Summary
Dit artikel beschrijft een eenvoudige, goedkope methode voor het registreren van het gazonvermijdingsgedrag van Caenorhabditis elegans, met behulp van direct beschikbare items zoals een smartphone en een lichtbak (light emitting diode). We bieden ook een Python-script om het videobestand te verwerken in een formaat dat meer geschikt is om te tellen.
Abstract
Bij blootstelling aan giftige of pathogene bacteriën vertoont de nematode Caenorhabditis elegans een aangeleerd gazonvermijdingsgedrag, waarbij de wormen geleidelijk hun voedselbron verlaten en liever buiten het bacteriële gazon blijven. De test is een eenvoudige manier om het vermogen van de wormen te testen om externe of interne signalen te detecteren om goed te reageren op schadelijke omstandigheden. Hoewel het een eenvoudige test is, is tellen tijdrovend, vooral met meerdere monsters, en testduur die 's nachts duurt, is onhandig voor onderzoekers. Een beeldvormingssysteem dat veel platen over een lange periode in beeld kan brengen, is nuttig maar kostbaar. Hier beschrijven we een op smartphones gebaseerde beeldvormingsmethode om gazonvermijding in C. elegans vast te leggen. De methode vereist alleen een smartphone en een lichtbak (light emitting diode) (LED) om als een doorgelaten lichtbron te dienen. Met behulp van gratis time-lapse cameratoepassingen kan elke telefoon tot zes platen in beeld brengen, met voldoende scherpte en contrast om wormen buiten het gazon handmatig te tellen. De resulterende films worden verwerkt tot 10 s audio video interleave (AVI) -bestanden voor elk tijdspunt per uur en vervolgens bijgesneden om elke afzonderlijke plaat weer te geven om ze meer vatbaar te maken voor tellen. Deze methode is een kosteneffectieve manier voor diegenen die vermijdingsdefecten willen onderzoeken en kan mogelijk worden uitgebreid naar andere C. elegans-assays.
Introduction
Een van de vele voordelen van het bestuderen van C. elegans, het eenvoudige zenuwstelsel biedt de mogelijkheid om te bestuderen hoe veranderingen op genetisch en cellulair niveau de netwerkfunctie en gedragsoutput beïnvloeden. Ondanks het feit dat ze een beperkt aantal neuronen hebben, vertonen C. elegans een breed scala aan complexe gedragingen. Een daarvan is gazonvermijding, waarbij de bacterivore nematode reageert op een schadelijke voedselbron door het bacteriële gazon te verlaten. C. elegans vermijden gazons van pathogene bacteriën 1,2,3, gazons van bacteriën die toxines produceren of zijn geprikt met toxines 1,4, en zelfs RNAi-tot expressie brengende bacteriën waarvan het doelgen knockdown schadelijk is voor de gezondheid van de wormen 4,5. Studies hebben aangetoond dat wormen reageren op externe signalen zoals metabolieten geproduceerd door de pathogene bacteriën 1,6, of interne signalen die aangeven dat het voedsel hen ziek maakt 4,7. Deze signalen worden verwerkt via geconserveerde signaalroutes, zoals de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) route en de transformerende groeifactor beta (TGFβ) route, en vereisen communicatie tussen de darm en het zenuwstelsel 4,6,7,8.
Hoewel de test eenvoudig is, ontwikkelt het aangeleerde gedrag zich gedurende vele uren, vaak 's nachts. Hoewel er mutanten zijn die niet in staat zijn om te vertrekken, in welk geval het scoren van vermijding op slechts één tijdstip voldoende is om het defect aan te tonen, vertrekken veel mutanten uiteindelijk wel, maar komen ze langzamer naar buiten. Hiervoor moet de beweging van de wormen om de paar uur worden gevolgd, wat 's nachts moeilijk kan zijn. Het tellen zelf kost ook tijd, waardoor er een vertragingstijd tussen de platen ontstaat en dus het aantal platen dat tegelijkertijd kan worden getest, wordt beperkt. Het gebruik van een beeldvormingsopstelling om veel platen tegelijkertijd op te nemen voor de hele duur van de test zou zeer nuttig zijn, maar de kosten van de installatie kunnen onbetaalbaar zijn, afhankelijk van de financieringssituatie van het onderzoekslaboratorium.
Om dit aan te pakken, hebben we een zeer eenvoudige methode bedacht die smartphones gebruikt om vermijdingstests vast te leggen. Elke telefoon kan time-lapse-video's van maximaal zes testplaten opnemen. Om doorgelaten licht te bieden, gebruiken we een light emitting diode (LED) lichtbak die gemakkelijk online kan worden gekocht. Testplaten worden op een verhoogd platform geplaatst, ondersteund door holle rechthoekige tunnels, die het binnenkomende licht focussen, waardoor contrast ontstaat. We bieden ook een Python-script dat de video's converteert naar audio-video interleave (AVI) -bestanden met 10 s-clips van elk uurtijdstip. De video's worden vervolgens bijgesneden tot afzonderlijke platen en opgeslagen in afzonderlijke bestanden om te gebruiken voor handmatig tellen.
De methode biedt een goedkope procedure die ook uiterst eenvoudig te gebruiken is, met behulp van items die voor de meeste mensen direct beschikbaar zijn. Hier beschrijven we de methode met behulp van de gevestigde gazonvermijdingstest tegen de menselijke ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa (PA14), waarvan het protocol eerder is beschreven 2,9. Ten slotte bekijken we ook de overwegingen en beperkingen van de beeldvormingsmethode voor degenen die deze willen toepassen op andere gedragsexperimenten van C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opstelling van het beeldvormingsapparaat (figuur 1A-E)
- Zorg ervoor dat er een smartphonecamera met de volgende minimumvereisten beschikbaar is:
12 megapixel (MP) camera
Video met een resolutie van 1080p
5 GB opslagruimte (20 min video is 3-4 Gb)
Time-lapse video-app uit de applicatiewinkel (gratis applicaties beschikbaar) - Plaats de LED-lichtbak op het onderste rek van de 25 °C-incubator waar de test zal plaatsvinden.
- Om het stippelpatroon op het LED-lichtoppervlak te verbergen, spreidt u twee vellen tissues uit om het hele oppervlak van de LED-box te bedekken.
- Maak een verhoogd stadium voor het monster (figuur 1A,D). Het verhoogde podium is een doorzichtige plastic plaat ondersteund door holle rechthoekige tunnels. Tunnels functioneren als een condensor om licht te focussen, waardoor het monster beter contrasteert (figuur 1C). Zorg ervoor dat de wanden van de tunnel enigszins donker zijn om lichtverstrooiing te minimaliseren. In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van bruine papieren dozen. De afmeting van de tunnel is 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (B x L x H). De LED-lichtbak past in maximaal vijf tunnels.
- Plaats een ander rek boven het podium om de telefoons te plaatsen voor opname (figuur 1B, E). Elke telefoon neemt drie tot zes platen op (één tot twee rijen van drie platen), dus pas de rackhoogte dienovereenkomstig aan. Dit zal ongeveer 15 cm boven het monster liggen (figuur 1B).
- Plaats een stekkerdoos in de couveuse om de telefoons aan te sluiten tijdens het opnemen 's nachts.
2. Voorbereiding van buffers en media
- Bereid M9-buffer door 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO4 en 5 g NaCl toe te voegen aan 1 L gedestilleerd H2O. Steriliseer door autoclaveren bij121 °C gedurende 20 minuten. Laat de buffer afkoelen en voeg vervolgens 1 ml 1 M MgSO4 toe.
- Bereid 1 M KPO 4-buffer voor door 108,3 g KH 2 PO 4 en 35,6 g K 2 HPO4 toe te voegen aan 1 L H2O. Stel de pH in op 6,0door KOH toe te voegen. Steriliseren door autoclaveren.
- Bereid wormbleekoplossing door 1 ml bleekmiddel, 0,4 ml 1 M NaOH en 2,6 ml H2O te mengen.
- Bereid nematode groeimedia (NGM) agarplaten.
- Voeg 3 g NaCl, 2,5 g bacto pepton en 17 g bacto agar toe in een kolf van 3 L. Voeg 975 ml gedestilleerd water toe en plaats een roerstaaf.
- Steriliseer door autoclaveren, koel vervolgens af tot 55 °C en voeg 1 ml cholesterol (5 mg / ml in ethanol), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4 en 25 ml 1 M KPO4-buffer (pH 6,0) toe. Roer om goed te mengen. Giet in borden van 6 cm. Laat de borden minstens 2 dagen drogen.
- Zaai NGM-agarplaten met OP50 E. coli door ongeveer 1 ml van een nachtcultuur van OP50 te pipetteren om een gazon van bacteriën te vormen. Laat op kamertemperatuur (RT) staan tot het klaar is voor gebruik.
3. Bereiding van NGM-platen met een hoog peptongehalte (voor PA14)
OPMERKING: Deze platen moeten ten minste 5 dagen voor de test worden gemaakt.
- Maak NGM met 0,35% pepton. Meng 0,3 g NaCl, 0,35 g bactopepton en 1,7 g bacto-agar in een erlenmeyer van 250 ml. Voeg 97,5 ml gedestilleerd water toe en plaats een roerstaaf.
- Bedek de mond van de kolf met aluminiumfolie en autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 minuten.
- Koel af tot 55 °C en voeg 0,1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 0,1 ml 1 M CaCl 2, 0,1 ml 1 M MgSO 4 en2,5 ml 1 M KPO4-buffer (pH 6,0) toe. Roer om goed te mengen.
- Giet high-peptone NGM in petrisalen van 35 mm.
- Droog de borden minstens 2 dagen.
4. Wormen synchroniseren door bleken
OPMERKING: Start deze stap 3 dagen voor de test.
- Neem platen met gravid volwassen wormen en verzamel ze in een microbuis van 1,7 ml door de platen te wassen met M9-buffer.
- Verwijder zoveel mogelijk vloeistof en voeg vervolgens 400 μL bleekoplossing toe. Wacht ongeveer 4-5 minuten met intermitterende vortexing, totdat de volwassen wormlichamen breken en de eieren vrijkomen.
- Voeg M9-buffer toe om de rest van de microbuis te vullen om de bleekoplossing te verdunnen. Draai op maximale snelheid (12.000 tot 13.000 x g) gedurende 1-2 s. Verwijder het supernatant en was het nog drie keer met M9-buffer.
- Breng de eieren over in een lege petrischaal van 35 mm met M9-buffer. Laat de eieren een nacht uitkomen bij 20 °C. Bij afwezigheid van voedsel zullen uitgekomen wormen stoppen in het L1-larvale stadium, waardoor het ontwikkelingsstadium van alle wormen wordt gesynchroniseerd.
OPMERKING: Het coaten van de 35 mm petrischaal met gelatine-oplossing (0,05% gelatine in geautoclaveerd water) kan voorkomen dat de eieren aan de bodem blijven plakken en het verlies van eieren minimaliseren. - Breng de volgende dag L1-stadiumwormen over naar OP50-gezaaide NGM-platen.
- Incubeer de wormen bij 20 °C gedurende 53-54 uur totdat de wormen het L4-larvale stadium bereiken.
5. Bereiding van bacteriën ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
OPMERKING: Start deze stap 4 dagen voor de test.
- Streep ontdooide bacteriën van -80 °C op een Luria Bertani (LB) agarplaat zonder antibioticum en incubeer 's nachts bij 37 °C.
LET OP: Gebruik altijd verse bacteriën. Gestreepte platen moeten niet langer dan 1 week bij 4 °C worden bewaard. - Ent een enkele kolonie in 3 ml koningsbouillon en groei 's nachts in een 37 °C schuddende incubator.
- Zaai de volgende dag 7 μL van de nachtcultuur op de NGM-platen met een hoog peptongehalte en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C.
- Verplaats de gezaaide platen naar RT en incubeer nog eens 24 uur voor gebruik. Eenmaal klaar, gebruik de plaat binnen de volgende 24 uur.
6. Voorbereiding om op te nemen
OPMERKING: Doe dit vlak voor de test.
- Sluit de smartphone aan op de stekkerdoos die is aangesloten op een stopcontact. Zorg ervoor dat u de instelling voor automatisch vergrendelen uitschakelt om te voorkomen dat de telefoon tijdens het opnemen terugkeert naar het vergrendelingsscherm.
- Open de time-lapse camera-app en stel het time-lapse-interval in op 2 s. Stel de videokwaliteit in op 1080p bij 30 fps.
- Plaats de smartphone met het scherm naar boven gericht om op te nemen met de camera aan de achterkant. Controleer het scherm om er zeker van te zijn dat de tunnels van de papieren doos binnen het gezichtsveld passen.
7. Gazonvermijdingstest
- Breng met behulp van een platina draadprikker 30 gesynchroniseerde L4-trapwormen (53-54 uur van L1) over naar de PA14-plaat. Plaats de wormen in het midden van het bacteriegazon. Voor elke aandoening in deze studie werden twee platen getest (d.w.z. 60 wormen per aandoening).
- Plaats de twee platen op het verhoogde podium van het opnameapparaat met het deksel naar beneden gericht. De kant met de agar is naar boven gericht naar de camera.
- Tik op het smartphonescherm op de plek waar de plaat zich bevindt, zodat de camera kan scherpstellen op de testplaten. Het helpt om een label of tekst op de plaat te hebben, omdat de camera dat kan gebruiken om correct scherp te stellen.
OPMERKING: Schrijven op de onderkant van de platen interfereert niet met de beeldvorming van wormen zolang het zich naar de rand bevindt. Gelukkig blijven wormen ook na vertrek in de buurt van het gazon, waardoor er alleen een vrij zicht nodig is op de directe omgeving van het gazon. - Start de opname.
- Zodra de opname is begonnen, voegt u meer platen toe aan het podium. Er kan een aanzienlijke vertragingstijd tussen de platen zijn vanwege de tijd die nodig is om wormen over te brengen door te plukken. Noteer de vertragingstijd achteraf, zodat elke voorwaarde kan worden geteld op het moment dat deze begon.
- Record voor 20 uur van de laatste set platen die op het podium zijn geplaatst. In de uiteindelijke time-lapse video resulteert 20 uur opname in een 20 minuten durende video.
OPMERKING: Het kan de moeite waard zijn om de wormen direct van de platen te tellen na de test, althans in het begin voor de eerste paar gelegenheden. Dit kan worden vergeleken met waarden die zijn verkregen via videobeeldvorming om ervoor te zorgen dat ze vergelijkbare aantallen opleveren.
8. Verwerking van video met behulp van Python-script
- Breng het filmbestand over naar een computer voor verwerking. De extensie is een MOV (iPhone) of MP4-bestand (Android).
- Gebruik een Python-code om de video's te verwerken. De code is te vinden op github.com/khyoon201/wormavoid.
- Als u de Python-scripts wilt uitvoeren, moet u ervoor zorgen dat het volgende vooraf op de computer is geïnstalleerd: ffmpeg, een hulpmiddel voor het converteren van videobestanden (routebeschrijvingen voor installatie zijn te vinden op de website, ffmpeg.org/download), en de Python-pakketten os, pandas, tkinter en ffmpeg-python.
- Zoek de afmetingen en coördinaten van elke plaat met behulp van het extract_frame.py script.
- Voer het extract_frame.py script uit. Er verschijnt een venster om het videobestand te selecteren dat op de computer is opgeslagen. Nadat het uitvoeren is voltooid, verschijnt een jpeg-bestand met dezelfde naam in dezelfde map.
- Open het jpeg-bestand in ImageJ (imagej.org).
- Kies in het menu Analyseren > Metingen instellen. Zorg ervoor dat het selectievakje Display Label is aangevinkt (Afbeelding 2A). Sluit het venster.
- Meet met het gereedschap Rechte lijn de diameter van een plaat door er een lijn overheen te trekken en vervolgens Analyseren > Meten te kiezen in het menu. Als de video in 1080p is, is elke plaat ongeveer 480 pixels breed. Noteer deze informatie en sluit het venster Resultaten .
- Markeer met het gereedschap Multipunt punten linksboven op elke plaat. Deze punten worden de linkerbovenhoek van de bijgesneden video's (figuur 2B). De volgorde is belangrijk; Markeer in volgorde van wanneer de platen zijn gestart. Nadat u een punt voor alle platen hebt gemaakt, kiest u Analyseren > Meten in het menu. Metingen, inclusief de X- en Y-coördinaten van de punten, worden weergegeven in het venster Resultaten.
- Als u meerdere video's wilt verwerken, herhaalt u het proces in ImageJ met andere jpeg-bestanden. Alle X- en Y-coördinaten worden weergegeven in hetzelfde venster Resultaten .
- Sla het venster Resultaten op in een csv-bestand. Het bestand moet worden opgeslagen in dezelfde map als de filmbestanden.
- Zoek de starttijd voor elk bord.
- Speel de film af op de computer of telefoon en noteer de begintijden van elke set platen die onder de camera zijn geplaatst.
- Open het bestand Resultaten.csv met de coördinaten en voeg een kolom "start" toe. Voer voor elke rij die overeenkomt met afzonderlijke platen de juiste starttijd in, in seconden, onder de kolom "start" (als de starttijd bijvoorbeeld 0:00:08 is, voert u 8 in). Redden.
OPMERKING: De kolomnaam moet "begin" zijn (in kleine letters, zonder aanhalingstekens) om te worden herkend door het volgende script voor bijsnijden en bijsnijden.
- Snijd de video's bij en trim ze.
- Voer het crop_n_trim.py script uit.
- Wanneer u hierom wordt gevraagd, kiest u het bestand Resultaten.csv .
OPMERKING: Zorg ervoor dat het bestand Resultaten.csv en alle filmbestanden zich in dezelfde map bevinden. - Voer de plaatafmetingen in. Voer de eerder genoteerde pixelwaarde in.
OPMERKING: Het script leest nu elke rij van het bestand Resultaten.csv om het juiste filmbestand te vinden door de bestandsnaam in de kolom "label" te lezen en bij te snijden volgens de coördinaten die zijn aangegeven in de kolommen "X" en "Y". De starttijd van elke plaat wordt bepaald door de tijd die wordt aangegeven in de kolom "start". Nadat het script is uitgevoerd, verschijnt er een map met dezelfde naam als de film, gevolgd door de starttijd (bijvoorbeeld "Movie1_8"), waarin 10 s-video's worden opgeslagen die overeenkomen met elk uurtijdstip van de test.
9. Handmatig tellen met ImageJ
- Open elk AVI-bestand in ImageJ.
- Tel de wormen die buiten het gazon zichtbaar zijn. Wormen die in het ene frame overlappen, bewegen meestal uit elkaar in een ander frame, zodat ze correct kunnen worden geteld.
- Bereken de bezettingsgraad voor elk tijdstip:
Bezettingsgraad = (totaal wormen - aantal wormen buiten het gazon)/totaal wormen
OPMERKING: De wormen zullen tijdens de video in en uit het gazon bewegen, maar dit zal de resultaten niet significant veranderen. Probeer te gaan met het getal dat het gemiddelde lijkt te zijn, of het aantal wormen op het exacte tijdstip per uur (5 s in de video).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste video geproduceerd door het script is 1 uur vanaf het begin van de test. De video voor 0 uur wordt niet opgeslagen, omdat wormen de test in het gazon starten, dus de bezettingsgraad is altijd 100%.
Wild-type N2-wormen worden vergeleken met npr-1-mutanten, waarvan het gazonvermijdingsdefect goed is vastgesteld in de literatuur 6,10 (figuur 3A-E). Zoals te zien is in het wilde type, verlaten wormen geleidelijk het bacteriële gazon en blijven ze buiten (figuur 3A, B). De resultaten worden uitgezet in een grafiek om de verandering in bezettingsgraad in de loop van de tijd weer te geven (figuur 3B). Wormen buiten zijn duidelijk te zien in de video, maar wormen in het dikke bacteriële gazon zijn moeilijker te onderscheiden (Figuur 3D,E). Omdat er echter precies 30 wormen in elke plaat zitten, kan het aantal wormen dat zich nog in het gazon bevindt worden berekend door de getelde wormen af te trekken van het totaal van 30.
Hoewel deze veronderstelling mogelijk telfouten kan veroorzaken, vooral als sommige wormen in de buurt van de wanden van de plaat terechtkomen waar het moeilijk te zien kan zijn, was dit geen significante zorg. Toen tellingen die rechtstreeks van de platen werden gemaakt, werden vergeleken met tellingen van afgebeelde wormen, bleken tellingen van afgebeelde wormen zeer nauwkeurig te zijn. Wanneer drie onderzoeken voor elke stam samen werden gemiddeld, leverden de N2- en npr-1-stammen respectievelijk een nauwkeurigheid van 99,5% en 96,2% op (figuur 3B,C). Van belang was dat er een iets hogere neiging was om een paar npr-1-wormen te missen vanwege de hoge beweeglijkheid11, terwijl wilde wormen de neiging hadden om in de buurt van het gazon te blijven.
Figuur 1: Beeldvormingsapparatuur . (A) Een schematisch beeld van de beeldvormingsopstelling. B) Beeldvormingsapparatuur die is opgesteld in een incubator die is ingesteld op 25 °C voor PA14-gazonvermijdingstests. (C) Vergelijking van wormen afgebeeld met of zonder de tunnel. (D) Een close-up van hoe de platen bovenop de tunnels zijn gemonteerd. (E) De hoogte van de telefoon is zo ingesteld dat er maximaal zes platen van 35 mm in het scherm passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plaatcoördinaten bepalen met behulp van ImageJ. (A) In Metingen analyseren > instellen moet het vakje Label weergeven worden aangevinkt (rood gestippeld vak). (B) Een enkel frame dat uit de video wordt geëxtraheerd, wordt gebruikt om coördinaten te plotten die worden gebruikt voor het bijsnijden. Punten die zijn gemaakt met het gereedschap Multipoint zijn geel. Deze dienen als de linkerbovenhoeken van de uiteindelijke bijgesneden video's (gemarkeerd als een gestippeld wit vak). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beeld- en testresultaten. (A) Na enkele uren blootstelling aan PA14 verlaten de meeste wormen het gazon en blijven buiten. (B) Representatieve resultaten van de gazonvermijdingstest. De beweging van wormen wordt elk uur gevolgd om de bezettingsgraad te bepalen. De open vierkanten op het tijdstip van 20 uur geven de gemiddelde waarde aan die wordt bepaald door rechtstreeks te tellen van platen uit C. (C) Om de nauwkeurigheid van de tellingen via de video te beoordelen, werden de wormen ook direct aan het einde van de test geteld en vergeleken met de waarden die via videobeelden werden verkregen. Waarden geven de wormnummers binnen/buiten het gazon aan. (D,E) L4-wormen zijn duidelijk te zien buiten het bacteriële gazon (zwarte pijlpunt), terwijl wormen binnenin moeilijker te zien zijn (witte pijlpunt). Wormen die in het ene frame overlappen, kunnen meestal in een ander frame uit dezelfde film (zwarte omtrekpijlpunt) uit elkaar worden gehaald. Het nummer rechtsonder geeft het framenummer aan van de totale frames van de videoclip van 10 s (30 frame/s). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het in beeld brengen van het gedrag van dieren, in plaats van te vertrouwen op directe observatie, is niet alleen handig, maar heeft ook het voordeel dat het visuele documentatie achterlaat. Dit maakt blinde analyse door een objectieve derde persoon mogelijk, of kan zelfs worden gebruikt voor geautomatiseerde analyse met behulp van beeldherkenningstechnieken. Ondanks de voordelen is de standaarduitrusting die meestal wordt aangeboden hoog in kosten, dus men is toegewijd aan de installatie zodra deze is gekocht.
Het gebruik van smartphones om video-opnames van eenvoudig C. elegans-gedrag te verzamelen, biedt verschillende voordelen. Het vereist minimale bekendheid met technische kennis en is uiterst eenvoudig in te stellen, met behulp van items die gemakkelijk en goedkoop kunnen worden aangeschaft. Een ander voordeel is de draagbaarheid van een smartphone - het past in kleine ruimtes en omdat het zijn eigen opslag heeft, hoeft het niet terug te worden aangesloten op een computer. Hierdoor kan de opstelling overal worden geplaatst, zelfs wanneer de ruimte extreem beperkt is. Het verplaatsen van de opgenomen videobestanden naar de computer is handig - de bestanden zijn niet zo groot omdat ze zijn gecodeerd in een gecomprimeerd MPEG-4-formaat. Het verplaatsen van bestanden is vooral handig wanneer draadloze opties voor bestandsoverdracht beschikbaar zijn.
Omdat de wormen zonder enige vergroting in beeld worden gebracht, bestaan de wormen die in de video's zijn vastgelegd uit slechts enkele pixels. L4-wormen zijn net groot genoeg om zonder vergroting te worden vastgelegd, maar de kleine pixelgrootte beperkt het gebruik ervan voor hoogwaardige beeldherkenning en bewegingstracking. Het gebruik van de zoomlens die wordt aangeboden door recentere modellen of het bevestigen van een zoomlensadapter kan helpen bij het verkrijgen van meer gedetailleerde afbeeldingen, hoewel we dit zelf niet hebben geprobeerd. Dit zou echter ook het gezichtsveld en het aantal platen dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld, verminderen.
Om het tellen gemakkelijker te maken, worden de video's bijgesneden om afzonderlijke platen te tonen en bijgesneden tot video's van 10 s die overeenkomen met elk uur van de test. Dit is ook belangrijk omdat het converteren van de video's naar AVI-formaat de bestandsgrootte aanzienlijk vergroot en het bijsnijden en bijsnijden van de video's ervoor zorgt dat de bestandsgroottes beter beheersbaar zijn. De bijgesneden AVI-bestanden kunnen mogelijk ook worden gebruikt om de wormen automatisch te tellen met een beeldherkenningsalgoritme. Voor de wild-type stam ontdekten we dat een ruwe vorm van geautomatiseerd tellen mogelijk is in ImageJ, met behulp van eenvoudige drempels. Wanneer echter mutanten met een kleinere lichaamsgrootte worden gebruikt, produceren geautomatiseerde tellingen meer fouten.
Er zijn veel inspanningen geleverd om wormen in beeld te brengen en analyses te automatiseren. Traditioneel werden wormen opgenomen door een camera die was bevestigd aan een ontleedmicroscoop, die meestal slechts de beeldvorming van een paar wormen tegelijk mogelijk maakt vanwege het beperkte gezichtsveld. De noodzaak om meer wormen tegelijkertijd in beeld te brengen voor analyses met een hogere doorvoer heeft onderzoekers ertoe aangezet creatieve beeldvormingsbenaderingen te ontwikkelen. Een manier was om aangepaste flatbedscanners te gebruiken om levensduurtests in beeld te brengen, zoals WormScan of de Lifespan Machine12,13. Een scanner met hoge resolutie kan wormen in beeld brengen, zodat bewegende levende wormen kunnen worden onderscheiden van onbeweeglijke dode wormen.
Voor het volgen van wormbewegingen met een hogere fps-snelheid wordt een camera aan een lens bevestigd en worden wormen zonder microscoop in beeld gebracht14,15. Churgin et al., die WorMotel14 ontwikkelden, een methode voor langetermijnbeeldvorming van individuele wormen gekweekt in een polydimethylsiloxaan (PDMS) multi-well plaat, geven gedetailleerde uitleg over factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het kiezen van de juiste camera en lens16. Deze methode heeft ook het extra voordeel dat het relatief bescheiden is in kosten.
Het vangen van wormen zonder microscoop resulteert onvermijdelijk in beelden die de resolutie missen voor gedetailleerde analyse van de voortbeweging of gang van wormen. Om dit te verhelpen, gebruikten Barlow et al. een strategie om zes camera's te gebruiken die in een array van drie bij twee waren gerangschikt om een enkele 96-well plaat17 vast te leggen. Elke camera is ingesteld om slechts vier x vier putten van de 96-putplaat in beeld te brengen, wat resulteert in een veel hogere grootte en resolutie van de afgebeelde wormen.
Omdat C. elegans een helder lichaam heeft, moet de verlichting ook worden aangepast om contrast met de achtergrond te bieden. Onze methode gebruikte verlichting van een platte LED-lichtbak, door een smalle tunnel om het licht te focussen. De afmetingen werden bepaald door de grootte van de afgebeelde plaat; De breedte van 5,5 cm past op de 35 mm-plaat die wordt gebruikt voor de vermijdingstest. Om een groter gebied in beeld te brengen, zal de tunnel breder moeten zijn, maar we ontdekten dat de hoogte ook moet worden verhoogd om hetzelfde scherpsteleffect te verkrijgen. Het nadeel is dat bij hogere tunnels meer van de wanden door de plaat heen te zien zijn, waardoor het zicht aan de rand van de plaat wordt belemmerd. Een andere strategie die kan worden gebruikt, is om LED-slingers te gebruiken die zijn gerangschikt in een cirkelvormige ring (LED-ring). Het licht, dat uit vele richtingen komt, verspreidt zich over het oppervlak van het lichaam van de worm en creëert lichtwormen tegen een donkere achtergrond14,16,18. Dit kan niet alleen werken voor grotere platen, maar ook voor beeldvorming in kleinere ruimtes waar geen LED-lichtbak in past.
Met veel beschikbare beeldvormingsstrategieën die door de wormgemeenschap zijn ontwikkeld, willen onderzoekers misschien een paar opties uitproberen om de juiste te vinden die bij hun behoefte past. De hier beschreven beeldvormingsmethode is goedkoop en toegankelijk genoeg om gemakkelijk te kunnen worden gebruikt in niet-gegradueerde klaslokalen, of als een tijdelijke oplossing voordat wordt geïnvesteerd in een langetermijnopstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
We bedanken Deok Joong Lee voor het kritisch lezen van het manuscript en het testen van de Python-code. Dit onderzoek werd gesponsord door de National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) en 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
