在这里,我们描述了一种微驱动器设计、手术植入程序和术后恢复策略,允许在从出生后第 20 天 (p20) 到出生后第 60 天 (p60) 及以后的关键发育窗口内,同时对幼年和青少年小鼠的多个大脑区域进行慢性野外和单单元记录。
体内 电生理学为完整大脑的亚二级回路动力学提供了无与伦比的洞察力,并且代表了研究人类神经精神疾病的小鼠模型特别重要的方法。然而,这种方法通常需要大的颅骨植入物,这不能在早期发育时间点用于小鼠。因此,几乎没有在行为自由的婴儿或幼年小鼠中进行 体内生理学 研究,尽管在这个关键窗口更好地了解神经系统发育可能会为自闭症或精神分裂症等年龄依赖性发育障碍提供独特的见解。在这里,描述了微驱动器设计,手术植入程序和术后恢复策略,允许在小鼠从出生后第20天(p20)到出生后第60天(p60)及以后同时从多个大脑区域进行慢性野外和单单元记录,该时间窗口大致对应于人类2岁到成年的年龄。记录电极和最终记录位点的数量可以很容易地修改和扩展,从而允许对发育过程中与行为或疾病相关的大脑区域的 体内 监测进行灵活的实验控制。
在儿童和青少年的关键发育窗口期间,大脑经历了大规模的变化1,2,3。许多神经和精神疾病,包括自闭症和精神分裂症,在青少年大脑发育的这一时期首次在行为和生物学上表现出来4,5,6。虽然人们对早期发育过程中发生的细胞、突触和遗传变化知之甚少,但对电路或网络级过程在整个时间窗口内如何变化知之甚少。重要的是,回路水平的大脑功能,最终是复杂行为,记忆和认知的基础,是细胞和突触功能的不可预测的紧急属性7,8,9,10。因此,为了充分理解网络级的大脑功能,有必要在完整的神经回路水平上直接研究神经活动。此外,为了确定大脑活动在整个神经精神疾病进展过程中如何改变,在疾病的行为表型显现的特定时间窗口期间检查有效疾病模型中的网络活动并跟踪观察到的变化持续到成年期至关重要。
最常见和最强大的科学模式生物之一是小鼠,具有大量独特的遗传菌株,可模拟行为和/或助记表型11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21的年龄依赖性神经发育障碍.虽然将人类和小鼠大脑之间的精确发育时间点相关联具有挑战性,但形态学和行为学比较表明,p20-p21小鼠代表2-3岁的人类年龄,p25-p35小鼠代表11-14岁的人类年龄,小鼠可能达到20岁成年人的发育等效p603,22.因此,为了更好地了解青少年大脑如何发育并确定大脑的神经网络如何在自闭症或精神分裂症等疾病中变得功能失调,理想的做法是直接监测20天至60天龄小鼠体内的大脑活动。
然而,监测小鼠早期发育过程中的大脑活动的一个基本挑战是幼年小鼠的小尺寸和相对虚弱。长期植入电极是大脑发育纵向研究所必需的,通常需要大而笨重的外壳来保护细电极线和接口板23,24,并且植入物必须牢固地附着在小鼠头骨上,由于骨化减少,年轻小鼠的头骨更薄,硬度更低。因此,几乎所有体内啮齿动物生理学研究都是在成年受试者中进行的,因为它们的相对大小、强度和头骨厚度。迄今为止,大多数探索体内幼年啮齿动物大脑生理学的研究都是在野生型幼鼠中进行的,这必然限制了在人类疾病自由行为模型中实验监测幼年大脑功能的能力25,26,27,28,29,30。
本手稿描述了新型植入物外壳、外科植入程序和术后恢复策略,以长期研究幼年小鼠在发育关键时间窗口(p20 至 p60 及以后)的长期(长达 4 周或 更长时间)体内 脑功能。植入程序允许将电极可靠,永久地附着在幼年小鼠的头骨上。此外,微型驱动器设计重量轻,因为该微型驱动器在完全组装时重量为~4-6g,并且由于抵消植入物重量所需的最小平衡,它不会影响幼年小鼠在典型行为范式中的行为表现。
探索啮齿动物 体内 神经回路功能的现代实验通常通过永久植入的电极 利用 细胞外电生理学来监测单个神经元(即单个单位)或局部种群(通过 局部场电位,LFP)的活动,但由于技术挑战,这种方法很少应用于幼年小鼠。本手稿描述了一种在p20至p60及以后的发育关键窗口 内获得小鼠 体内电生理记录的方法。该方法涉及用于打印和构建微驱动植入物的制造工艺、外科植入程序和术后恢复策略,所有这些都是专门为幼年小鼠量身定制的。在该协议的开发中有几个考虑因素有影响,包括与成年小鼠相比,幼年小鼠的体积小且相对薄弱,以及需要连接微驱动器的幼年小鼠头骨的骨化减少。
通常用于 进行体内 电生理学的两种主要方法是电极阵列(例如四极管)和硅探针。硅探针重量轻,每单位重量可以提供大量的记录位点,并且以前已在幼鼠中使用25。然而,硅探针的单位价格相对昂贵。相比之下,本手稿中描述的微型驱动器可以使用不到 50 美元的原材料构建,使其成为 体内 记录的一种经济高效的选择。此外,硅探针必须经常植入固定线路中,这禁止记录空间不同的大脑区域。相比之下,本手稿中描述的微型驱动器设计利用可独立调节的四极管来适应多达 16 个不同位置的同时录制,对这些位置之间的空间关系几乎没有限制。这种微驱动器设计可以很容易地修改,通过将套管孔挤压移动到任何所需的前/后和内侧/远端位置,允许针对与此处描述的位置不同的位置。当瞄准不同的大脑区域时,重要的是要注意,虽然四极管通常会直线移动,但这些细线在离开微驱动套管时可能会略微偏转。因此,大脑区域的腹侧越小或越大,成功靶向四极管区域的挑战就越大。
本手稿中描述的微驱动器植入物与先前几种基于四极管的微驱动器设计23,32,33,34,35基本相似,因为单个四极管固定在螺钉上,可以精细控制每个四极管的记录深度。虽然当前微驱动器设计的几个功能是独一无二的,包括易于针对空间分布的大脑区域,但当前手稿的主要新颖之处在于描述了手术植入和术后恢复策略,这允许对仍在发育的幼年小鼠的网络活动进行长期研究。事实上,这里描述的手术和恢复方法可以适用于支持幼年小鼠的其他植入物。
为了在多天内保持一致的记录,电线或探头必须牢固地固定在头骨上。虽然小鼠头骨的整体结构在p20之后只经历了微小的变化,但在p20和p4536之间,头骨明显变厚。事实上,p20处的头骨刚性不足,无法支撑附着的植入物而不会损坏。为了克服这种生物学限制,该方案在植入手术期间通过氰基丙烯酸酯 人为 地增厚颅骨。使用这种策略可能植入小于p20的小鼠中,但是小鼠头骨经历了相当大的大小和形状变化,直到大约p2036。因此,不建议在小于p20的小鼠中长时间植入,因为仍在发育的颅骨中的氰基丙烯酸酯和固定骨螺钉可能会显着影响颅骨的自然生长和潜在的脑组织发育。重要的是,在这项研究中,从p20开始的慢性植入后,没有观察到对颅骨或大脑大小的总体测量值的影响(图5C)。
本手稿中描述的方法中的一个关键步骤是术后恢复策略;根据这种策略,随着小鼠的成熟和肌肉和肌肉骨骼系统的发育,植入物的重量应该不断平衡。植入后早期,小鼠在没有平衡的情况下无法成功承受植入物的重量,导致营养不良和脱水,因为小鼠无法充分到达笼子中的食物和水源。平衡系统易于构建且成本低廉,实施起来很简单,并且允许任何植入年龄的小鼠自由探索整个家笼,从而确保足够的营养和水合作用。随着小鼠年龄的增长,平衡量可以减少,直到可以在成年小鼠中完全去除;但是,建议在实验期间继续使用平衡系统,并始终至少连接一个标称配重。虽然成年小鼠可能能够随着时间的推移承受微型驱动器的大小和重量,但在自由行为期间持续的自然运动,没有改善配重,会在将微型驱动器固定在头骨上的骨螺钉上产生扭矩和剪切力,使其越来越容易脱落,尤其是在较长的慢性实验中。
对于目前的研究来说,有两个重要的局限性值得注意。首先,为了评估p20植入对颅骨和大脑发育的影响,在长时间植入后处死了几组小鼠(图5C)。虽然这些分析显示植入对颅腔大小或脑质量没有显着影响(图5C),但目前的研究没有检查p20-p60早期发育期间多个时间点的颅骨大小或脑质量。虽然先前的工作表明,脑腔的发育在p2036之前完成,但在这个早期窗口植入可能会产生意想不到的变化,这些变化被这里评估的成年人纠正或补偿。其次,产生图3和图4所示电生理数据的实验并非旨在最大限度地提高细胞产量。因此,虽然此处提供的数据显示了稳定、慢性记录和良好隔离的单个单元,但它们不应被视为该设备最大潜在产量的代表。
许多人类神经和精神疾病表现在早期发育期间或青春期,包括自闭症和精神分裂症。然而,尽管有大量的小鼠模型可用,但对可能导致这些疾病的回路水平功能障碍知之甚少。识别这些初始网络变化对于创建早期检测策略和治疗范式至关重要。然而,由于技术挑战,目前尚不清楚网络功能如何在神经精神疾病小鼠模型的开发过程中被破坏。这里描述的微驱动和恢复策略旨在支持对小鼠大脑中多区域大脑网络发育的研究,从而使研究人员能够测量健康的大脑发育,并确定小鼠疾病模型中该发育的改变。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国立卫生研究院R01 NS104829(B.E.P.),R01 MH117149(L.J.V.)和F99NS12053(L.D.Q.)以及UT西南GSO捐赠奖(R.J.P.和L.D.Q.)的支持。作者感谢Jenny Scaria(德克萨斯理工大学健康科学中心药学院)的技术援助和Brendon Watson博士(密歇根大学)的方法建议。
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |