C. elegans芝生回避アッセイのためのスマートフォンベースのイメージング法
Summary
この記事では、スマートフォンや発光ダイオード(LED)ライトボックスなどのすぐに利用できるアイテムを使用して、 Caenorhabditis elegansの芝生回避行動を記録する簡単で低コストの方法について説明します。また、ビデオファイルをカウントしやすい形式に処理するためのPythonスクリプトも提供しています。
Abstract
有毒または病原性の細菌にさらされると、線虫 Caenorhabditis elegansは 、ワームが徐々に食料源を離れ、細菌の芝生の外に留まることを好む、学習された芝生回避行動を示します。このアッセイは、有害な条件に適切に反応するために外部または内部の手がかりを感知するワームの能力をテストする簡単な方法です。単純なアッセイですが、特に複数のサンプルではカウントに時間がかかり、一晩にわたるアッセイ時間は研究者にとって不便です。長期間にわたって多くのプレートをイメージングできるイメージングシステムは便利ですが、コストがかかります。ここでは、 C. elegansにおける芝生回避を記録するためのスマートフォンベースのイメージング手法について述べる。この方法では、スマートフォンと発光ダイオード(LED)ライトボックスのみが透過光源として機能します。無料のタイムラプスカメラアプリケーションを使用すると、各電話は最大6枚のプレートを撮影でき、芝生の外でワームを手動でカウントするのに十分なシャープネスとコントラストを備えています。結果のムービーは、毎時10秒のオーディオビデオインターリーブ(AVI)ファイルに処理され、その後、カウントしやすいように各プレートを表示するようにトリミングされます。この方法は、回避欠陥の検査を検討している人にとって費用対効果の高い方法であり、他の C.エレガンス アッセイに拡張できる可能性があります。
Introduction
C. elegansを研究することの多くの利点の中で、その単純な神経系は、遺伝的および細胞レベルでの変化がネットワーク機能と行動出力にどのように影響するかを研究する機会を提供します。ニューロンの数が限られているにもかかわらず、C.エレガンスは広範囲の複雑な行動を示します。これらの1つは芝生回避であり、細菌性線虫は細菌の芝生を離れることによって有害な食料源に反応します。C.エレガンスは、病原性細菌の芝生1,2,3、毒素を産生する細菌の芝生、または毒素をスパイクする細菌の芝生1,4、さらには標的遺伝子ノックダウンがワームの健康に有害であるRNAi発現細菌4,5さえも避けます。研究によると、ワームは病原菌によって生成された代謝物などの外部の手がかりに反応することが示されています1,6、または食物がそれらを病気にしていることを示す内部の手がかり4,7。これらの手がかりは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路やトランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)経路などの保存されたシグナル伝達経路を介して処理され、腸と神経系の間の通信を必要とします4、6、7、8。
アッセイは単純ですが、学習された行動は何時間にもわたって、しばしば一晩で進行します。離脱できない変異体もいますが、その場合、ある時点でのスコア回避で欠陥を実証するのに十分ですが、多くの変異体は最終的に去りますが、出てくるのが遅くなります。これらの場合、ワームの動きは数時間ごとに追跡する必要があり、一晩で行うのは難しい場合があります。カウント自体にも時間がかかり、プレート間にラグタイムが生じるため、同時にテストできるプレートの数が制限されます。イメージングセットアップを使用して、アッセイの全期間にわたって多くのプレートを同時に記録することは非常に便利ですが、研究室の資金調達状況によっては、セットアップのコストが法外なものになる可能性があります。
これに対処するために、スマートフォンを使用して回避アッセイを記録する非常に簡単な方法を考案しました。各電話は、最大6つのアッセイプレートのタイムラプスビデオを録画できます。透過光を提供するために、オンラインで簡単に購入できる発光ダイオード(LED)ライトボックスを使用しています。アッセイプレートは、中空の長方形のトンネルで支えられた高架プラットフォームに配置され、入射光を集束させ、コントラストを作り出します。また、ビデオをオーディオビデオインターリーブ(AVI)ファイルに変換するPythonスクリプトも提供しており、各時間ポイントの10秒のクリップを表示します。その後、ビデオは個々のプレートにトリミングされ、手動カウントに使用するために個別のファイルに保存されます。
この方法は、ほとんどの人がすぐに利用できるアイテムを使用して、非常に使いやすい低コストの手順を提供します。ここでは、ヒト病原体緑膿菌(PA14)に対する十分に確立された芝生回避アッセイを使用する方法について説明し、そのプロトコルは以前に説明されています2,9。最後に、他のC.エレガンス行動実験に適用したい人のために、イメージング方法の考慮事項と制限についてもレビューします。
Protocol
Representative Results
Discussion
直接観察に頼るのではなく、動物の行動を画像化することは、便利であるだけでなく、視覚的な文書化を残すという利点もあります。これにより、客観的な第三者によるブラインド分析が可能になり、画像認識技術を使用した自動分析にも使用できます。利点にもかかわらず、通常提供される標準機器はコストが高いため、購入後はセットアップに専念します。
スマー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を批判的に読み、PythonコードをテストしてくださったDeok Joong Leeに感謝します。この研究は、韓国国立研究財団2017R1A5A2015369(K.-h.Y.)および2019R1C1C1008708(K.-h.Y.)のスポンサーとなりました。
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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