Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans
Summary
Questo articolo descrive un metodo semplice e a basso costo per registrare il comportamento di evitamento del prato di Caenorhabditis elegans, utilizzando elementi prontamente disponibili come uno smartphone e una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED). Forniamo anche uno script Python per elaborare il file video in un formato più adatto al conteggio.
Abstract
Quando esposto a batteri tossici o patogeni, il nematode Caenorhabditis elegans mostra un comportamento appreso di evitare il prato, in cui i vermi lasciano gradualmente la loro fonte di cibo e preferiscono rimanere fuori dal prato batterico. Il test è un modo semplice per testare la capacità dei vermi di percepire segnali esterni o interni per rispondere correttamente a condizioni dannose. Sebbene si tratti di un test semplice, il conteggio richiede molto tempo, in particolare con campioni multipli, e le durate dei test che si estendono durante la notte sono scomode per i ricercatori. Un sistema di imaging in grado di visualizzare molte lastre per un lungo periodo è utile ma costoso. Qui, descriviamo un metodo di imaging basato su smartphone per registrare l’evitamento del prato in C. elegans. Il metodo richiede solo uno smartphone e una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED), per fungere da sorgente luminosa trasmessa. Utilizzando applicazioni fotografiche time-lapse gratuite, ogni telefono può visualizzare fino a sei lastre, con nitidezza e contrasto sufficienti per contare manualmente i vermi al di fuori del prato. I filmati risultanti vengono elaborati in file AVI (Audio Video Interleave) di 10 s per ogni punto temporale orario, quindi ritagliati per mostrare ogni singola lastra per renderli più suscettibili di conteggio. Questo metodo è un modo economico per coloro che cercano di esaminare i difetti di evitamento e può potenzialmente essere esteso ad altri saggi di C. elegans.
Introduction
Tra i molti vantaggi dello studio di C. elegans, il suo semplice sistema nervoso offre l’opportunità di studiare come i cambiamenti a livello genetico e cellulare influenzano la funzione della rete e la produzione comportamentale. Nonostante abbia un numero limitato di neuroni, C. elegans mostra una vasta gamma di comportamenti complessi. Uno di questi è l’evitamento del prato, in cui il nematode batterivoro risponde a una fonte di cibo dannosa lasciando il prato batterico. C. elegans evita prati di batteri patogeni 1,2,3, prati di batteri che producono tossine o sono arricchiti con tossine1,4 e persino batteri che esprimono RNAi il cui knockdown del gene bersaglio è dannoso per la salute dei vermi 4,5. Gli studi hanno dimostrato che i vermi rispondono a segnali esterni come i metaboliti prodotti dai batteri patogeni1,6, o segnali interni che indicano che il cibo li sta facendo ammalare 4,7. Questi segnali vengono elaborati attraverso vie di segnalazione conservate, come la via della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) e la via del fattore di crescita trasformante beta (TGFβ) e richiedono la comunicazione tra l’intestino e il sistema nervoso 4,6,7,8.
Sebbene il test sia semplice, il comportamento appreso si sviluppa nel corso di molte ore, spesso durante la notte. Mentre ci sono mutanti che non sono in grado di andarsene, nel qual caso l’evitamento del punteggio in un solo punto temporale è sufficiente per dimostrare il difetto, molti mutanti alla fine se ne vanno, ma sono più lenti a uscire. Per questi, il movimento dei vermi deve essere monitorato ogni poche ore, il che può essere difficile da fare durante la notte. Anche il conteggio richiede tempo, creando un tempo di ritardo tra le piastre, e quindi limita il numero di piastre che possono essere testate contemporaneamente. L’utilizzo di una configurazione di imaging per registrare molte lastre contemporaneamente per l’intera durata del test sarebbe molto utile, ma il costo della configurazione può essere proibitivo, a seconda della situazione di finanziamento del laboratorio di ricerca.
Per risolvere questo problema, abbiamo ideato un metodo molto semplice che utilizza gli smartphone per registrare i test di evitamento. Ogni telefono può registrare video time-lapse di un massimo di sei lastre di analisi. Per fornire luce trasmessa, utilizziamo una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED) che può essere facilmente acquistata online. Le lastre di analisi sono posizionate su una piattaforma sopraelevata, sostenuta da tunnel rettangolari cavi, che focalizzano la luce in entrata, creando contrasto. Forniamo anche uno script Python che converte i video in file AVI (Audio Video Interleave) che mostrano clip di 10 s di ogni punto orario orario. I video vengono quindi ritagliati su singole lastre e salvati in file separati da utilizzare per il conteggio manuale.
Il metodo fornisce una procedura a basso costo che è anche estremamente facile da usare, utilizzando articoli che sono prontamente disponibili per la maggior parte delle persone. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il ben noto saggio di prevenzione del prato contro il patogeno umano Pseudomonas aeruginosa (PA14), il cui protocollo è stato precedentemente descritto 2,9. Infine, esaminiamo anche le considerazioni e i limiti del metodo di imaging per coloro che vogliono applicarlo ad altri esperimenti comportamentali di C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immaginare il comportamento animale, piuttosto che basarsi sull’osservazione diretta, non è solo conveniente, ma ha anche il vantaggio di lasciare documentazione visiva. Ciò consente l’analisi cieca da parte di una terza persona oggettiva o potrebbe anche essere utilizzato per l’analisi automatizzata utilizzando tecniche di riconoscimento delle immagini. Nonostante i vantaggi, l’attrezzatura standard solitamente offerta è ad alto costo, quindi ci si impegna nella configurazione una volta acquistata.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Deok Joong Lee per la lettura critica del manoscritto e per aver testato il codice Python. Questa ricerca è stata sponsorizzata dalla National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) e 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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