En smarttelefonbasert bildebehandlingsmetode for C. elegans plenunngåelsesanalyse
Summary
Denne artikkelen beskriver en enkel, rimelig metode for å registrere plenen unngåelse atferd av Caenorhabditis elegans, ved hjelp av lett tilgjengelige elementer som en smarttelefon og en lysdiode (LED) lysboks. Vi tilbyr også et Python-skript for å behandle videofilen til et format som er mer egnet for telling.
Abstract
Når den blir utsatt for giftige eller patogene bakterier, viser nematoden Caenorhabditis elegans en lært plenunngåelsesadferd, der ormene gradvis forlater matkilden og foretrekker å forbli utenfor bakterieplenen. Analysen er en enkel måte å teste ormenes evne til å føle eksterne eller interne signaler for å reagere riktig på skadelige forhold. Selv om det er en enkel analyse, er telling tidkrevende, spesielt med flere prøver, og analysevarigheter som spenner over natten er ubeleilig for forskere. Et avbildningssystem som kan avbilde mange plater over en lang periode er nyttig, men kostbart. Her beskriver vi en smarttelefonbasert bildebehandlingsmetode for å registrere plenunngåelse i C. elegans. Metoden krever bare en smarttelefon og en lysdiode (LED) lysboks, for å fungere som en overført lyskilde. Ved hjelp av gratis tidsforkortede kameraprogrammer kan hver telefon vise opptil seks plater, med tilstrekkelig skarphet og kontrast til å telle ormer utenfor plenen manuelt. De resulterende filmene blir behandlet i 10 s audio video interleave (AVI) filer for hvert timetidspunkt, deretter beskåret for å vise hver enkelt plate for å gjøre dem mer mottagelige for telling. Denne metoden er en kostnadseffektiv måte for de som ønsker å undersøke unngåelsesfeil og kan potensielt utvides til andre C. elegans-analyser.
Introduction
Blant de mange fordelene ved å studere C. elegans, tilbyr det enkle nervesystemet muligheten til å studere hvordan endringer på genetisk og cellulært nivå påvirker nettverksfunksjon og atferdsutgang. Til tross for å ha et begrenset antall nevroner, viser C. elegans et bredt spekter av komplekse atferd. En av disse er plenunngåelse, der den bakterielle nematoden reagerer på en skadelig matkilde ved å forlate bakterieplenen. C. elegans unngår plener av patogene bakterier 1,2,3, plener av bakterier som produserer giftstoffer eller er pigget med giftstoffer1,4, og til og med RNAi-uttrykkende bakterier hvis målgenknockdown er skadelig for ormens helse 4,5. Studier har vist at ormer reagerer på eksterne signaler som metabolitter produsert av de patogene bakteriene 1,6, eller interne signaler som indikerer at maten gjør dem syke 4,7. Disse signalene behandles gjennom konserverte signalveier, for eksempel mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) -banen og transformerende vekstfaktor beta (TGFβ) -banen, og krever kommunikasjon mellom tarmen og nervesystemet 4,6,7,8.
Selv om analysen er enkel, utvikler den lærte oppførselen seg over mange timer, ofte over natten. Mens det er mutanter som ikke er i stand til å forlate, i hvilket tilfelle unngåelse av å score på bare ett tidspunkt er tilstrekkelig til å demonstrere feilen, forlater mange mutanter til slutt, men er tregere til å komme ut. For disse må bevegelsen av ormene spores noen få timer, noe som kan være vanskelig å gjøre over natten. Selve tellingen tar også tid, skaper en lagtid mellom platene, og begrenser dermed antall plater som kan testes samtidig. Å bruke et bildebehandlingsoppsett for å registrere mange plater samtidig i hele analysens varighet ville være svært nyttig, men kostnaden for oppsett kan være uoverkommelig, avhengig av finansieringssituasjonen til forskningslaboratoriet.
For å løse dette utviklet vi en veldig enkel metode som bruker smarttelefoner til å registrere unngåelsesanalyser. Hver telefon kan ta opp time-lapse-videoer med opptil seks analyseplater. For å levere overført lys bruker vi en lysdiode (LED) lysboks som enkelt kan kjøpes online. Analyseplater er plassert på en forhøyet plattform, støttet av hule rektangulære tunneler, som fokuserer det innkommende lyset og skaper kontrast. Vi tilbyr også et Python-skript som konverterer videoene til AVI-filer (audio video interleave) som viser 10 s klipp av hvert timetidspunkt. Videoene blir deretter beskåret til individuelle plater og lagret i separate filer for bruk til manuell telling.
Metoden gir en rimelig prosedyre som også er ekstremt enkel å bruke, ved hjelp av varer som er lett tilgjengelige for folk flest. Her beskriver vi metoden ved hjelp av den veletablerte plenunngåelsesanalysen mot det humane patogenet Pseudomonas aeruginosa (PA14), hvis protokoll tidligere er beskrevet 2,9. Til slutt gjennomgår vi også hensynene og begrensningene til bildebehandlingsmetoden for de som ønsker å bruke den på andre C. elegans atferdseksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imaging dyreadferd, i stedet for å stole på direkte observasjon, er ikke bare praktisk, men har også fordelen av å forlate visuell dokumentasjon. Dette muliggjør blind analyse av en objektiv tredje person, eller kan til og med brukes til automatisert analyse ved hjelp av bildegjenkjenningsteknikker. Til tross for fordelene er standardutstyret som vanligvis tilbys høyt i pris, så man er forpliktet til oppsettet når det er kjøpt.
Bruk av smarttelefoner for å samle videoopptak av enkel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Deok Joong Lee for kritisk lesing av manuskriptet og testing av Python-koden. Denne forskningen ble sponset av National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) og 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
