שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay
Summary
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וזולה לתיעוד התנהגות הימנעות מדשאה של Caenorhabditis elegans, באמצעות פריטים זמינים כגון טלפון חכם וקופסת אור פולטת אור (LED). אנו מספקים גם סקריפט Python לעיבוד קובץ הווידאו לפורמט נוח יותר לספירה.
Abstract
כאשר היא נחשפת לחיידקים רעילים או פתוגניים, הנמטודה Caenorhabditis elegans מפגינה התנהגות נלמדת של הימנעות מדשאה, שבה התולעים עוזבות בהדרגה את מקור המזון שלהן ומעדיפות להישאר מחוץ למדשאת החיידקים. הבדיקה היא דרך קלה לבחון את יכולתן של התולעים לחוש רמזים חיצוניים או פנימיים כדי להגיב כראוי לתנאים מזיקים. למרות שמדובר בבדיקה פשוטה, הספירה גוזלת זמן, במיוחד עם דגימות מרובות, ומשכי הבדיקה הנמשכים לילה אינם נוחים לחוקרים. מערכת הדמיה שיכולה לצלם לוחות רבים לאורך תקופה ארוכה היא שימושית אך יקרה. כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון לתיעוד הימנעות מדשאה ב- C. elegans. השיטה דורשת רק טלפון חכם וקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED), שישמשו כמקור אור משודר. באמצעות יישומי מצלמה ללא קיטועי זמן, כל טלפון יכול לצלם עד שש לוחות, עם חדות וניגודיות מספיקות כדי לספור תולעים באופן ידני מחוץ לדשא. הסרטים המתקבלים מעובדים לקבצי 10 s audio video interleave (AVI) עבור כל נקודת זמן של שעה, ולאחר מכן נחתכים כדי להציג כל צלחת בודדת כדי להפוך אותם לנוחים יותר לספירה. שיטה זו היא דרך חסכונית עבור אלה המעוניינים לבחון פגמים הימנעות וניתן להרחיב אותה לבדיקות C. elegans אחרות.
Introduction
בין היתרונות הרבים של חקר C. elegans, מערכת העצבים הפשוטה שלה מציעה הזדמנות לחקור כיצד שינויים ברמה הגנטית והתאית משפיעים על תפקוד הרשת ועל התפוקה ההתנהגותית. למרות שיש להם מספר מוגבל של נוירונים, C. elegans מציגים מגוון רחב של התנהגויות מורכבות. אחד מהם הוא הימנעות מדשאה, שבה הנמטודה החיידקית מגיבה למקור מזון מזיק על ידי עזיבת הדשא החיידקי. C. elegans נמנעים ממדשאות של חיידקים פתוגניים 1,2,3, מדשאות של חיידקים המייצרים רעלים או מתובלים ברעלים1,4, ואפילו חיידקים מבטאי RNAi שהשמדת גן המטרה שלהם מזיקה לבריאות התולעים 4,5. מחקרים הראו כי תולעים מגיבות לרמזים חיצוניים כגון מטבוליטים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים 1,6, או רמזים פנימיים המצביעים על כך שהמזון גורם להם לחלות 4,7. רמזים אלה מעובדים באמצעות מסלולי איתות שמורים, כגון מסלול חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) ומסלול בטא גורם גדילה משתנה (TGFβ), ודורשים תקשורת בין המעי למערכת העצבים 4,6,7,8.
למרות שהבדיקה פשוטה, ההתנהגות הנלמדת מתפתחת במשך שעות רבות, לעתים קרובות בן לילה. בעוד שישנם מוטנטים שאינם מסוגלים לעזוב, ובמקרה זה די בניקוד הימנעות בנקודת זמן אחת בלבד כדי להדגים את הפגם, מוטנטים רבים אכן עוזבים בסופו של דבר אך הם איטיים יותר לצאת. עבור אלה, התנועה של התולעים צריך להיות מעקב כל כמה שעות, אשר יכול להיות קשה לעשות בן לילה. גם הספירה עצמה לוקחת זמן, מה שיוצר זמן השהיה בין הלוחות, ובכך מגביל את מספר הצלחות שניתן לבדוק בו זמנית. שימוש במערך הדמיה כדי להקליט לוחות רבים בו זמנית למשך כל תקופת הבדיקה יהיה שימושי מאוד, אך עלות ההתקנה יכולה להיות אסורה, בהתאם למצב המימון של מעבדת המחקר.
כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה פשוטה מאוד המשתמשת בסמארטפונים כדי להקליט מבחני הימנעות. כל טלפון יכול להקליט סרטוני קיטועי זמן של עד שש לוחיות בדיקה. כדי לספק אור משודר, אנו משתמשים בקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED) שניתן לרכוש בקלות באינטרנט. לוחות Assay ממוקמים על פלטפורמה מוגבהת, הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות, הממקדות את האור הנכנס ויוצרות ניגודיות. אנו מספקים גם סקריפט Python הממיר את הסרטונים לקבצי Audio Video interleave (AVI) המציגים קליפים של 10 שניות של כל נקודת זמן לשעה. לאחר מכן הסרטונים נחתכים ללוחות נפרדים ונשמרים בקבצים נפרדים לשימוש לספירה ידנית.
השיטה מספקת הליך בעלות נמוכה כי הוא גם קל מאוד לשימוש, באמצעות פריטים זמינים עבור רוב האנשים. כאן, אנו מתארים את השיטה באמצעות בדיקת הימנעות דשא מבוססת היטב נגד הפתוגן האנושי Pseudomonas aeruginosa (PA14), שהפרוטוקול שלו תואר בעבר 2,9. לבסוף, אנו סוקרים גם את השיקולים והמגבלות של שיטת ההדמיה עבור אלה שרוצים ליישם אותה בניסויי התנהגות אחרים של C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה של התנהגות בעלי חיים, במקום להסתמך על תצפית ישירה, היא לא רק נוחה אלא גם בעלת יתרון של השארת תיעוד חזותי. זה מאפשר ניתוח עיוור על ידי אדם שלישי אובייקטיבי, או אפילו יכול לשמש לניתוח אוטומטי באמצעות טכניקות זיהוי תמונה. למרות היתרונות, הציוד הסטנדרטי המוצע בדרך כלל הוא בעלות גבוהה, ולכן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדאוק ג’ונג לי על קריאה ביקורתית של כתב היד ובדיקת קוד פייתון. מחקר זה נערך בחסות קרן המחקר הלאומית של קוריאה 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) ו-2019R1C1C1008708 (K.-h.Y).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
