Eine Smartphone-basierte Bildgebungsmethode für den Rasenvermeidungstest von C. elegans
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Aufzeichnung des Rasenvermeidungsverhaltens von Caenorhabditis elegans mit leicht verfügbaren Gegenständen wie einem Smartphone und einem Leuchtkasten mit Leuchtdioden (LED). Wir stellen auch ein Python-Skript zur Verfügung, um die Videodatei in ein Format zu verarbeiten, das besser zum Zählen geeignet ist.
Abstract
Bei Kontakt mit toxischen oder pathogenen Bakterien zeigt der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ein erlerntes Rasenvermeidungsverhalten, bei dem die Würmer nach und nach ihre Nahrungsquelle verlassen und sich bevorzugt außerhalb des Bakterienrasens aufhalten. Der Assay ist eine einfache Möglichkeit, die Fähigkeit der Würmer zu testen, äußere oder innere Signale wahrzunehmen, um richtig auf schädliche Bedingungen zu reagieren. Obwohl es sich um einen einfachen Assay handelt, ist das Zählen zeitaufwändig, insbesondere bei mehreren Proben, und Testdauern, die sich über Nacht erstrecken, sind für Forscher unpraktisch. Ein Bildgebungssystem, das viele Platten über einen langen Zeitraum abbilden kann, ist nützlich, aber kostspielig. Hier beschreiben wir ein Smartphone-basiertes Bildgebungsverfahren zur Erfassung der Rasenvermeidung bei C. elegans. Die Methode erfordert nur ein Smartphone und einen Leuchtkasten mit Leuchtdiode (LED), der als Durchlichtquelle dient. Mit kostenlosen Zeitraffer-Kameraanwendungen kann jedes Telefon bis zu sechs Platten mit ausreichender Schärfe und Kontrast abbilden, um Würmer außerhalb des Rasens manuell zu zählen. Die resultierenden Filme werden für jeden stündlichen Zeitpunkt in 10-Sekunden-Audio-Video-Interleave-Dateien (AVI) verarbeitet und dann zugeschnitten, um jede einzelne Platte anzuzeigen und sie für die Zählung zugänglicher zu machen. Diese Methode ist eine kostengünstige Methode für diejenigen, die Vermeidungsfehler untersuchen möchten, und kann möglicherweise auf andere C. elegans-Assays ausgeweitet werden.
Introduction
Zu den vielen Vorteilen der Untersuchung von C. elegans gehört das einfache Nervensystem, das die Möglichkeit bietet, zu untersuchen, wie sich Veränderungen auf genetischer und zellulärer Ebene auf die Netzwerkfunktion und den Verhaltensoutput auswirken. Trotz einer begrenzten Anzahl von Neuronen zeigen C. elegans ein breites Spektrum an komplexen Verhaltensweisen. Eine davon ist die Rasenvermeidung, bei der der bakterivore Fadenwurm auf eine schädliche Nahrungsquelle reagiert, indem er den Bakterienrasen verlässt. C. elegans meiden Rasenflächen mit pathogenen Bakterien 1,2,3, Rasenflächen mit Bakterien, die Toxine produzieren oder mit Toxinen versetzt sind1,4, und sogar RNAi-exprimierende Bakterien, deren Zielgen-Knockdown die Gesundheit der Würmer beeinträchtigt 4,5. Studien haben gezeigt, dass Würmer auf äußere Signale reagieren, wie z. B. Metaboliten, die von den pathogenen Bakterien produziert werden 1,6, oder auf interne Signale, die darauf hindeuten, dass das Futter sie krank macht 4,7. Diese Signale werden über konservierte Signalwege wie den Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalweg (MAPK) und den TGFβ-Signalweg (Transforming Growth Factor beta) verarbeitet und erfordern eine Kommunikation zwischen Darm und Nervensystem 4,6,7,8.
Obwohl der Test einfach ist, entwickelt sich das erlernte Verhalten über viele Stunden, oft über Nacht. Während es Mutanten gibt, die nicht in der Lage sind, das Defekt zu verlassen, in diesem Fall reicht es aus, das Scoring zu einem bestimmten Zeitpunkt zu vermeiden, um den Defekt zu demonstrieren, aber viele Mutanten gehen schließlich, kommen aber langsamer heraus. Für diese muss die Bewegung der Würmer alle paar Stunden verfolgt werden, was über Nacht schwierig sein kann. Auch das Zählen selbst nimmt Zeit in Anspruch, wodurch eine Verzögerungszeit zwischen den Platten entsteht und somit die Anzahl der Platten begrenzt wird, die gleichzeitig getestet werden können. Die Verwendung eines Bildgebungsaufbaus zur gleichzeitigen Aufzeichnung vieler Platten über die gesamte Dauer des Assays wäre sehr nützlich, aber die Kosten für die Einrichtung können je nach Finanzierungssituation des Forschungslabors unerschwinglich sein.
Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine sehr einfache Methode entwickelt, bei der Smartphones verwendet werden, um Vermeidungstests aufzuzeichnen. Jedes Telefon kann Zeitraffervideos von bis zu sechs Assay-Platten aufnehmen. Für die Bereitstellung von Durchlicht verwenden wir einen Leuchtkasten mit Leuchtdioden (LED), der einfach online erworben werden kann. Die Untersuchungsplatten befinden sich auf einer erhöhten Plattform, die von hohlen rechteckigen Tunneln getragen wird, die das einfallende Licht bündeln und so einen Kontrast erzeugen. Wir stellen auch ein Python-Skript zur Verfügung, das die Videos in AVI-Dateien (Audio Video Interleave) konvertiert, die 10-Sekunden-Clips jedes stündlichen Zeitpunkts zeigen. Die Videos werden dann auf einzelne Platten zugeschnitten und in separaten Dateien gespeichert, um sie für die manuelle Zählung zu verwenden.
Die Methode bietet ein kostengünstiges Verfahren, das auch extrem einfach anzuwenden ist, wobei Gegenstände verwendet werden, die für die meisten Menschen leicht verfügbar sind. In dieser Arbeit beschreiben wir die Methode anhand des etablierten Rasenvermeidungstests gegen den humanpathogenen Erreger Pseudomonas aeruginosa (PA14), dessen Protokoll bereits beschrieben wurde 2,9. Schließlich gehen wir auch auf die Überlegungen und Einschränkungen der Bildgebungsmethode für diejenigen ein, die sie auf andere Verhaltensexperimente von C. elegans anwenden möchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Abbildung des Verhaltens von Tieren, anstatt sich auf die direkte Beobachtung zu verlassen, ist nicht nur bequem, sondern hat auch den Vorteil, dass eine visuelle Dokumentation hinterlassen wird. Dies ermöglicht eine blinde Analyse durch eine objektive dritte Person oder könnte sogar für eine automatisierte Analyse mit Bilderkennungstechniken verwendet werden. Trotz der Vorteile ist die Standardausstattung, die in der Regel angeboten wird, teuer, so dass man sich nach dem Kauf an das Setup gebunden hat.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Deok Joong Lee für die kritische Lektüre des Manuskripts und das Testen des Python-Codes. Diese Forschung wurde von der National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) und 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.) gefördert.
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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