.
- Kolbens munding dækkes med aluminiumsfolie og autoklave ved 121 °C i 20 min.
- Afkøles til 55 °C og tilsættes 0,1 ml kolesterol (5 mg/ml i ethanol), 0,1 ml 1 MCaCl2, 0,1 ml 1 MMgSO4 og 2,5 ml 1 M KPO4 buffer (pH 6,0). Rør for at blande godt.
- Hæld NGM med høj peptone i 35 mm petriskåle.
- Tør pladerne i mindst 2 dage.
4. Synkronisering af orme ved blegning
BEMÆRK: Start dette trin 3 dage før analysen.
- Tag plader med gravide voksne orme og saml dem i et 1,7 ml mikrorør ved at vaske pladerne med M9-buffer.
- Fjern så meget væske som muligt, og tilsæt derefter 400 μL blegeopløsning. Vent ca. 4-5 minutter med intermitterende hvirvelstrøm, indtil de voksne ormlegemer går i stykker og frigiver æggene.
- Der tilsættes M9-buffer for at fylde resten af mikrorøret for at fortynde blegeopløsningen. Spin ved maksimal hastighed (12.000 til 13.000 x g) i 1-2 s. Supernatanten fjernes og vaskes yderligere tre gange med M9-buffer.
- Overfør æggene til en tom 35 mm petriskål indeholdende M9-buffer. Lad æggene klække natten over ved 20 °C. I mangel af mad vil klækkede orme arrestere på L1-larvestadiet og synkronisere udviklingsstadiet for alle orme.
BEMÆRK: Overtræk af 35 mm petriskålen med gelatineopløsning (0,05% gelatine i autoklaveret vand) kan forhindre æggene i at klæbe til bunden og minimere ægtab. - Den næste dag overføres L1-trinorm til OP50-frøede NGM-plader.
- Udruget ormene ved 20 °C i 53-54 timer, indtil ormene når L4-larvestadiet.
5. Forberedelse af bakterier ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
BEMÆRK: Start dette trin 4 dage før analysen.
- Stribe optøede bakterier fra -80 °C på en Luria Bertani (LB) agarplade uden antibiotika og inkuberes natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: Brug altid friske bakterier. Stribede plader skal opbevares ved 4 °C i højst 1 uge. - Pod en enkelt koloni i 3 ml kongens bouillon og dyrk natten over i en 37 ° C rystekuvøse.
- Den næste dag sås 7 μL af natkulturen på NGM-pladerne med højt peptonindhold og inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
- Flyt de frøede plader til RT og inkuber i yderligere 24 timer før brug. Når du er klar, skal du bruge pladen inden for de næste 24 timer.
6. Forberedelse til optagelse
BEMÆRK: Gør dette lige før analysen.
- Sæt smartphonen i strømstikket, der er tilsluttet en stikkontakt. Sørg for at deaktivere indstillingen for automatisk låsning for at forhindre, at telefonen vender tilbage til låseskærmen under optagelse.
- Åbn time-lapse-kameraappen, og indstil time-lapse-intervallet til 2 sekunder. Indstil videokvaliteten til 1080p ved 30 fps.
- Placer smartphonen med skærmen opad for at optage med det bagudvendte kamera. Kontroller skærmen for at sikre, at papirkassetunnellerne passer inden for synsfeltet.
7. Analyse til undgåelse af græsplæne
- Brug en platintrådplukker til at overføre 30 synkroniserede L4-trinorme (53-54 timer fra L1) til PA14-pladen. Placer ormene midt på bakterieplænen. For hver tilstand i denne undersøgelse blev to plader testet (dvs. 60 orme pr. Tilstand).
- De to plader anbringes på optageapparatets forhøjede trin med låget nedad. Siden med agaren vender opad mod kameraet.
- På smartphoneskærmen skal du trykke på, hvor pladen er, så kameraet kan fokusere på analysepladerne. Det hjælper at have en etiket eller skrift på pladen, da kameraet kan bruge det til at fokusere korrekt.
BEMÆRK: Skrivning på bunden af pladerne forstyrrer ikke billeddannelsen af orme, så længe den er mod kanten. Heldigvis forbliver orme tæt på græsplænen, selv efter at de forlader, så en uhindret udsigt er kun nødvendig for det umiddelbare område omkring plænen. - Start optagelsen.
- Når optagelsen er startet, skal du tilføje flere plader til scenen. Der kan være en betydelig forsinkelsestid mellem pladerne på grund af den tid det tager at overføre orme ved at plukke. Bemærk forsinkelsestiden bagefter, så hver betingelse kan tælles på det tidspunkt, den begyndte.
- Optag i 20 timer fra det sidste sæt plader, der er placeret på scenen. I den endelige time-lapse-video vil 20 timers optagelse resultere i en 20 minutter lang video.
BEMÆRK: Det kan være umagen værd at tælle ormene direkte fra pladerne efter analysen, i det mindste i begyndelsen ved de første par lejligheder. Dette kan sammenlignes med værdier opnået gennem videobilleddannelse for at sikre, at de giver lignende tal.
8. Behandling af video ved hjælp af Python-script
- Overfør filmfilen til en computer til behandling. Udvidelsen vil være en MOV (iPhone) eller MP4-fil (Android).
- Brug en Python-kode til at behandle videoerne. Koden kan findes på github.com/khyoon201/wormavoid.
- For at køre Python-scripts skal du sikre dig, at følgende er forudinstalleret på computeren: ffmpeg, et værktøj til konvertering af videofiler (retninger til installation findes på sin hjemmeside, ffmpeg.org/download), og Python-pakkerne os, pandas, tkinter og ffmpeg-python.
- Find dimensioner og koordinater for hver plade ved hjælp af extract_frame.py-scriptet.
- Kør extract_frame.py scriptet. Der vises et vindue for at vælge den videofil, der er gemt på computeren. Når kørslen er afsluttet, vises en jpeg-fil med samme navn i samme mappe.
- Åbn jpeg-filen i ImageJ (imagej.org).
- Vælg Analysér > Indstil målinger i menuen. Sørg for, at feltet Vis etiket er markeret (figur 2A). Luk vinduet.
- Brug værktøjet Lige linje til at måle diameteren på en plade ved at tegne en streg på tværs af den og derefter vælge Analysér > mål i menuen. Hvis videoen er i 1080p, vil hver plade være ca. 480 pixels bred. Skriv disse oplysninger ned, og luk vinduet Resultater .
- Brug flerpunktsværktøjet til at markere punkter øverst til venstre på hver plade. Disse punkter bliver øverste venstre hjørne af de beskårne videoer (figur 2B). Rækkefølgen betyder noget; Marker i rækkefølge efter, hvornår pladerne blev startet. Når du har oprettet et punkt for alle pladerne, skal du vælge Analysér > mål i menuen. Målinger, herunder punkternes X- og Y-koordinater, vises i vinduet Resultater.
- For at behandle flere videoer skal du gentage processen i ImageJ med andre jpeg-filer. Alle X- og Y-koordinater vises i det samme resultatvindue .
- Gem vinduet Resultater i en csv-fil. Filen skal gemmes i samme mappe som filmfilerne.
- Find starttidspunktet for hver plade.
- Afspil filmen, enten på computeren eller telefonen, og noter starttiderne for hvert sæt plader, der er placeret under kameraet.
- Åbn filen Resultater.csv med koordinaterne, og tilføj en "start" -kolonne. For hver række, der svarer til individuelle plader, skal du indtaste det relevante starttidspunkt i sekunder under kolonnen "start" (hvis starttidspunktet f.eks. er 0:00:08, skal du indtaste 8). Spare.
BEMÆRK: Kolonnenavnet skal være "start" (med små bogstaver uden anførselstegn) for at blive genkendt af det næste script til beskæring og beskæring.
- Beskær og trim videoerne.
- Kør crop_n_trim.py scriptet.
- Når du bliver bedt om det, skal du vælge filen Resultater.csv .
BEMÆRK: Sørg for, at filen Resultater.csv og alle filmfilerne er i samme mappe. - Indtast pladens dimensioner. Indtast den pixelværdi, der blev nævnt tidligere.
BEMÆRK: Scriptet læser nu hver række i filen Resultater.csv for at finde den korrekte filmfil ved at læse filnavnet i kolonnen "etiket" og beskære i henhold til koordinaterne angivet i kolonnerne "X" og "Y". Starttidspunktet for hver plade bestemmes af det tidspunkt, der er angivet i kolonnen "start". Når scriptet er færdig med at køre, vises en mappe med samme navn som filmen efterfulgt af starttidspunktet (f.eks. "Movie1_8"), hvor 10 s videoer svarende til hvert timetidspunkt for analysen gemmes.
9. Manuel optælling ved hjælp af ImageJ
- Åbn hver AVI-fil i ImageJ.
- Tæl ormene, der er synlige uden for plænen. Orme, der overlapper hinanden i en ramme, flyttes normalt fra hinanden i en anden ramme, så de kan tælles korrekt.
- Beregn belægningsgraden for hvert tidspunkt:
Belægningsgrad = (antal orme i alt - antal orme uden for plænen)/orme i alt
BEMÆRK: Ormene bevæger sig ind og ud af plænen under videoen, men dette ændrer ikke resultaterne væsentligt. Prøv at gå med det tal, der ser ud til at være gennemsnittet, eller antallet af orme på det nøjagtige timetidspunkt (5 s inde i videoen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første video produceret af scriptet er 1 time fra starten af analysen. Videoen i 0 timer gemmes ikke, da orme starter analysen inde i plænen, så belægningsgraden er altid 100%.
Wild-type N2 orme sammenlignes med npr-1 mutanter, hvis græsplæne undgåelsesdefekt er veletableret i litteraturen 6,10 (figur 3A-E). Som det kan ses i vildtypen, forlader orme gradvist bakterieplænen og forbliver udenfor (figur 3A, B). Resultaterne afbildes i en graf for at vise ændringen i belægningsgraden over tid (figur 3B). Orme udenfor ses tydeligt i videoen, men orme inde i den tykke bakterieplæne er sværere at skelne (figur 3D, E). Men fordi der er nøjagtigt 30 orme i hver plade, kan antallet af orme, der stadig er inde i plænen, beregnes ved at trække de tællede orme fra de samlede 30.
Selvom denne antagelse potentielt kunne medføre tællefejl, især hvis nogle orme ender nær pladens vægge, hvor det kan være svært at se, var dette ikke en væsentlig bekymring. Når tællinger foretaget direkte fra pladerne blev sammenlignet med tællinger fra afbildede orme, viste tællinger fra afbildede orme sig at være meget nøjagtige. Når tre forsøg for hver stamme blev beregnet som gennemsnit sammen, gav N2- og npr-1-stammerne henholdsvis 99,5% og 96,2% nøjagtighed (figur 3B,C). Det skal bemærkes, at der var en lidt højere tendens til at savne et par npr-1-orme på grund af dets høje bevægelighed11, mens vildtypeorme havde tendens til at blive tæt på græsplænen.
Figur 1: Billeddannelsesapparater . (A) En skematisk visning af billeddannelsesopsætningen. B) Billeddannelsesapparatur opstillet inde i en inkubator indstillet til 25 °C til PA14-plæneundgåelsesassays. (C) Sammenligning af orme afbildet med eller uden tunnelen. (D) Et nærbillede af, hvordan pladerne er monteret oven på tunnellerne. (E) Telefonens højde justeres, så der kan være op til seks 35 mm plader på skærmen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Bestemmelse af pladekoordinater ved hjælp af ImageJ. (A) I Analysér > sæt målinger skal feltet Vis etiket være markeret (rød stiplet boks). (B) Et enkelt billede udtrukket fra videoen bruges til at afbilde koordinater, der bruges til beskæring. Punkter, der er lavet ved hjælp af flerpunktsværktøjet , er i gult. Disse fungerer som de øverste venstre hjørner af de endelige beskårne videoer (markeret som en stiplet hvid boks). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billed- og analyseresultater. (A) Efter flere timers PA14-eksponering forlader de fleste orme plænen og bliver udenfor. (B) Repræsentative resultater af analysen til undgåelse af græsplæner. Bevægelsen af orme følges hver time for at bestemme belægningsgraden. De åbne kvadrater på tidspunktet 20 timer angiver gennemsnitsværdien bestemt ved direkte tælling fra plader fra C. (C) For at vurdere nøjagtigheden af de tællinger, der blev foretaget gennem videoen, blev ormene også talt direkte i slutningen af analysen og sammenlignet med de værdier, der blev opnået ved videobilleddannelse. Værdier angiver ormens numre inden for/uden for plænen. (D,E) L4-orme ses tydeligt uden for bakterieplænen (sort pilespids), mens orme indeni er sværere at se (hvid pilespids). Orme, der overlapper hinanden i en ramme, kan normalt skelnes fra hinanden i en anden ramme fra den samme film (sort konturpilespids). Tallet nederst til højre angiver billednummeret ud af det samlede antal billeder i 10 s videoklippet (30 billeder / s). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Billeddannelse af dyrs adfærd, snarere end at stole på direkte observation, er ikke kun praktisk, men har også fordelen ved at efterlade visuel dokumentation. Dette giver mulighed for blind analyse af en objektiv tredje person eller kan endda bruges til automatiseret analyse ved hjælp af billedgenkendelsesteknikker. På trods af fordelene er det standardudstyr, der normalt tilbydes, højt i omkostninger, så man er forpligtet til opsætningen, når den er købt.
Brug af smartphones til at indsamle videooptagelser af simpel C. elegans adfærd giver flere fordele. Det kræver minimal fortrolighed med teknisk viden og er ekstremt let at konfigurere ved hjælp af varer, der kan købes nemt og billigt. En anden fordel er bærbarheden af en smartphone - den kan passe ind i små rum, og da den har sin egen opbevaring, behøver den ikke at være tilsluttet tilbage til en computer. Dette gør det muligt at placere opsætningen hvor som helst, selv når pladsen er ekstremt begrænset. Det er praktisk at flytte de optagede videofiler til computeren - filerne er ikke så store, da de er kodet i et komprimeret MPEG-4-format. Flytning af filer er især praktisk, når trådløse muligheder for filoverførsel er tilgængelige.
Fordi ormene er afbildet uden nogen forstørrelse, består ormene, der er fanget i videoerne, kun af nogle få pixels. L4-orme er lige store nok til at blive fanget uden forstørrelse, men den lille pixelstørrelse begrænser brugen til billedgenkendelse og bevægelsessporing i høj kvalitet. Brug af zoomobjektivet, der tilbydes af nyere modeller eller montering af en zoomobjektivadapter, kan hjælpe med at få mere detaljerede billeder, selvom vi ikke har prøvet dette selv. Dette ville dog også reducere synsfeltet og antallet af plader, der kan afbildes samtidigt.
For at gøre optællingen lettere beskæres videoerne til at vise individuelle plader og trimmes til 10 s videoer svarende til hver time af analysen. Dette er også vigtigt, da konvertering af videoer til AVI-format øger filstørrelsen betydeligt, og beskæring og trimning af videoerne sikrer, at filstørrelserne er mere håndterbare. De beskårne AVI-filer kan også potentielt bruges til at tælle ormene automatisk med en billedgenkendelsesalgoritme. For vildtypestammen fandt vi, at en grov form for automatiseret tælling er mulig i ImageJ ved hjælp af simpel tærskelværdi. Men når mutanter med en mindre kropsstørrelse anvendes, producerer automatiserede tællinger flere fejl.
Der har været mange bestræbelser på at afbilde orme og automatisere analyser. Traditionelt blev orme optaget gennem et kamera fastgjort til et dissekerende mikroskop, som normalt kun tillader billeddannelse af nogle få orme på én gang på grund af dets begrænsede synsfelt. Behovet for at afbilde flere orme samtidigt for analyser med højere gennemstrømning skubbede forskere til at udvikle kreative billeddannelsesmetoder. En måde var at bruge modificerede flatbedscannere til at afbilde levetidsanalyser, såsom WormScan eller Lifespan Machine12,13. En scanner med høj opløsning kan afbilde orme, så levende orme i bevægelse kan skelnes fra ubevægelige døde orme.
For at spore ormbevægelser med en højere fps-hastighed er et kamera fastgjort til et objektiv, og orme afbildes uden et mikroskop14,15. Churgin et al., der udviklede WorMotel14, en metode til langsigtet billeddannelse af individuelle orme dyrket i en polydimethylsiloxan (PDMS) multi-well plade, giver detaljerede forklaringer på faktorer, der skal overvejes, når du vælger det rigtige kamera og objektiv16. Denne metode har også den ekstra fordel, at den er relativt beskeden i omkostninger.
Indfangning af orme uden mikroskop resulterer uundgåeligt i billeder, der mangler opløsningen til detaljeret analyse af ormens bevægelse eller gang. For at afhjælpe dette anvendte Barlow et al. en strategi med at bruge seks kameraer arrangeret i en tre gange to array for at fange en enkelt 96-brønds plade17. Hvert kamera er indstillet til kun at afbilde fire x fire brønde på 96-brøndpladen, hvilket resulterer i en meget højere størrelse og opløsning af de afbildede orme.
Fordi C. elegans har en klar krop, skal belysningen også justeres for at give kontrast fra baggrunden. Vores metode brugte belysning fra en flad LED-lysboks, passeret gennem en smal tunnel for at fokusere lyset. Dimensionerne blev bestemt af størrelsen på den afbildede plade; Bredden på 5,5 cm passer til den 35 mm plade, der anvendes til undgåelsesanalysen. For at afbilde et større område skal tunnelen være bredere, men vi fandt ud af, at højden også skal øges for at opnå den samme fokuseringseffekt. Ulempen er, at med højere tunneler kan flere af væggene ses gennem pladen, hvilket forhindrer udsigten ved kanten af pladen. En anden strategi, der kan anvendes, er at bruge LED-strenglys arrangeret i en cirkulær ring (LED-ring). Lyset, der kommer fra mange retninger, spredes på overfladen af ormens krop og skaber lyse orme mod en mørk baggrund14,16,18. Dette kan fungere ikke kun for større plader, men til billeddannelse i mindre rum, der ikke kan passe til en LED-lysboks.
Med mange tilgængelige billeddannelsesstrategier udviklet af ormesamfundet, kan forskere måske prøve et par muligheder for at finde den rigtige, der passer til deres behov. Den billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, er billig og tilgængelig nok til, at den let kan bruges i bachelorklasseværelser eller som en midlertidig løsning, før du investerer i en langsigtet opsætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen angivne interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Deok Joong Lee for kritisk læsning af manuskriptet og test af Python-koden. Denne forskning blev sponsoreret af National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) og 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
