En smartphone-baseret billeddannelsesmetode til C. elegans Lawn Avoidance Assay
Summary
Denne artikel beskriver en enkel, billig metode til registrering af Caenorhabditis elegans adfærd på græsplænen ved hjælp af let tilgængelige genstande såsom en smartphone og en lysdiode (LED) lysboks. Vi leverer også et Python-script til at behandle videofilen i et format, der er mere modtageligt for at tælle.
Abstract
Når den udsættes for giftige eller patogene bakterier, viser nematoden Caenorhabditis elegans en lært græsplæneundgåelsesadfærd, hvor ormene gradvist forlader deres fødekilde og foretrækker at forblive uden for bakterieplænen. Analysen er en nem måde at teste ormenes evne til at fornemme eksterne eller interne signaler til korrekt at reagere på skadelige forhold. Selvom det er et simpelt assay, er tælling tidskrævende, især med flere prøver, og analysevarigheder, der spænder over natten, er ubelejlige for forskere. Et billeddannelsessystem, der kan afbilde mange plader over en lang periode, er nyttigt, men dyrt. Her beskriver vi en smartphone-baseret billeddannelsesmetode til registrering af græsplæneundgåelse i C. elegans. Metoden kræver kun en smartphone og en lysdiode (LED) lysboks for at fungere som en transmitteret lyskilde. Ved hjælp af gratis time-lapse-kameraapplikationer kan hver telefon afbilde op til seks plader med tilstrækkelig skarphed og kontrast til manuelt at tælle orme uden for plænen. De resulterende film behandles i 10 s audio video interleave (AVI) filer for hvert timetidspunkt og beskæres derefter for at vise hver enkelt plade for at gøre dem mere modtagelige for tælling. Denne metode er en omkostningseffektiv måde for dem, der ønsker at undersøge undgåelsesfejl og kan potentielt udvides til andre C. elegans-assays.
Introduction
Blandt de mange fordele ved at studere C. elegans giver dets enkle nervesystem mulighed for at studere, hvordan ændringer på genetisk og cellulært niveau påvirker netværksfunktion og adfærdsmæssig output. På trods af at have et begrænset antal neuroner, C. elegans viser en bred vifte af komplekse adfærd. En af disse er plæneundgåelse, hvor den bakterivorøse nematode reagerer på en skadelig fødekilde ved at forlade bakterieplænen. C. elegans undgår græsplæner med patogene bakterier 1,2,3, græsplæner med bakterier, der producerer toksiner eller er tilsat toksiner1,4, og endda RNAi-ekspressive bakterier, hvis målgenknockdown er skadeligt for ormenes sundhed 4,5. Undersøgelser har vist, at orme reagerer på eksterne signaler såsom metabolitter produceret af de patogene bakterier 1,6 eller interne signaler, der indikerer, at fødevaren gør dem syge 4,7. Disse signaler behandles gennem konserverede signalveje, såsom mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) vej og den transformerende vækstfaktor beta (TGFβ) vej, og kræver kommunikation mellem tarmen og nervesystemet 4,6,7,8.
Selvom analysen er enkel, udvikler den lærte adfærd sig over mange timer, ofte natten over. Mens der er mutanter, der ikke er i stand til at forlade, i hvilket tilfælde scoringsundgåelse på kun et tidspunkt er tilstrækkeligt til at demonstrere defekten, forlader mange mutanter til sidst, men er langsommere til at komme ud. For disse skal ormenes bevægelse spores hvert par timer, hvilket kan være svært at gøre natten over. Tælling i sig selv tager også tid, hvilket skaber en forsinkelsestid mellem pladerne og begrænser dermed antallet af plader, der kan testes på samme tid. Brug af en billeddannelsesopsætning til at registrere mange plader samtidigt i hele analysens varighed ville være meget nyttigt, men omkostningerne ved opsætning kan være uoverkommelige, afhængigt af forskningslaboratoriets finansieringssituation.
For at løse dette udtænkte vi en meget enkel metode, der bruger smartphones til at registrere undgåelsesanalyser. Hver telefon kan optage time-lapse-videoer med op til seks analyseplader. For at levere transmitteret lys bruger vi en lysdiode (LED) lysboks, der nemt kan købes online. Assayplader placeres på en forhøjet platform, understøttet af hule rektangulære tunneler, der fokuserer det indkommende lys og skaber kontrast. Vi leverer også et Python-script, der konverterer videoerne til AVI-filer (audio video interleave), der viser 10 s klip af hvert timetidspunkt. Videoerne beskæres derefter til individuelle plader og gemmes i separate filer til brug for manuel optælling.
Metoden giver en billig procedure, der også er ekstremt nem at bruge, ved hjælp af elementer, der er let tilgængelige for de fleste mennesker. Her beskriver vi metoden ved hjælp af det veletablerede plæneundgåelsesassay mod det humane patogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), hvis protokol tidligere er beskrevet 2,9. Endelig gennemgår vi også overvejelser og begrænsninger ved billeddannelsesmetoden for dem, der ønsker at anvende den på andre C. elegans adfærdseksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Billeddannelse af dyrs adfærd, snarere end at stole på direkte observation, er ikke kun praktisk, men har også fordelen ved at efterlade visuel dokumentation. Dette giver mulighed for blind analyse af en objektiv tredje person eller kan endda bruges til automatiseret analyse ved hjælp af billedgenkendelsesteknikker. På trods af fordelene er det standardudstyr, der normalt tilbydes, højt i omkostninger, så man er forpligtet til opsætningen, når den er købt.
Brug af smartphones til at …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Deok Joong Lee for kritisk læsning af manuskriptet og test af Python-koden. Denne forskning blev sponsoreret af National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) og 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
