En smartphone-baserad avbildningsmetod för C. elegans Lawn Avoidance Assay
Summary
Den här artikeln beskriver en enkel, billig metod för att registrera beteendet för att undvika gräsmatta hos Caenorhabditis elegans, med hjälp av lättillgängliga föremål som en smartphone och en ljusdiod (LED) ljuslåda. Vi tillhandahåller också ett Python-skript för att bearbeta videofilen till ett format som är mer mottagligt för räkning.
Abstract
När den utsätts för giftiga eller patogena bakterier uppvisar nematoden Caenorhabditis elegans ett inlärt gräsmattundvikande beteende, där maskarna gradvis lämnar sin matkälla och föredrar att stanna utanför bakteriegräsmattan. Analysen är ett enkelt sätt att testa maskarnas förmåga att känna av externa eller interna signaler för att korrekt reagera på skadliga förhållanden. Även om det är en enkel analys är räkningen tidskrävande, särskilt med flera prover, och analyslängder som sträcker sig över natten är obekväma för forskare. Ett bildsystem som kan avbilda många plattor under lång tid är användbart men kostsamt. Här beskriver vi en smartphone-baserad bildmetod för att spela in gräsmatta undvikande i C. elegans. Metoden kräver endast en smartphone och en ljusdiod (LED) ljuslåda för att fungera som en överförd ljuskälla. Med hjälp av gratis time-lapse-kameraapplikationer kan varje telefon avbilda upp till sex plattor, med tillräcklig skärpa och kontrast för att manuellt räkna maskar utanför gräsmattan. De resulterande filmerna bearbetas till 10 s ljudvideointerfolieringsfiler (AVI) för varje timmes tidpunkt och beskärs sedan för att visa varje enskild platta för att göra dem mer mottagliga för räkning. Denna metod är ett kostnadseffektivt sätt för dem som vill undersöka undvikande defekter och kan potentiellt utvidgas till andra C. elegans-analyser.
Introduction
Bland de många fördelarna med att studera C. elegans erbjuder dess enkla nervsystem möjlighet att studera hur förändringar på genetisk och cellulär nivå påverkar nätverksfunktion och beteendeproduktion. Trots att ha ett begränsat antal nervceller, C. elegans visar ett brett spektrum av komplexa beteenden. En av dessa är gräsmatta undvikande, där den bakterivorösa nematoden svarar på en skadlig matkälla genom att lämna bakteriell gräsmatta. C. elegans undviker gräsmattor av patogena bakterier 1,2,3, gräsmattor av bakterier som producerar toxiner eller är spetsade med toxiner 1,4, och till och med RNAi-uttryckande bakterier vars målgenknockdown är skadlig för maskarnas hälsa 4,5. Studier har visat att maskar svarar på externa signaler som metaboliter som produceras av de patogena bakterierna1,6, eller interna signaler som indikerar att maten gör dem sjuka 4,7. Dessa signaler bearbetas genom bevarade signalvägar, såsom mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) -vägen och transformationstillväxtfaktorn beta (TGFβ) -vägen, och kräver kommunikation mellan tarmen och nervsystemet 4,6,7,8.
Även om analysen är enkel utvecklas det inlärda beteendet under många timmar, ofta över natten. Även om det finns mutanter som inte kan lämna, i vilket fall poängundvikande vid bara en tidpunkt är tillräckligt för att visa defekten, lämnar många mutanter så småningom men är långsammare att komma ut. För dessa måste maskarnas rörelse spåras med några timmars mellanrum, vilket kan vara svårt att göra över natten. Att räkna sig själv tar också tid, vilket skapar en fördröjningstid mellan plattorna och begränsar därmed antalet plattor som kan testas samtidigt. Att använda en bildinställning för att spela in många plattor samtidigt under hela analysens varaktighet skulle vara mycket användbart, men kostnaden för installationen kan vara oöverkomlig, beroende på forskningslaboratoriets finansieringssituation.
För att ta itu med detta utformade vi en mycket enkel metod som använder smartphones för att spela in undvikande analyser. Varje telefon kan spela in time-lapse-videor på upp till sex analysplattor. För att tillhandahålla överfört ljus använder vi en ljusdiod (LED) ljuslåda som enkelt kan köpas online. Analysplattor placeras på en upphöjd plattform, som stöds av ihåliga rektangulära tunnlar, som fokuserar det inkommande ljuset och skapar kontrast. Vi tillhandahåller också ett Python-skript som konverterar videorna till AVI-filer (Audio Video Interleave) som visar 10 s-klipp av varje timme. Videorna beskärs sedan till enskilda plattor och sparas i separata filer för manuell räkning.
Metoden ger en billig procedur som också är extremt lätt att använda, med hjälp av objekt som är lättillgängliga för de flesta. Här beskriver vi metoden med hjälp av den väletablerade gräsmatteundvikande analysen mot den humana patogenen Pseudomonas aeruginosa (PA14), vars protokoll tidigare har beskrivits 2,9. Slutligen granskar vi också överväganden och begränsningar av avbildningsmetoden för dem som vill tillämpa den på andra C. elegans beteendeexperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att avbilda djurbeteende, snarare än att förlita sig på direkt observation, är inte bara bekvämt utan har också fördelen att lämna visuell dokumentation. Detta möjliggör blindanalys av en objektiv tredje person, eller kan till och med användas för automatiserad analys med hjälp av bildigenkänningstekniker. Trots fördelarna är standardutrustningen som vanligtvis erbjuds hög i kostnad, så man är engagerad i installationen när den har köpts.
Att använda smartphones för att …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Deok Joong Lee för kritisk läsning av manuskriptet och testning av Python-koden. Denna forskning sponsrades av National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) och 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
