Summary
Aqui, descrevemos um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia que permitem gravações crônicas de campo e unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos jovens e adolescentes através de uma janela crítica de desenvolvimento do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além.
Abstract
A eletrofisiologia in vivo fornece uma visão incomparável sobre a dinâmica de circuitos de sub-segundo nível do cérebro intacto e representa um método de particular importância para o estudo de modelos de camundongos de transtornos neuropsiquiátricos humanos. No entanto, tais métodos geralmente requerem grandes implantes cranianos, que não podem ser usados em camundongos nos primeiros momentos de desenvolvimento. Como tal, praticamente nenhum estudo de fisiologia in vivo foi realizado em camundongos infantis ou juvenis de comportamento livre, apesar do fato de que uma melhor compreensão do desenvolvimento neurológico nessa janela crítica provavelmente forneceria insights únicos sobre transtornos de desenvolvimento dependentes da idade, como autismo ou esquizofrenia. Aqui, um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia são descritos que permitem registros de campo crônico e de unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos à medida que envelhecem do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além, uma janela de tempo aproximadamente correspondente às idades humanas de 2 anos de idade até a idade adulta. O número de eletrodos de gravação e locais de registro final podem ser facilmente modificados e expandidos, permitindo assim um controle experimental flexível do monitoramento in vivo de regiões cerebrais relevantes para o comportamento ou a doença ao longo do desenvolvimento.
Introduction
O cérebro sofre mudanças em larga escala durante as janelas críticas de desenvolvimento da infância e adolescência 1,2,3. Muitas doenças neurológicas e psiquiátricas, incluindo autismo e esquizofrenia, manifestam-se comportamental e biologicamente pela primeira vez durante esse período de desenvolvimento cerebral juvenil e adolescente 4,5,6. Embora muito se saiba sobre as mudanças celulares, sinápticas e genéticas que ocorrem ao longo do desenvolvimento inicial, comparativamente pouco se sabe sobre como os processos em nível de circuito ou rede mudam ao longo dessa janela de tempo. É importante ressaltar que a função cerebral em nível de circuito, que em última análise está subjacente a comportamentos complexos, memória e cognição, é uma propriedade emergente e não previsível da função celular e sináptica 7,8,9,10. Assim, para entender completamente a função cerebral em nível de rede, é necessário estudar diretamente a atividade neural no nível de um circuito neural intacto. Além disso, para identificar como a atividade cerebral é alterada ao longo da progressão dos transtornos neuropsiquiátricos, é fundamental examinar a atividade da rede em um modelo de doença válido durante a janela temporal específica em que os fenótipos comportamentais da doença se manifestam e rastrear as mudanças observadas à medida que persistem na idade adulta.
Um dos organismos modelo científicos mais comuns e poderosos é o camundongo, com grande número de linhagens genéticas únicas que modelam distúrbios do neurodesenvolvimento com início dependente da idade dos fenótipos comportamentais e/ou mnemônicos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Embora seja desafiador correlacionar pontos precisos de tempo de desenvolvimento entre os cérebros de humanos e camundongos, comparações morfológicas e comportamentais indicam que os camundongos p20-p21 representam as idades humanas de 2-3 anos de idade, e os camundongos p25-p35 representam as idades humanas de 11-14 anos, com camundongos provavelmente atingindo o equivalente de desenvolvimento de um adulto humano de 20 anos por p603, 22º. Assim, para entender melhor como o cérebro juvenil se desenvolve e identificar como as redes neurais do cérebro se tornam disfuncionais em doenças como autismo ou esquizofrenia, o ideal seria monitorar diretamente a atividade cerebral in vivo em camundongos com idades entre 20 dias e 60 dias de idade.
No entanto, um desafio fundamental no monitoramento da atividade cerebral ao longo do desenvolvimento inicial em camundongos é o pequeno tamanho e a relativa fraqueza de camundongos juvenis. O implante crônico de eletrodos, necessário para estudos longitudinais do desenvolvimento cerebral, tipicamente requer carcaça grande e volumosa para proteger os fios finos dos eletrodos e as placas de interface23,24, e os implantes devem estar firmemente fixados ao crânio de camundongos, que é mais fino e menos rígido em camundongos jovens devido à reduzida ossificação. Assim, praticamente todos os estudos de fisiologia in vivo de roedores foram realizados em indivíduos adultos devido ao seu tamanho relativo, força e espessura do crânio. Até o momento, a maioria dos estudos explorando a fisiologia do cérebro de roedores juvenis in vivo foi realizada em ratos juvenis selvagens, o que necessariamente limita a capacidade de monitorar experimentalmente a função cerebral juvenil em um modelo de comportamento livre de um distúrbio humano 25,26,27,28,29,30.
Este manuscrito descreve a nova carcaça do implante, um procedimento cirúrgico de implantação e uma estratégia de recuperação pós-cirurgia para estudar cronicamente a função cerebral in vivo a longo prazo (até 4 ou mais semanas) de camundongos juvenis através de uma janela de tempo crítica para o desenvolvimento (p20 a p60 e além). O procedimento de implantação permite a fixação confiável e permanente dos eletrodos nos crânios de camundongos juvenis. Além disso, o design do micro-drive é leve, pois este micro-drive pesa ~4-6 g quando totalmente montado, e devido ao contrabalanceamento mínimo necessário para compensar o peso do implante, ele não afeta o desempenho comportamental de camundongos juvenis durante paradigmas comportamentais típicos.
Protocol
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do University of Texas Southwestern Medical Center (protocolo 2015-100867) e realizado de acordo com as diretrizes institucionais e do National Institute of Health. Os camundongos machos e fêmeas C57/Bl6 utilizados no presente estudo foram implantados no p20 (peso 8,3-11,1 g no momento do implante).
1. Projeto e construção de micro-drives
- Projetando e imprimindo digitalmente o micro-drive (Figura 1)
- Faça o download dos modelos de modelo de microunidade (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
- Identificar os locais estereotáxicos da(s) região(ões) do cérebro-alvo em um atlas estereotáxico apropriado.
- Usando um software de desenho assistido por computador tridimensional (CAD 3D), carregue a cânula de micro-drive do molde (Figura 1B).
- Se necessário, modifique os locais de saída da cânula de saída no modelo da cânula de micro-unidade para atingir a(s) região(ões) cerebral(is) desejada(s).
NOTA: Cada extrusão do orifício da cânula deve ter pelo menos 2 mm de comprimento para garantir que o tetrodo emergirá do orifício da cânula apontando diretamente para o alvo. O molde de cânula de micro-drive é projetado para atingir bilateralmente o córtex cingulado anterior (um tetrodo por hemisfério), a área hipocampal CA1 (quatro tetrodos por hemisfério) e a área hipocampal CA3 (dois tetrodos por hemisfério), com um tetrodo de referência por hemisfério posicionado na substância branca acima da área hipocampal CA1. - Se necessário, modifique o corpo da microunidade (Figura 1A) para acomodar a fixação da placa de interface eletrônica (BEI).
- Imprima o corpo da microunidade, a cânula, o cone e a tampa em alta resolução em uma impressora 3D (idealmente com resolução superior a 25 μm) e prepare os materiais impressos de acordo com os protocolos do fabricante. Utilize resinas para impressoras com alta rigidez.
- Montagem dos parafusos e acessórios personalizados (Figura 2A, B)
- Usando o software CAD 3D, carregue os modelos de fixação do parafuso (Figura 1E).
- Imprima os acessórios de parafuso em alta resolução em uma impressora 3D (idealmente com uma resolução de pelo menos 25 μm) e prepare os materiais impressos de acordo com os protocolos do fabricante. Utilize resinas para impressoras com alta rigidez.
- Afixe os acessórios de parafuso em cada parafuso de avanço de tetrodo (Figura 1F) (os parafusos de avanço de tetrodo são fabricados sob medida em uma oficina de máquinas antes da construção do micro-acionamento).
- Afixar dois parafusos em cada parafuso, sendo um acima e outro abaixo da crista. Certifique-se de que a parte inferior de cada fixação do parafuso entre em contato com a crista. Segure os acessórios do parafuso juntamente com cianoacrilato de gel.
- Uma vez afixados, certifique-se de que os acessórios do parafuso não se movam no eixo longitudinal do parafuso, mas girem livremente com o mínimo de resistência.
- Montagem do corpo do micro-acionamento (Figura 2C, D)
- Usando tesouras finas e afiadas, corte grandes tubos de poliimida (diâmetro externo: 0,2921 mm, diâmetro interno: 0,1803 mm) em seções de ~6 cm de comprimento.
- Passe as grandes seções de poliimida através dos orifícios de saída na cânula de micro-acionamento de modo que cada tubo se estenda além do fundo da cânula por alguns milímetros.
- Usando uma agulha limpa de 30 G, afixe a poliimida na cânula aplicando pequenas quantidades de cianoacrilato líquido. Tome cuidado para não permitir que o cianoacrilato entre no interior do tubo de poliimida.
NOTA: O gotejamento de cianoacrilato líquido na cânula através da parte superior do corpo da unidade pode acelerar esse processo, mas exigirá a limpeza dos orifícios de guia novamente mais tarde com uma broca de ponta fina. - Passe os grandes tubos de poliimida da parte superior da cânula de micro-acionamento através dos grandes orifícios de poliimida apropriados no corpo da micro-unidade.
- Empurre lentamente a cânula da micro-unidade e o corpo da micro-unidade juntos até que fiquem adjacentes e as abas de fixação da cânula/corpo se intertravem. Tenha cuidado para não torcer ou danificar os tubos de poliimida no processo.
NOTA: Cada tubo de poliimida deve passar suavemente da parte inferior da cânula para fora através da parte superior do corpo da micro-unidade. Uma ligeira flexão é normal, mas a flexão excessiva do tubo de poliimida pode deformar o tetrodo e impedir que ele passe direto para o cérebro. - Afixar o corpo do micro-acionamento e a cânula do micro-acionamento juntos usando cianoacrilato.
- Usando uma lâmina de barbear nova e afiada, corte as grandes extremidades do tubo de poliimida que estão extrudindo do fundo dos orifícios de saída da cânula. Certifique-se de que o corte esteja exatamente na base da cânula, fazendo com que os tubos e o fundo da cânula fiquem nivelados um com o outro.
- Usando uma tesoura afiada, corte a grande tubulação de poliimida logo acima da borda da borda interna do corpo da unidade em um ângulo de ~45°.
- Carregando os parafusos personalizados montados (Figura 2E)
- Rosqueie cada parafuso personalizado montado nos orifícios externos do corpo da micro-unidade. Certifique-se de que o poste de guia do parafuso passe através do grande orifício nos acessórios do parafuso. Avançar cada parafuso totalmente até que ele não avance mais. Recomenda-se pré-lubrificar os parafusos com óleo mineral ou graxa de eixo.
- Usando tesouras extremamente afiadas, corte pequenos tubos de poliimida (diâmetro externo: 0,1397 mm, diâmetro interno: 0,1016) em seções de ~4 cm de comprimento.
- Passe as pequenas seções de poliimida através da grande tubulação de poliimida já montada no micro-drive. Certifique-se de que o excesso de tubos de poliimida pequenos se projeta da parte superior e inferior de cada tubo de poliimida grande.
- Afixar os pequenos tubos de poliimida nos acessórios de parafuso através de cianoacrilato, tomando cuidado para não deixar nenhum cianoacrilato entrar nos tubos de poliimida grandes ou pequenos.
- Usando uma lâmina de barbear nova e afiada, corte as pequenas extremidades do tubo de poliimida que estão extrudindo do fundo dos orifícios da cânula. Certifique-se de que o corte esteja exatamente na base da cânula e que o corte esteja limpo, sem que nada bloqueie o orifício do tubo de poliimida.
- Usando uma tesoura afiada, corte a parte superior da pequena poliimida alguns milímetros acima da parte superior do acessório do parafuso em um ângulo de ~45°. Certifique-se de que o corte está limpo, sem nada bloqueando o orifício do tubo de poliimida.
- Carregando os tetrodos
- Preparar os tetrodos (~6 cm de comprimento) usando métodos descritos anteriormente31.
- Usando pinças com ponta de cerâmica ou borracha, passe cuidadosamente um tetrodo através de um dos pequenos tubos de poliimida, deixando ~2 cm salientes do topo do pequeno tubo de poliimida.
- Afixar o tetrodo no topo do pequeno tubo de poliimida através de cianoacrilato líquido, tomando cuidado para não afixar os pequenos e grandes tubos de poliimida juntos no processo.
- Retraia o parafuso até que ele esteja perto da parte superior da unidade.
- Pegue o fio de tetrodo que se projeta da parte inferior da unidade e torça-o suavemente no ponto em que ele emerge da cânula.
- Avanço o parafuso totalmente de volta para a unidade.
- Usando uma tesoura muito afiada, corte o fio de tetrodo logo acima da dobra. Sob um microscópio, certifique-se de que o corte está limpo e que o metal de todos os quatro tetrodos está exposto.
- Retraia o parafuso até que o tetrodo esteja apenas preso dentro da cânula.
- Repita as etapas 1.5.2-1.5.8 para todos os parafusos.
- Anexar o BEI à plataforma de apoio do BEI através de pequenos parafusos de joalharia.
- Ligar cada eléctrodo de cada tetrodo à porta apropriada no BEI.
- Preparando o micro-drive para cirurgia
- Plaquear eletricamente os tetrodos para reduzir a impedância elétrica utilizando métodos previamente descritos31.
- Após o chapeamento, certifique-se de que cada tetrodo esteja alojado na cânula de modo que a ponta do tetrodo esteja nivelada com o fundo de cada orifício da cânula.
- Deslize o cone da microunidade ao redor da microunidade concluída. Conecte a tampa do microacionamento ao cone do microacionamento deslizando o poste de fixação do cone para a porta da tampa.
- Orientar o cone de modo que os conectores EIB passem livremente pelos orifícios de passagem da conexão EIB quando a tampa estiver fechada e cole o cone no lugar com cianoacrilato colocado ao redor da base do cone, tomando cuidado para não deixar nenhum cianoacrilato entrar em nenhum dos orifícios de saída da cânula. Retire a tampa.
- Encha cuidadosamente cada orifício da cânula com óleo mineral estéril para evitar que fluidos corporais entrem nos orifícios de poliimida após o implante cirúrgico.
- Revestir cuidadosamente a base da cânula com vaselina estéril. Isso servirá como uma barreira para impedir que agentes químicos (por exemplo, cimento dentário) entrem no cérebro exposto durante a cirurgia.
- Pese o micro-acionamento, a tampa e os quatro parafusos ósseos totalmente montados para preparar um contrapeso de peso igual.
- Opcionalmente, antes da cirurgia, extrudir os tetrodos a uma distância que seja apropriada para alcançar as regiões cerebrais alvo, uma vez que a unidade está nivelada com o crânio.
NOTA: Antes do implante cirúrgico, esterilizar o implante através da esterilização a gás em óxido de etileno (500-1200 mg/L, 2-4 horas). Todos os parafusos ósseos e instrumentais cirúrgicos devem ser esterilizados em autoclave (121°C, 30 minutos).
2. Implante cirúrgico
- Anestesiar o mouse e montá-lo no aparelho estereotáxico
- Coloque o rato numa pequena caixa com espaço suficiente para se mover e anestesiar o rato com isoflurano a 3%-4%.
NOTA: Outros agentes anestésicos podem ser usados, mas deve-se ter cautela devido à idade, tamanho e peso do camundongo juvenil. - Uma vez que o mouse não responde (nenhuma resposta ao aperto da cauda, uma taxa de ventilação de ~60 respirações por minuto), remova-o da caixa e monte-o rapidamente no aparelho estereotáxico.
- Rapidamente, coloque a máscara estereotáxica sobre o focinho do rato e mantenha a anestesia a 1-3% de isoflurano. Aplicar qualquer alívio da dor aprovado por veterinários, como buprenorfina de liberação sustentada (0,05-0,5 mg/kg subcutâneo), ou agentes anti-inflamatórios, como carprofeno (5-10 mg/kg subcutâneo), antes da incisão cirúrgica inicial.
- Fixe totalmente a cabeça do rato no aparelho estereotáxico utilizando barras auriculares. Certifique-se de que o crânio está nivelado e imóvel sem colocar pressão desnecessária nos canais auditivos do rato. Devido à ossificação limitada dos ossos juvenis do crânio, é possível causar danos permanentes durante a fixação da cabeça.
- Coloque o rato numa pequena caixa com espaço suficiente para se mover e anestesiar o rato com isoflurano a 3%-4%.
- Preparando o mouse para a cirurgia e expondo o crânio
- Proteja os olhos do rato colocando um pequeno volume de gel lacrimal sintético em cada olho e cobrindo cada olho com um adesivo autoclavado de papel alumínio.
NOTA: As lágrimas sintéticas manterão os olhos úmidos, enquanto a folha impedirá que qualquer fonte de luz cause danos a longo prazo. Soluções lacrimais sintéticas mais espessas são preferidas, pois também podem servir como uma barreira para a introdução inadvertida de outras soluções cirúrgicas potencialmente tóxicas (etanol, acrílico dental, etc.) nos olhos. - Usando cotonetes estéreis, aplique creme depilatório sobre a área cirúrgica para remover os pelos do couro cabeludo. Tenha cuidado para não colocar o creme perto dos olhos. Depois de remover os cabelos, coloque um pano estéril sobre o couro cabeludo para fixar a área cirúrgica.
- Com swabs estéreis com ponta de algodão, limpar o couro cabeludo através de três lavagens consecutivas de solução de iodopovidona (10%) seguida de álcool isopropílico (100%).
- Usando um bisturi estéril ou tesoura fina, remova o couro cabeludo.
- Usando swabs estéreis com ponta de algodão e soluções estéreis de solução salina (NaCl 0,9%) e peróxido de hidrogênio, limpe completamente o crânio.
- Identificar bregma e, usando o aparelho estereotáxico, marcar cuidadosamente os locais de gravação do alvo no crânio com um marcador permanente.
- Proteja os olhos do rato colocando um pequeno volume de gel lacrimal sintético em cada olho e cobrindo cada olho com um adesivo autoclavado de papel alumínio.
- Abertura do orifício da cânula e fixação das âncoras ósseas
- Remova o crânio que sobrepõe os locais de gravação. # Devido à magreza do crânio nesta idade, corte o crânio com uma lâmina de bisturi; Isso elimina a necessidade de usar uma broca, que pode danificar a dura-máter subjacente. Manter a dura-máter exposta com a aplicação de solução salina estéril (NaCl 0,9%) ou óleo mineral estéril. Não remova ou puncione a dura-máter nesta fase, pois ela é suficientemente fina em camundongos juvenis para que os tetrodos passem em etapas futuras.
- Faça cuidadosamente furos piloto para quatro parafusos ósseos.
- Coloque os parafusos ósseos nas porções laterais e rostral ou caudais extremas do crânio, onde o osso é mais espesso e os parafusos ósseos estão suficientemente distantes do implante de micro-drive. Para os parafusos ósseos, use parafusos de joias finas e estéreis (por exemplo, rosca UNM 120, cabeça de 1,5 mm).
- Enrole firmemente um parafuso ósseo com um fio fino e altamente condutor que servirá de terra e será fixado ao BEI no passo 2.4.6.
- Usando uma lâmina de bisturi ou cuidadosamente usando uma broca, marque o crânio perto dos locais do orifício do parafuso ósseo. A pontuação é importante para fornecer uma superfície suficientemente rugosa para que o cianoacrilato líquido se ligue na etapa 2.3.5.
- Usando uma chave de fenda estéril e uma braçadeira de parafuso estéril, rosqueie cada parafuso ósseo estéril no lugar, tomando cuidado para não perfurar a dura-máter subjacente.
- Usando uma agulha estéril de 30 G, coloque cianoacrilato líquido ao redor de cada parafuso ósseo. Isso efetivamente engrossa o crânio onde os parafusos ósseos foram fixados. Tome cuidado para não permitir que qualquer cianoacrilato entre na dura-máter exposta acima dos locais de gravação.
- Abaixando e conectando o micro-drive (Figura 2G)
- Monte o micro-drive completo no aparelho estereotáxico para ser cuidadosamente baixado no crânio do rato. Certifique-se de que a cânula de micro-acionamento estará nas coordenadas apropriadas quando baixada.
- Abaixe o micro-drive lentamente, movendo-se apenas no sentido dorsal/ventral. Abaixe o micro-drive com os tetrodos já avançados para fora dos orifícios da cânula (passo 1.6.6) para visualizar sua entrada no cérebro; Qualquer movimento medial/lateral ou rostral/caudal quando os tetrodos estão tocando o mouse pode dobrar os tetrodos e fazer com que eles percam seu destino final.
- Uma vez que o micro-drive esteja totalmente abaixado, certifique-se de que a base da cânula apenas faça contato com o crânio/dura. A camada de vaselina e/ou óleo mineral servirá como barreira para cobrir a dura-máter exposta. Se necessário, adicione vaselina estéril ou cera de osso estéril para cobrir o excesso de dura-máter exposta.
- Enquanto mantém o micro-drive no lugar com o aparelho estereotáxico, revestir o crânio em cimento dental para fixar a base do micro-drive nos parafusos ósseos implantados.
OBS: O cimento dental deve envolver totalmente todos os parafusos ósseos e deve cobrir a borda de ancoragem de cimento dental na cânula de micro-drive. - Enquanto o cimento dental se fixa, molde-o cuidadosamente para evitar cantos ou bordas afiadas que possam danificar o mouse ou danificar o micro-drive. Certifique-se de que há cimento dentário suficiente para segurar o micro-drive, mas elimine o excesso de cimento dentário que adicionará peso desnecessário.
- Rosqueie cuidadosamente o fio terra através do micro-drive e fixe-o ao slot apropriado no BEI.
- Uma vez que o cimento dentário esteja totalmente fixado, desprenda cuidadosamente o micro-drive do aparelho estereotáxico. Coloque a tampa no micro-drive.
- Com um cotonete estéril com ponta de algodão e soro fisiológico estéril, limpe o rato.
- Com um cotonete estéril com ponta de algodão, aplique uma fina camada de pomada antibiótica em qualquer couro cabeludo exposto perto do local do implante.
- Retire o papel alumínio dos olhos do rato.
- Remova o rato do aparelho estereotáxico, tendo o cuidado de suportar o peso adicional da micro-unidade à medida que o rato é transportado para uma gaiola limpa.
3. Recuperação pós-operatória
- Recuperação imediata
- Antes da cirurgia, preparar o sistema de contrapeso conectando um tubo de PVC de 0,75 de diâmetro, como mostra a Figura 2G. Um braço do sistema passa por orifícios perfurados na tampa da gaiola, o segundo braço repousa em cima da tampa da gaiola e o terceiro braço se estende acima e além da gaiola. O braço mais alto está tampado.
- Fixe cuidadosamente o micro-drive ao sistema de contrapeso (Figura 2G-I) e use um peso de contrapeso idêntico ao peso do micro-drive e dos parafusos ósseos. Execute uma linha de pesca ou rosca forte de um conector ligado ao BEI sobre os três braços do sistema de contrapeso até o peso de contrapeso, que pende sobre o braço superior.
- Certifique-se de que o contrapeso está fortemente ligado ao BEI de micro-unidade e de que existe uma linha suficiente para dar ao rato acesso completo à totalidade da gaiola.
- Forneça gel rico em nutrientes na gaiola ao lado de ração normal umedecida para roedores para garantir a reidratação e recuperação.
- Monitore o mouse até que ele se recupere totalmente da anestesia cirúrgica.
- Recuperação a longo prazo
- Em todos os momentos, quando não estiver ligado ao aparelho de controlo, certifique-se de que o micro-acionamento é suportado pelo sistema de contrapeso. Reduza o contrapeso ao longo do tempo, mas nunca o remova totalmente para evitar estresse imprevisto para o mouse ou torque para os parafusos ósseos.
- Para evitar danos ao implante e ao sistema de contrapeso, alojar o camundongo sem a possibilidade de interação direta com outros camundongos durante o experimento.
- Forneça gel rico em nutrientes por pelo menos 3 dias após a cirurgia, quando apenas alimentos sólidos serão suficientes.
- Devido aos requisitos de sobrecarga do sistema de contrapeso, não forneça comida e água em uma malha de arame aéreo; Coloque o alimento no chão da gaiola e forneça água através do lado da gaiola. Para evitar a deterioração, substitua os alimentos inteiramente diariamente.
- Diariamente, certifique-se de que o mouse tenha livre acesso à totalidade da gaiola e que o contrapeso esteja robusta e fortemente ligado ao micro-drive.
Representative Results
O protocolo descrito acima foi usado para registrar sinais potenciais de campo local e unidades únicas de múltiplas áreas cerebrais simultaneamente em camundongos, com registros diários realizados nos mesmos camundongos de p20 a p60. Aqui são relatados registros eletrofisiológicos representativos de dois camundongos e histologia pós-experimento demonstrando os locais finais de registro.
Implantação cirúrgica do micro-drive em camundongos p20
Um micro-drive (Figura 1) foi construído (Figura 2) e implantado cirurgicamente em um camundongo p20, conforme descrito acima. Imediatamente após a cirurgia, o camundongo foi acoplado ao sistema de contrapeso (Figura 2G-I) e permitiu a recuperação. Uma vez que o mouse estava totalmente móvel, o micro-drive foi conectado a um sistema de gravação de eletrofisiologia in vivo. Os cabos que conectavam o micro-drive ao aparelho de gravação foram suspensos acima do mouse. Registros eletrofisiológicos (32 kHz) foram obtidos em todos os canais por 1 h enquanto o camundongo se comportava naturalmente em sua gaiola de origem. Após a gravação, o mouse foi desconectado do sistema de gravação, reconectado ao sistema de contrapeso e devolvido ao biotério com livre acesso à água e ração.
Registro diário da atividade neural
Registros eletrofisiológicos foram obtidos diariamente por várias semanas para permitir o monitoramento crônico da mesma região cerebral através das janelas críticas de desenvolvimento de p20-p60. Amostras de potenciais de campo local brutos (LFP) de todos os registros crônicos são mostradas na Figura 3A,C. Unidades isoladas foram obtidas simultaneamente a partir de múltiplos tetrodos (Figura 3B). Unidades com formas de onda semelhantes foram identificadas ao longo de vários dias (Figura 3B, meio e direita), mas devido à deriva potencial do eletrodo de registro, não foi possível afirmar definitivamente que a mesma unidade estava sendo identificada ao longo dos dias. Em um camundongo separado implantado em p20 e registrado diariamente por várias semanas, a atividade neural foi examinada em um tetrodo visando a área dorsal CA1. Ondulações de grande amplitude e unidades isoladas bem isoladas foram identificadas em cada dia de registro (Figura 4). Esses dados indicam que registros eletrofisiológicos in vivo estáveis e de alta qualidade podem ser do mesmo camundongo durante o desenvolvimento inicial.
Confirmação histológica dos locais de registro e o impacto do implante crônico no desenvolvimento
Após o último dia de registro, o camundongo foi completamente anestesiado por meio de anestesia com isoflurano, seguido de uma injeção letal de pentobarbital sódico, e uma corrente foi passada através das pontas dos eletrodos para produzir pequenas lesões nos locais de registro. O corte histológico pós-experimento do cérebro de camundongos permitiu a visualização dos locais finais de registro (Figura 5A,B). Em uma coorte separada, três camundongos machos e três fêmeas foram implantados cirurgicamente em p20, conforme descrito acima. Igual número de ninhadas não foi implantado e mantido em idênticas condições de alojamento. Os camundongos foram sacrificados em p62 (6 semanas pós-cirurgia para a coorte implantada). Os crânios foram cuidadosamente limpos, e foram realizadas medidas externas da distância bregma-lambda (Figura 5C, canto superior esquerdo) e da largura máxima externa do crânio no lambda (Figura 5C, canto superior direito). Uma incisão foi feita ao longo da linha média do crânio, e metade do crânio foi removida para exérese do cérebro para medida de massa (Figura 5C, canto inferior direito). A altura da cavidade craniana no bregma foi medida a partir da metade do crânio intacto (Figura 5C, canto inferior esquerdo). Nenhuma medida foi significativamente diferente entre as coortes implantadas e não implantadas (teste da soma de postos de Wilcoxon), indicando que o implante a longo prazo, a partir de p20, não tem impacto macroscópico no desenvolvimento natural do crânio ou volume cerebral.
Figura 1: Componentes da microunidade. Renderizações tridimensionais do (A) corpo de micro-acionamento, (B) cânula, (C) cone, (D) tampa, (E) acessórios de parafuso e (F) parafuso de avanço de tetrodo. As características críticas de cada componente são indicadas. Os detalhes da medição podem ser extraídos dos arquivos de modelo disponíveis em https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Construção do micro-drive . (A) Vista lateral e (B) superior do parafuso de avanço do tetrodo com os acessórios de parafuso superior e inferior conectados. (C) Vista lateral e (D) superior do micro-acionamento com o corpo e a cânula acoplados e o grande tubo de poliimida atravessando cada orifício da cânula e aparado até o fundo da cânula. (E) Vista lateral do micro-acionamento com os parafusos e pequenos tubos de poliimida no lugar. Os topos dos pequenos tubos de poliimida são aparados imediatamente antes do carregamento do tetrodo. (F) Micro-drive completo acoplado ao aparelho estereotáxico. O cone de proteção que normalmente cercaria a microunidade foi removido para fins de visualização. Observe que alguns dos acessórios de parafuso foram impressos em uma resina preta para este micro-drive. (G) Sistema de apoio ao contrapeso. (H) Vista lateral e (I) superior de uma gaiola do mouse com o sistema de suporte de contrapeso conectado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Registros eletrofisiológicos representativos. Um camundongo p20 foi implantado com um micro-drive como descrito acima. A partir de p21 e, posteriormente, todos os dias durante 2 semanas, o camundongo foi conectado ao aparelho de registro, e a atividade neural foi registrada por pelo menos 1 h. (A) Registros de potencial de campo local bruto (LFP) do bilateral (L = esquerda; R = direita) córtex cingulado anterior (ACC), área hipocampal CA3 (CA3) e área hipocampal CA1 (CA1). Os dados foram coletados diariamente; Para maior clareza, apenas dados de dias ímpares são exibidos. Todos os vestígios foram feitos durante os períodos de imobilidade na gaiola domiciliar. Barra de escala: 1 mV, 2 s. (B) Unidades individuais representativas isoladas da área hipocampal CA3 (esquerda) e CA1 (direita) para os registros no painel A. Todas as formas de onda brutas em cada eletrodo são mostradas em preto; a média está em vermelho. Barra de escala: 50 μV, 0,2 ms. (C) Traços representativos de LFP bruto para cada 10º dia até o último dia de registro em p60 para um segundo camundongo implantado em p20. Os dados foram coletados diariamente; Para maior clareza, apenas os dados de cada 10º dia são exibidos. Todos os vestígios foram feitos durante os períodos de imobilidade na gaiola domiciliar. Barra de escala: 1 mV, 2 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Estabilidade dos registros crônicos. Um camundongo p20 foi implantado com um micro-drive, como descrito acima. A partir de p21 e, posteriormente, por 4 semanas, o camundongo foi acoplado ao aparelho de registro, e a atividade neural foi registrada por pelo menos 1 h. São mostrados dados dos tetrodos visando o CA1 do hipocampo dorsal. (A) LFP bruto (superior) e filtrado por ondulação (inferior) para eventos de ondulação identificados em p21, p30 e p40. Para identificar eventos de ripple, o LFP bruto foi filtrado passa-banda entre 125 Hz e 300 Hz, e os eventos de ripple foram identificados como aumentos transitórios na potência da banda ripple maiores que 3 desvios padrão acima da média. O início e o fim de cada ondulação foram definidos como o ponto em que a potência da banda de ondulação retornou à média. As ondulações identificadas são mostradas em vermelho. Barra de escala: 100 ms, de cima para baixo: 1.000 μV, 140 μV, 1.800 μV, 180 μV, 9.000 μV, 1.200 μV, 10.000 μV, 1.000 μV. (B) Uma única unidade representativa de cada dia do tetrodo alvo CA1 para as gravações no painel A. Todas as formas de onda brutas em cada eletrodo são mostradas em preto; a média está em vermelho. Barra de escala 0,2 ms, de cima para baixo: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) Autocorrelograma de todas as pontas para unidades individuais no painel B. Esses dados demonstram a colocação estável de eletrodos dentro da camada piramidal hipocampal ao longo de várias semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Histologia representativa e impacto no desenvolvimento craniano. Um camundongo p20 foi implantado com um micro-drive, como descrito acima. Após o último dia de registro em p60, lesões eletrolíticas foram produzidas nos locais de registro, e o cérebro foi perfundido com paraformaldeído a 4%. Para identificar os locais de registro, cortes de 50 μm foram produzidos. (A) Lesões em CA1 e CA3 do hipocampo. A ponta de seta indica o local de registro do CA3; a ponta de seta dupla indica o local de gravação CA1. Barra de escala: 0,5 mm. (B) Lesões no CAC bilateral. As pontas de seta indicam os locais de gravação do ACC. Barra de escala: 0,5 mm. (C) Medidas do tamanho do crânio e da massa cerebral de camundongos p62 implantados com um micro-drive em p20 (cinza) e ninhadas não implantadas (branco). O valor de p do teste da soma de postos de Wilcoxon é relatado para cada medida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Experimentos modernos explorando a função de circuitos neurais in vivo em roedores frequentemente utilizam eletrofisiologia extracelular via eletrodos permanentemente implantados para monitorar a atividade de neurônios individuais (ou seja, unidades únicas) ou populações locais (via potenciais de campo locais, LFP), mas tais métodos raramente são aplicados a camundongos juvenis devido a desafios técnicos. Este manuscrito descreve um método para obter registros eletrofisiológicos in vivo em camundongos através das janelas críticas de desenvolvimento de p20 a p60 e além. Essa metodologia envolve um processo de fabricação para a impressão e construção de um implante de micro-drive, um procedimento de implante cirúrgico e uma estratégia de recuperação pós-cirurgia, todos adaptados especificamente para uso em camundongos juvenis. Várias considerações foram influentes no desenvolvimento deste protocolo, incluindo o pequeno tamanho e a fraqueza relativa de camundongos juvenis em comparação com seus homólogos adultos, bem como a ossificação reduzida do crânio de camundongos juvenis no qual a micro-unidade precisava ser anexada.
Dois métodos primários comumente usados para realizar eletrofisiologia in vivo são arranjos de eletrodos (por exemplo, tetrodos) e sondas de silício. Sondas de silicone são leves, podem fornecer um grande número de locais de registro por unidade de peso e foram previamente utilizadas em ratos juvenis25. No entanto, as sondas de silício são relativamente caras por unidade. Em contraste, o micro-drive descrito neste manuscrito pode ser construído usando menos de US$ 50 em matérias-primas, tornando-se uma opção econômica para gravação in vivo . Além disso, as sondas de silicone muitas vezes devem ser implantadas em linhas fixas, o que proíbe o registro de regiões cerebrais espacialmente diversas. Em contraste, o projeto de micro-drive descrito neste manuscrito utiliza tetrodos ajustáveis independentemente para acomodar gravações simultâneas em até 16 locais diferentes, praticamente sem restrição na relação espacial entre esses locais. Este projeto de micro-acionamento pode ser facilmente modificado para permitir o direcionamento de locais diferentes daqueles descritos aqui, movendo as extrusões do orifício da cânula para qualquer localização anterior/posterior e medial/distal desejada. Ao visar áreas cerebrais alternativas, é importante notar que, embora os tetrodos muitas vezes viajem retos, é possível que esses fios finos se desviem ligeiramente à medida que saem da cânula de micro-unidade. Assim, quanto menor ou mais ventral for uma região cerebral, mais desafiador será atingir com sucesso a área com tetrodos.
O implante de micro-drive descrito neste manuscrito é fundamentalmente semelhante a vários projetos anteriores de micro-drive baseados em tetrodo 23,32,33,34,35 em que os tetrodos individuais são afixados em parafusos, que permitem o controle fino da profundidade de registro de cada tetrodo. Embora várias características do projeto atual do micro-drive sejam únicas, incluindo a facilidade de segmentar áreas cerebrais espacialmente distribuídas, a principal novidade do presente manuscrito é a descrição do implante cirúrgico e das estratégias de recuperação pós-cirurgia, que permitem estudos crônicos da atividade da rede em camundongos juvenis ainda em desenvolvimento. De fato, as metodologias de cirurgia e recuperação aqui descritas poderiam ser adaptadas para suportar outros implantes em camundongos jovens.
Para manter um registro consistente ao longo de vários dias, os fios ou sondas devem ser fixados rigidamente no crânio. Enquanto a estrutura geral do crânio de camundongos sofre apenas pequenas alterações após p20, o crânio engrossa consideravelmente entre as idades p20 e p4536. De fato, o crânio em p20 é insuficientemente rígido para suportar um implante anexado sem ser danificado. Para superar essa limitação biológica, este protocolo engrossa artificialmente o crânio via cianoacrilato durante a cirurgia de implante. A implantação em camundongos com menos de p20 é provavelmente possível usando essa estratégia, mas o crânio de camundongos sofre mudanças consideráveis de tamanho e forma até aproximadamente p2036. Assim, o implante por longos períodos em camundongos com menos de p20 não é recomendado, pois o cianoacrilato e os parafusos ósseos fixos no crânio ainda em desenvolvimento podem afetar significativamente o crescimento natural do crânio e o desenvolvimento do tecido cerebral subjacente. É importante ressaltar que, neste estudo, não foi observado impacto nas medidas macroscópicas do crânio ou do tamanho do cérebro após o implante crônico a partir de p20 (Figura 5C).
Uma etapa crítica no método descrito neste manuscrito é a estratégia de recuperação pós-operatória; De acordo com essa estratégia, o peso do implante deve ser continuamente contrabalançado à medida que o camundongo amadurece e sofre desenvolvimento muscular e do sistema musculoesquelético. No início após o implante, os camundongos são incapazes de suportar com sucesso o peso do implante sem o contrapeso, levando à desnutrição e desidratação, já que o camundongo não consegue alcançar adequadamente as fontes de alimento e água em sua gaiola. O sistema de contrapeso é fácil e barato de construir, trivial de implementar, e permite que ratos de qualquer idade implantável explorem livremente toda a sua gaiola doméstica, garantindo assim nutrição e hidratação adequadas. À medida que os ratos envelhecem, a quantidade de contrapeso pode ser diminuída até que possa ser totalmente removida em camundongos adultos; no entanto, recomenda-se o uso contínuo do sistema de contrapeso durante a duração do experimento, com pelo menos um contrapeso nominal ligado em todos os momentos. Enquanto um camundongo adulto pode ser capaz de suportar o tamanho e o peso da microunidade ao longo do tempo, o movimento natural contínuo durante o comportamento livre sem contrapeso de melhora produz torque e força de cisalhamento nos parafusos ósseos que ancoram a microunidade no crânio, tornando-a cada vez mais propensa a se desprender, especialmente durante experimentos crônicos mais longos.
Duas limitações importantes são dignas de nota para o presente estudo. Primeiro, para avaliar o impacto do implante em p20 no desenvolvimento do crânio e do cérebro, várias coortes de camundongos foram sacrificadas após implante prolongado (Figura 5C). Embora essas análises não tenham revelado impacto significativo do implante no tamanho da cavidade craniana ou na massa cerebral (Figura 5C), o presente estudo não examinou o tamanho do crânio ou a massa cerebral em vários momentos ao longo do período inicial de desenvolvimento de p20-p60. Embora trabalhos anteriores demonstrem que o desenvolvimento da cavidade cerebral se completa até p2036, é possível que a implantação nessa janela inicial possa produzir mudanças inesperadas que são corrigidas ou compensadas pelas idades adultas aqui avaliadas. Em segundo lugar, os experimentos que produziram os dados eletrofisiológicos mostrados na Figura 3 e na Figura 4 não foram projetados para maximizar o rendimento celular. Assim, embora os dados aqui apresentados demonstrem registros estáveis, crônicos e unidades isoladas bem isoladas, eles não devem ser tomados como representativos do rendimento potencial máximo para esse dispositivo.
Muitos transtornos neurológicos e psiquiátricos humanos se manifestam durante períodos de desenvolvimento precoce ou ao longo da adolescência, incluindo autismo e esquizofrenia. No entanto, pouco se sabe sobre a disfunção em nível de circuito que pode estar subjacente a essas doenças, apesar da infinidade de modelos de camundongos disponíveis. A identificação dessas mudanças iniciais na rede é fundamental para a criação de estratégias de detecção precoce e paradigmas de tratamento. No entanto, devido a desafios técnicos, ainda não está claro como a função da rede é interrompida em todo o desenvolvimento em modelos de camundongos de doenças neuropsiquiátricas. A estratégia de micro-drive e recuperação descrita aqui é projetada para apoiar investigações sobre o desenvolvimento de redes cerebrais multirregionais no cérebro de camundongos e, assim, permitir que os pesquisadores meçam o desenvolvimento cerebral saudável, bem como identifiquem alterações nesse desenvolvimento em modelos de doença em camundongos.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) e F99NS12053 (L.D.Q.) e pelo UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. e L.D.Q.). Os autores agradecem a Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy) pela assistência técnica e ao Dr. Brendon Watson (University of Michigan) pelas sugestões metodológicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
| 16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
| 16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
| Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
| Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
| Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
| Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
| Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
| Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
| Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
| Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
| Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
| DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
| Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
| Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
| Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
| Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
| Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
| Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
| Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
| EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
| EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
| Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
| Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
| Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
| Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
| Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
| Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
| Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
| Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
| Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
| Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
| Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
| Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
| Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
| High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
| Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
| Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
| Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
| LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
| Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
| Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
| Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
| Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
| Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
| Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
| Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
| Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
| Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
| Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
| Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
| Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
| Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
| Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
| PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
| Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
| Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
| Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
| Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
| Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
| SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
| Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
| Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
| Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
| Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
| Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
| Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
| Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
| Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
| Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |
References
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