Метод визуализации на основе смартфона для анализа избегания газонов C. elegans
Summary
В этой статье описывается простой и недорогой метод записи поведения Caenorhabditis elegans при избегании газона с использованием легкодоступных предметов, таких как смартфон и световой короб со светодиодами (LED). Мы также предоставляем скрипт Python для обработки видеофайла в формате, более удобном для подсчета.
Abstract
При контакте с токсичными или патогенными бактериями нематода Caenorhabditis elegans демонстрирует выученное поведение избегания газона, при котором черви постепенно покидают свой источник пищи и предпочитают оставаться за пределами бактериального газона. Анализ — это простой способ проверить способность червей воспринимать внешние или внутренние сигналы, чтобы правильно реагировать на вредные условия. Несмотря на то, что это простой анализ, подсчет занимает много времени, особенно с несколькими образцами, а продолжительность анализа, охватывающая ночь, неудобна для исследователей. Система визуализации, которая может визуализировать множество пластин в течение длительного периода времени, полезна, но дорогостояща. Здесь мы описываем метод визуализации на основе смартфона для записи избегания газонов у C. elegans. Для этого метода требуется только смартфон и световой короб со светодиодом (LED), который будет служить источником пропускаемого света. Используя бесплатные приложения для покадровой съемки, каждый телефон может отображать до шести пластин с достаточной резкостью и контрастностью, чтобы вручную подсчитывать червей за пределами газона. Полученные фильмы обрабатываются в 10-секундные файлы с чередованием аудио-видео (AVI) для каждого часового момента времени, а затем обрезаются, чтобы показать каждую отдельную пластину, чтобы сделать их более удобными для подсчета. Этот метод является экономически эффективным способом для тех, кто хочет изучить дефекты избегания, и потенциально может быть распространен на другие анализы C. elegans.
Introduction
Среди многих преимуществ изучения C. elegans его простая нервная система дает возможность изучить, как изменения на генетическом и клеточном уровне влияют на функцию сети и поведенческие результаты. Несмотря на ограниченное количество нейронов, C. elegans демонстрируют широкий спектр сложного поведения. Одним из них является избегание газона, при котором бактериоядная нематода реагирует на вредный источник пищи, покидая бактериальный газон. C. elegans избегают газонов патогенных бактерий 1,2,3, газонов бактерий, которые продуцируют токсины или содержат токсины1,4, и даже РНКi-экспрессирующих бактерии, чей целевой ген наносит ущерб здоровью червей 4,5. Исследования показали, что черви реагируют на внешние сигналы, такие как метаболиты, продуцируемые патогенными бактериями 1,6, или внутренние сигналы, которые указывают на то, что пища вызывает у них заболевание 4,7. Эти сигналы обрабатываются через консервативные сигнальные пути, такие как путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и путь трансформирующего фактора роста бета (TGFβ), и требуют связи между кишечником и нервной системой 4,6,7,8.
Хотя анализ прост, усвоенное поведение развивается в течение многих часов, часто в течение ночи. В то время как есть мутанты, которые не способны уйти, и в этом случае для демонстрации дефекта достаточно уклонения от оценки только в один момент времени, многие мутанты в конечном итоге уходят, но выходят медленнее. Для этого необходимо отслеживать движение червей каждые несколько часов, что может быть трудно сделать за ночь. Сам подсчет также требует времени, создавая время задержки между пластинами и, таким образом, ограничивает количество пластин, которые могут быть протестированы одновременно. Использование установки визуализации для одновременной записи многих планшетов в течение всего времени анализа было бы очень полезным, но стоимость установки может быть непомерно высокой, в зависимости от ситуации с финансированием исследовательской лаборатории.
Чтобы решить эту проблему, мы разработали очень простой метод, который использует смартфоны для записи анализов избегания. Каждый телефон может записывать покадровые видеоролики до шести пробирных пластин. Для обеспечения проходящего света мы используем светоизлучающий диодный (LED) световой короб, который можно легко приобрести в Интернете. Пробирные пластины размещаются на возвышенной платформе, поддерживаемой полыми прямоугольными туннелями, которые фокусируют поступающий свет, создавая контраст. Мы также предоставляем скрипт Python, который преобразует видео в файлы с чередованием аудио-видео (AVI), показывающие 10-секундные клипы каждого часового момента времени. Затем видео обрезаются до отдельных пластин и сохраняются в отдельных файлах для ручного подсчета.
Этот метод обеспечивает недорогую процедуру, которая также чрезвычайно проста в использовании, используя предметы, которые легко доступны для большинства людей. Здесь мы описываем метод с использованием хорошо зарекомендовавшего себя анализа избегания газонов против патогена человека Pseudomonas aeruginosa (PA14), протокол которого был описан ранее 2,9. Наконец, мы также рассматриваем соображения и ограничения метода визуализации для тех, кто хочет применить его к другим экспериментам по поведению C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация поведения животных, вместо того, чтобы полагаться на прямое наблюдение, не только удобна, но и имеет то преимущество, что оставляет визуальную документацию. Это позволяет проводить слепой анализ объективным третьим лицом или даже может быть использовано для автоматическо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дока Джунга Ли за критическое прочтение рукописи и тестирование кода Python. Это исследование было спонсировано Национальным исследовательским фондом Кореи 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) и 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
